Radioativo In situ Hibridação para detecção de padrões de expressão dos genes nos tecidos diversos

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar regiões de expressão gênica específica e caracterizar o momento e os níveis de expressão gênica para contribuir para a compreensão da função gênica. Isso é alcançado coletando e preparando rapidamente o tecido a ser usado no procedimento, preservando a integridade do tecido. Como segundo passo, o tecido é tratado para reduzir a ligação de fundo das sondas ribonucleicas.

Em seguida, os sondas de RNA são hibridizadas ao tecido e a ligação da sonda RIBA é visualizada. O uso de filme de raios X ou emulsão sensível à luz fornece resultados que mostram a localização e o nível de expressão gênica com base em imagens de raios X ou em microscopia de campo claro e escuro e análise. Utilizando o software Image J, existem várias etapas críticas que devem ser bem realizadas e que muitas pessoas erram, sendo uma delas a prevenção do fundo não específico.

Portanto, existem várias etapas que podem gerar ruído de fundo, como uma fixação inadequada ou a hibridização em temperatura incorreta. Outro fator é a contaminação por RNAses, que degradará seu sonda de RNA. Assim, é necessário ter cuidado para manter tudo livre de RNAses.

E o terceiro ponto é que, ao mergulhar as lâminas na emulsão, é necessário garantir que não haja vazamentos de luz no seu quarto escuro durante toda a exposição da emulsão em todas as etapas desse processo, o qual pode durar até três semanas. Para demonstrar esta técnica, teremos Hun Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Após coletar um cérebro fresco e lavá-lo em PBS 1x, incorpore o cérebro em meio OCT Tissue-Tek® imergindo o cérebro em um molde contendo o meio à temperatura ambiente.

Certifique-se de que o cérebro está orientado conforme necessário para o corte. Em seguida, após pulverizar o gelo seco com etanol, congele o tecido colocando o bloco na mistura de etanol e gelo seco. Tendo cuidado para não deixar o etanol entrar dentro do bloco, corte o tecido congelado em seções de 10 a 12 mícrons de espessura utilizando um criostato e monte-as em lâminas super plus para tecido cerebral e embrionário.

A melhor temperatura de corte está na faixa de menos 18 graus Celsius a menos 20 graus Celsius. Armazene as seções em uma caixa de lâminas a menos 80 graus Celsius. Transfira as lâminas do armazenamento a menos 80 graus Celsius para uma grade metálica sobre gelo seco.

Em seguida, trabalhando em uma capela de exaustão certificada, coloque a grade em uma solução de paraformaldeído 4% previamente aquecida a três a cinco graus Celsius acima da temperatura ambiente. Incube por cinco minutos à temperatura ambiente; após a incubação, remova a grade do paraformaldeído e lave as lâminas mergulhando a grade em PBS 15 vezes. Repita este passo de lavagem duas vezes, utilizando sempre solução fresca de PBS a cada vez.

Em seguida, imergir as lâminas em tampão de acetilação recém-preparado durante 10 minutos para reduzir a ligação não específica da sonda RIBA. Após isso, lavar as lâminas como anteriormente, mas desta vez utilizando SSPE duas vezes como solução de lavagem. Desidratar o tecido por meio de uma série de etanol a 70, 95 e 100%, permanecendo duas minutos em cada solução.

Em seguida, seque as lâminas na câmara de fluxo laminar por pelo menos 10 a 15 minutos. Após sintetizar a sonda RIBA, de acordo com as instruções no protocolo escrito, calcule o volume necessário da sonda RIBA e da solução de hibridização exigido para todas as lâminas. Pré-aqueça a mistura de hibridização da sonda Ribo a 65 graus Celsius por cinco minutos.

Para desnaturar a sonda Ribo, pipete 100 microlitros da solução de hibridização da sonda Ribo e alinhe sobre a lamínula. Em seguida, use uma segunda lamínula de vidro para espalhar a solução uniformemente sobre o tecido e a lamínula. Coloque a lâmina na posição horizontal e voltada para cima em um suporte metálico e, quando todas as lâminas estiverem prontas, mergulhe lentamente o suporte em um banho-maria a 65 graus Celsius por um mínimo de quatro horas e um máximo de 16 horas.

O óleo cria um selo hermético ao redor das lamínulas após a incubação, removendo qualquer excesso de óleo da grade metálica que contém as lâminas. Em seguida, coloque a grade em uma bandeja de vidro ou metal contendo clorofórmio em uma câmara de exaustão. Repita a lavagem com uma segunda bandeja contendo clorofórmio fresco.

Em seguida, mergulhe o suporte em solução de 0,1% beta me cap em etanol mais SSPE 2× para soltar as lamínulas e dissolver o excesso de solução de hibridização. Em seguida, transfira as lâminas para uma segunda solução fresca de 0,1% beta me cap em etanol mais SSPE 2×. Transfira as lâminas descobertas para um suporte novo em uma bandeja contendo 0,1% beta macca em etanol com SSPE 2×, incubando esta solução por uma hora à temperatura ambiente para remover o excesso de sonda de RNA não ligado.

Em seguida, transfira a bandeja de lâminas para uma solução pré-aquecida de SSPE 2x com 50% de formamida a 65 graus Celsius contendo beta-ME (captoetanol) em concentração final de 0,1% e incube a 65 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, descarte esta e todas as soluções aquosas anteriores de lavagem, bem como as lamínulas, como resíduo radioativo. A seguir, lave as lâminas duas vezes em SSPE 0,1x pré-aquecido a 65 graus Celsius, por 30 