Name: Radioativo In situ Hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Aprenda a realizar hibridização in situ radioativa para detectar padrões de expressão gênica em tecidos de vertebrados. Este método permite identificar transcritos de baixa abundância e processar múltiplas amostras simultaneamente.

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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros Jarvis laboratório que melhoraram o protocolo ao longo dos anos.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Radioactivos hibridação in situ da expressão do mRNA é amplamente utilizado para fins múltiplos, incluindo para estudar organização do tecido regional, tipos de células, e actividade funcional do cérebro 2-5,10,12-14. O uso mais tarde está em genes cuja expressão de mRNA no cérebro é dependente da atividade neural maior, muitas vezes chamado de atividade dependentes de genes ou genes imediatos iniciais. Com estas utilizações, o nosso método foi aplicado em várias espécies múltiplas, incluindo, em aves, mamíferos (por exemplo, humanos), peixes e anfíbios; em múltiplos tecidos, incluindo o cérebro, pele, músculo e; e idades múltiplas, incluindo hatchlings / recém-nascidos, juvenis , os adultos, e aqui em seções inteiras de embriões 2,3,5,15-17. As características especiais do nosso protocolo incluem: (1) Ela produz um equilíbrio entre a especificidade anatômica e especificidade quantitativa. Para quantificar a expressão gênica no filme de raios-x, tiramos fotos digitais das imagens (ex:. Figura 1A e 1B), use o Photoshop função de histograma (Adobe) para medir a densidade de pixels nas regiões de interesse e subtrair os níveis de fundo sobre o filme exterior do tecido, mas ainda na lâmina de vidro 2,4. Para quantificar a expressão a nível celular, tomamos imagens de grãos de prata sobre as células sob ampliação elevada (40-100X; Fig. 4). Em seguida, usamos o limiar e medindo funções de J Imagem por Wayne Rasband no NIH para contar o número de grãos de prata na imagem, subtrair a contagem de fundo em uma área similar sem células sobre a lâmina de vidro, dividir pelo número de células, para obter um valor de expressão por célula. 4,18 (2) Pode ser rendimento relativamente elevado, permitindo o processamento de 100-200 lâminas simultaneamente, devido à vedação lamela apertado criado pelo banho de óleo mineral. Métodos padrão de hibridização in-situ demorar mais tempo para selar as lâminas com parafilme, unha polonês, e outros meios, onde lâminas ocupam muito espaço, (3) É altamentesensível para as transcrições baixa abundância devido ao sulfato de dextrano e solução de Denhardt no tampão de hibridação 2,13, (4) A abordagem de imagem em campo escuro produz imagens de alto contraste devido a fotografar sob iluminação de campo escuro sobre um microscópio de dissecação 4,5. Além disso, permite a detecção sensível de pequenas alterações na expressão do gene, tais como na actividade dependente da expressão do gene para identificar regiões específicas do cérebro activadas durante a percepção e produção de comportamentos específicos 19. As limitações em relação ao não-radioactivos protocolos são que estas últimas são mais clara na resolução celular e da localização do mRNA no interior da célula, e trabalhando com a emulsão é muito sensível à manipulação e da luz. É possível combinar o nosso método com outros métodos, tais como não radioactivo em hibridização in situ para rótulo de expressão de mRNA de mais de um gene no mesmo tecido 10,17,20. Ele pode ser combinado com imunocitoquímicapara rotular RNA e expressão da proteína sobre a mesma amostra, a fim de co-localizar o ARNm com certos tipos de células 10. As modificações protocolo necessário para tais experiências dupla marcação são descritas nas referências citadas. Em resumo, a nossa abordagem facilita a compreensão do tempo e localização celular da expressão do gene, a fim de entender organização região, a atividade do tecido funcional e da função do gene.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Anidrido acético </td><td> VWR </td><td> MK242002 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> VWR </td><td> BDH1109 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de cresil violeta </td><td> Sigma </td><td> C5042 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific </td><td> Microm HM550 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida deionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Promega </td><td> P1171 </td><td> 100mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED </td><td></td></tr><tr><td> Incorporação de molde </td><td> VWR </td><td> 15160-215 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher marca Superfrost mais slides </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-034-979 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> VWR </td><td> BDH0506-4LP </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Sigma </td><td> F7508 </td><td></td></tr><tr><td> GENECLEAN kit </td><td> Q-Bio gene </td><td> 1001-200 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak BioMax MR filme </td><td> Sigma </td><td> Z350370 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak NTB Emulsão </td><td> A Carestream Health </td><td> 8895666 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak Professional desenvolvedor D19 </td><td> Câmera fotográfica </td><td> 1462593 </td><td></td></tr><tr><td> Kodak profissional Fixer </td><td> Câmera fotográfica </td><td> 1971746 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> VWR </td><td> IC15169491 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> VWR </td><td> SX0600-1 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> 76240 </td><td></td></tr><tr><td> Poli A </td><td> Invitrogen </td><td> POLYA.GF </td><td></td></tr><tr><td> rATP </td><td> Promega </td><td> P1132 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RCTP </td><td> Promega </td><td> P1142 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> rGTP </td><td> Promega </td><td> P1152 </td><td> 10mM </td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td> 40Units/μl </td></tr><tr><td> S 35 UTP </td><td> PerkinElmer </td><td> NEG039C001MC </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Solve solução </td><td> Segurança Resolva Research Products International </td><td> 111177 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S7899 </td><td> 3M </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico </td><td> Sigma </td><td> S3139 </td><td></td></tr><tr><td> SP6RNA polimerase </td><td> Promega </td><td> P1085 </td><td></td></tr><tr><td> Coloração prateleira de metal </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70312-54 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase </td><td> Promega </td><td> P2075 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek outubro </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Transcrição tampão 5x </td><td> Promega </td><td> P1181 </td><td></td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> VWR </td><td> IC15216391 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCl (1 M, pH 8,0) </td><td> VWR </td><td> 101449-446 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Roche </td><td> 10109509001 </td><td></td></tr></tbody></table> Soluções: <ol><li> Reagentes para fazer de riboprobes: 1,5 modelo DNA ul (0,2-0,3 mg / mL), 2 ul de tampão de transcrição 5x otimizado, 1 ml de DTT 100mM (vem com Polimerase de Promega, mixbem à temperatura ambiente), 0,3 ul de RNasin (40 unidades / uL), 1,5 ul de solução de AGC mistura ribonucleótido, 3,5 ul de S 35 UTP, e uma polimerase de ARN uL. Traga até 10 ul com nuclease livre de água. </li><li> AGC solução mix ribonucleotídeo: misture quantidades iguais de 10 mM ATP, GTP e CTP juntos. </li><li> Solução de acetato de sódio para EtOH precipitação para remover 35 S livre UTP: 40 ul de ARNase e ADNase água livre, 5 ul de acetato de sódio 3M, e 125 uL de EtOH a 100%. </li><li> Tampão de hibridação (10 mL de stock): 5 ml de 100% de formamida desionizada, 600 ul de NaCl 5M, 1M Tris-HCl (pH = 8,0), 240 ul de EDTA 0,5 M (pH = 8,0), 100 uL de solução de Denhart 100x, o 100 ul de 1M de DTT, 250 uL de 20mg/ml tRNA, 125 uL de 20 mg / ml de poli A, e 1 g de sulfato de sódio dextrano. Adicionar DEPC tratada com água para levar o volume total para 10 ml. Agita-se vigorosamente e depois incubar a 55 ° C até que todo o sulfato de sódio dextrano é dissolvido. Armazenar o tampão de hibridação em-20 ° C, que é bom para ~ 6 meses. </li><li> 4% tamponado solução de paraformaldeído: Adicionar 40 g de paraformaldeído em 760 ml de água destilada em um balão de designado para paraformaldeído, o calor a 50 ° C sobre uma placa quente com agitação. Adicionar 320 uL de NaOH 10N para ajudar a dissolver o paraformaldeído. Depois de se dissolver (~ 10 min), adicionar 100 ml de PBS 10x, e trazer o volume com água destilada até 1 litro. Agita-se e aquecer a solução até paraformaldeído é dissolvido. O pH deve ser de 7,4. </li><li> Tampão de acetilação: 13,6 ml de trietanolamina, mais 2,52 ml de anidrido acético em 1 litro de água destilada. </li><li> 20x SSPE solução: 3M NaCl, 200 mM de NaH 2 PO 4-H2O, e 200 mM de EDTA em água destilada. Ajuste a solução para pH 7,4 com NaOH 10N. </li><li> 10x tampão PBS: 80g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, e 2,4 g de KH PO 2 4 em água destilada. Ajuste a solução a pH 7,0 e trazer o volume total a 1 Liter. </li><li> Solução de lavagem segundo: 0,1% β-mercaptoetanol e formamida a 50% em 2x SSPE </li><li> Solução de acetato de cresilo violeta: acetato de violeta de cresilo 3% em água da torneira (água destilada impede coloração bom), dissolvido durante a noite, com agitação num balão à temperatura ambiente. Filtrar por sucção a vácuo através de um Whatman 1 milímetro filtro de papel e um funil de Buchner. </li></ol>

radioativo in situ hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Sabendo o tempo, o nível, a localização celular, e tipo de célula que um gene é expresso em contribui para a nossa compreensão da função do gene. Cada uma destas características pode ser realizado com a hibridização in situ para mRNAs dentro das células. Aqui apresentamos uma radioativo no método de hibridização in situ modificado de Clayton et al. (1988) 1 que tem trabalhado com sucesso em nosso laboratório por muitos anos, especialmente para adultos cérebros vertebrados 2-5. Os longos complementares de RNA (cRNA) sondas com a sequência alvo permite a detecção de transcritos baixa abundância 6,7. Incorporação de nucleótidos radioactivos para as sondas crna permite ainda mais a sensibilidade de detecção de transcritos baixa abundância e análises quantitativas, quer pela luz filme de raios-X sensível ou emulsão revestido sobre o tecido. Estes métodos de detecção de fornecer um registo de longo prazo da expressão do gene alvo. Em comparação com os não-radioativo sonda methODS, tais como DIG-rotulagem, o método de hibridação da sonda radioactiva não requer passos de amplificação múltiplas usando HRP-anticorpos e / ou TSA kit para detectar transcritos baixa abundância. Portanto, este método proporciona uma relação linear entre a intensidade do sinal e quantidades de mRNA-alvo para a análise quantitativa. Ele permite o processamento simultâneo 100-200 lâminas. Ele funciona bem para diferentes estágios de desenvolvimento de embriões. A maioria dos estudos de desenvolvimento de expressão do gene utilizar embriões inteiros e não radioactivos abordagens 8,9, em parte porque o tecido embrionário é mais frágil do tecido adulto, com menos de coesão entre as células, tornando-a difícil de ver os limites entre as populações de células com secções de tecido. Em contraste, a nossa abordagem radioactivos, devido à maior gama de sensibilidade, é capaz de obter maior contraste na resolução da expressão do gene entre as regiões de tecido, tornando-o mais fácil de ver os limites entre as populações. Usando este método, os pesquisadores poderiam revelar apossível significado de um gene recentemente identificado, e ainda prever a função do gene de interesse.

Este protocolo é usado com sucesso para detectar quantitativamente os níveis e padrões espaciais de expressão de mRNA em vários tipos de tecido em todas as espécies de vertebrados. O método pode detectar transcritos baixa abundância e permite o tratamento de centenas de lâminas simultaneamente. Apresentamos este protocolo com perfil de expressão de formação cérebro das aves embrionárias como um exemplo.

Radioativo In situ Hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos

Conhecer o momento, o nível, a localização celular e o tipo celular em que um gene é expresso contribui para a nossa compreensão da função do gene. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar regiões de expressão gênica específica e caracterizar o momento e os níveis de expressão gênica para contribuir para a compreensão da função gênica. Isso é alcançado coletando e preparando rapidamente o tecido a ser usado no procedimento, preservando a integridade do tecido. Como segundo passo, o tecido é tratado para reduzir a ligação de fundo das sondas ribonucleicas.Em seguida, os sondas de RNA são hibridizadas ao tecido e a ligação da sonda RIBA é visualizada. Utilizando filme de raios X ou emulsão sensível à luz, obtêm-se resultados que mostram a localização e o nível de expressão gênica com base em imagens de raios X ou em microscopia de campo claro e escuro e análise. Utilizando o software Image J, existem várias etapas críticas que devem ser bem realizadas e nas quais muitas pessoas cometem erros, sendo uma delas a prevenção do fundo não específico.Portanto, há várias etapas que podem gerar ruído de fundo, como uma hibridização inadequada ou a realização da hibridização na temperatura incorreta. Outro fator é a contaminação por RNAses, que degradará sua sonda de RNA. Por isso, é necessário ter cuidado para manter tudo livre de RNAses.E o terceiro ponto é que, ao mergulhar as lâminas na emulsão, é necessário garantir que não haja vazamentos de luz na sua câmara escura ou exposição da emulsão durante todas as etapas desse processo, o que pode durar até três semanas. Para demonstrar esta técnica, teremos Hun Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Após coletar um cérebro fresco e lavá-lo em PBS 1x, incorpore o cérebro em meio OCT Tissue-Tek® imergindo o cérebro em um molde contendo o meio à temperatura ambiente.Certifique-se de que o cérebro está orientado conforme necessário para o corte. Em seguida, após pulverizar o gelo seco com etanol, congele o tecido colocando o bloco na mistura de etanol e gelo seco. Tendo cuidado para não deixar o etanol penetrar no bloco, corte o tecido congelado em seções de 10 a 12 mícrons de espessura utilizando um criostato e monte-as em lâminas super plus para tecido cerebral e embrionário.A melhor temperatura de corte está na faixa de menos 18 graus Celsius a menos 20 graus Celsius. Armazene as seções em uma caixa de lâminas a menos 80 graus Celsius. Transfira as lâminas do armazenamento a menos 80 graus Celsius para uma grade metálica sobre gelo seco.Em seguida, trabalhando em uma capela de exaustão certificada, coloque a grade em uma solução de paraformaldeído 4% previamente aquecida a três a cinco graus Celsius acima da temperatura ambiente. Incube por cinco minutos à temperatura ambiente; após a incubação, remova a grade do paraformaldeído e lave as lâminas mergulhando a grade em PBS 15 vezes. Repita este passo de lavagem duas vezes, utilizando sempre solução fresca de PBS a cada vez.Em seguida, imergir as lâminas em tampão de acetilação recém-preparado durante 10 minutos para reduzir a ligação não específica da sonda RIBA. Após isso, lavar as lâminas como anteriormente, mas desta vez utilizando SSPE duas vezes como solução de lavagem. Desidratar o tecido por meio de uma série de etanol a 70, 95 e 100%, permanecendo duas minutos em cada solução.Em seguida, seque as lâminas na capela por pelo menos 10 a 15 minutos. Após sintetizar a sonda RIBA, de acordo com as instruções no protocolo escrito, calcule o volume necessário da sonda RIBA e da solução de hibridização exigido para todas as lâminas. Pré-aqueça a mistura de hibridização da sonda Ribo a 65 graus Celsius por cinco minutos.Para desnaturar a sonda Ribo, pipete 100 microlitros da solução de hibridização da sonda Ribo e alinhe sobre a lamínula. Em seguida, use uma segunda lamínula de vidro para espalhar a solução uniformemente sobre o tecido e a lamínula. Coloque a lâmina na posição horizontal e voltada para cima em um suporte metálico e, quando todas as lâminas estiverem prontas, mergulhe lentamente o suporte em um banho-maria a 65 graus Celsius por um mínimo de quatro horas e um máximo de 16 horas.O óleo cria um selo hermético ao redor das lamínulas após a incubação. Remova qualquer excesso de óleo do suporte metálico contendo as lâminas. Em seguida, coloque o suporte em uma bandeja de vidro ou metal contendo clorofórmio em uma câmara de fluxo. Repita a lavagem com uma segunda bandeja contendo clorofórmio fresco.Em seguida, mergulhe o suporte em uma solução de 0,1% de beta me cap em etanol mais SSPE 2X para soltar as lamínulas e dissolver a solução de hibridização em excesso. Em seguida, transfira as lâminas para uma segunda solução fresca de 0,1% de beta me cap em etanol mais SSPE 2X. Transfira as lâminas descobertas para um suporte novo em uma bandeja contendo 0,1% de beta macca em etanol em SSPE 2X, incubando esta solução por uma hora à temperatura ambiente para remover a sonda de RNA marcado em excesso não ligado.Em seguida, transfira a bandeja de lâminas para uma solução pré-aquecida de SSPE 2x com 50% de formamida a 65 graus Celsius contendo beta-ME (captoetanol) em concentração final de 0,1% e incube a 65 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, descarte esta e todas as soluções aquosas anteriores de lavagem, bem como as lamínulas, como resíduo radioativo. A seguir, lave as lâminas duas vezes com SSPE 0,1x pré-aquecido a 65 graus Celsius, por 30 minutos cada.Em seguida, desidrate o tecido por meio de uma série de etanol a 70%, 95% e 100%, permanecendo duas minutos em cada solução. Por fim, seque as lâminas em uma capela por pelo menos 30 minutos. Primeiro, para determinar se um sinal radioativo está presente no tecido.Coloque as lâminas secas em uma cassete para filme, trabalhando em um ambiente escuro com luz segura, e posicione o filme radiográfico sobre as lâminas. Certifique-se de que as lâminas estejam voltadas para o lado da emulsão do filme e, em seguida, feche a cassete. Exponha as lâminas ao filme por um a sete dias, dependendo da abundância esperada dos transcritos.Após a conclusão da exposição, desenvolva o filme de raios X em revelador e fixador padrão. O sinal de hibridização aparecerá como áreas escuras no filme, resultantes de grãos de prata expostos na emulsão, próximos a determinar a resolução celular e para observar o sinal no próprio tecido. As lâminas são mergulhadas em emulsão fotográfica e, em seguida, contracoradas.Se as lâminas devem ser contracoradas com violeta de genciana, então as seções devem ser desparafinizadas de acordo com as instruções no protocolo escrito. Neste momento, trabalhando no escuro, despeje água destilada em um tubo. Retire a emulsão NTB uc e dilua a emulsão com água destilada na proporção de um para um.Após derreter a emulsão em banho-maria a 42 graus Celsius por 20 a 30 minutos, transfira-a para um recipiente de vidro para imersão mantido em banho-maria a 42 graus Celsius por 20 a 30 minutos. O nível da emulsão diluída deve agora cobrir todas as seções de uma lâmina quando esta for mergulhada nela. Se houver um grande número de lâminas, pode ser necessário emulsão adicional.Agora mergulhe as lâminas na emulsão diluída em um banho-maria a 42 graus Celsius e, em seguida, seque as lâminas mergulhadas em um recipiente fechado, à prova de luz, durante a noite, no escuro, ou em uma estufa a 37 graus Celsius por duas a três horas com as luzes apagadas. Após a secagem, transfira as lâminas para uma caixa de lâminas. Sobreponha as bordas com fita isolante preta e depois cubra com papel alumínio.Armazene as lâminas a quatro graus Celsius por vários dias a semanas até o momento do revelamento; aqueça as lâminas à temperatura ambiente. Em seguida, trabalhando no escuro, retire o suporte contendo as lâminas das caixas e revele-as no revelador codec D 19 a 16 graus Celsius por três a cinco minutos. A seguir, lave as lâminas reveladas em água da torneira à temperatura ambiente por um minuto.Em seguida, incubar as lâminas duas vezes em solução fixadora a 19 graus Celsius por seis minutos cada; as luzes do ambiente podem ser acesas durante a segunda incubação com o fixador. Agora, lavar as lâminas em água corrente à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear, raspar a emulsão do verso da lâmina enquanto ainda estiver úmida.Por fim, contra-estaine com violeta de cristal a 0,3%, depois desidrate e monte as lâminas de acordo com as instruções no protocolo escrito, se necessário. Remova ainda qualquer emulsão em excesso na parte traseira das lâminas umedecendo com água e raspando com uma lâmina de barbear. Enxágue as lâminas em solução de etanol a 80% e limpe uma a duas vezes suavemente para se livrar de detritos e poeira.Tire imagens sob iluminação em campo escuro ou campo claro. Os passos de raspagem e limpeza podem precisar ser repetidos duas a três vezes para obter boas imagens sem partículas de poeira, que são facilmente visíveis em campo escuro ao microscópio estereoscópico. As imagens a seguir são exemplos de autorradiografia de hibridização in situ provenientes de filmes de raios X.Esta imagem de filme de raios X mostra uma seção sagital de toda a cabeça do pássaro canoro zebra no dia embrionário 10, hibridizada com uma sonda ribonucleotídica antissenso para Fox P1. Os grãos pretos expostos no filme indicam a expressão de RNA mensageiro, que pode ser observada dentro dos quatro locais cerebrais; o RNA mensageiro de Fox P1 está enriquecido no mesoalium striatum e no tálamo dorsal aqui. A imagem de filme de raios X mostra uma seção do mesmo pássaro canoro zebra que foi hibridizada com a sonda RIBA de 90 centavos para Cuper.TF dois Co.TF dois é enriquecido na região do palatum alium e do tálamo mais ventral. As imagens a seguir são exemplos de auto-radiografia de hibridização in situ obtidas a partir de lâminas submetidas ao mergulho em emulsão. Esta imagem de campo escuro, obtida com microscópio estereoscópico, mostra uma seção sagital de cabeça inteira de um tentilhão-zebra no sexto dia após a eclosão, que foi hibridizada com uma sonda RIBA antissenso para Fox P um.Os grãos de prata brancos expostos na emulsão acima do tecido indicam a expressão do RNA mensageiro. A cor vermelha representa a coloração com violeta de cresila. A barra de escala representa um milímetro.Aqui, a imagem mostra uma seção do mesmo pássaro canoro, o tentilhão-zebra, hibridizado com uma sonda de riboprova antissenso para o fator de transcrição Coop TF dois. As imagens seguintes comparam a marcação antissenso e sessenso, que revelam padrões diferentes nesta auto-radiografia em filmes de raios X de cortes sagitais da cabeça de tentilhão-zebra no dia embrionário 12. A linha tracejada indica o contorno de todo o cérebro e a letra C marca o cerebelo.Pode-se observar que a fita antissenso do PAC seis é expressa no cérebro, especialmente na zona ventricular. Esta seção adjacente hibridizada com a fita senso do PAC seis não revela expressão de fundo em toda a cabeça do embrião, mas expressão aparente na camada de pigmento da retina, tal como ocorre com a fita antissenso. As imagens a seguir mostram, em C, dois sinais de expressão gênica e lâminas mergulhadas em emulsão obtidas do cérebro de tentilhão-zebra durante estágios embrionários tardios, vistas em campo claro e campo escuro.Esta imagem em contraste de campo claro mostra a expressão de D one B no dia embrionário 10. A partir de uma exposição normal à emulsão, o marcador que aparece preto mal pode ser visto nesta ampliação. Esta imagem mostra uma seção idêntica e a mesma ampliação da imagem anterior, mas com a visualização em campo escuro, revelando marcação em branco no estriado e no tálamo.Esta imagem de campo claro mostra a expressão do gene slit três no dia embrionário 12. Após uma superexposição à emulsão, o marcador preto pode ser facilmente visualizado. SC marca a posição da medula espinhal e CB marca a posição do cerebelo.A região rostral está orientada para a esquerda. A imagem mostrada aqui corresponde à mesma seção, com aumento idêntico, apenas alterada para a visão em campo escuro, mostrando marcação em branco na medula espinhal que corresponde à imagem em campo claro. As imagens a seguir mostram a resolução dos grãos de prata ao nível celular.É mostrado aqui o marcador do RNA mensageiro Fox P1 no prosencéfalo do tentilhão-zebra; os grãos de prata aparecem como pontos pretos acima das células coradas com violeta cristal. Esta imagem mostra expressão de alta abundância sobre células individuais no mesoálio do tentilhão-zebra adulto. Esta imagem mostra expressão de baixa abundância sobre células individuais no álomo adjacente da mesma seção aqui.Olá Fox. A expressão do mensageiro P um de RNA ao longo das células é observada no mesentério do dia embrionário 12.As células embrionárias vistas aqui são menores e mais densamente empacotadas em comparação com as células adultas vistas nas duas imagens anteriores. Por fim, esta imagem mostra expressão de baixa abundância nas células do alium adjacente da mesma seção. Após seguir este procedimento, outros métodos, como imunoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como em qual tipo celular o gene-alvo é expresso.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a hibridização in situ. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como proteções pessoais, devem ser sempre tomadas durante este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

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Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Nós descrevemos um monte de todo o processo de hibridação in situ multi-alvo cromogénico (MC-DESEJO) em embriões de Drosophila intactas permitindo a detecção simultânea e específica de três padrões de distribuição mRNA diferentes, contrastando precipitados de cor.

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

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Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

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Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

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Aprenda a realizar hibridização in situ radioativa para detectar padrões de expressão gênica em tecidos de vertebrados. Este método permite identificar transcritos de baixa abundância e processar múltiplas amostras simultaneamente.

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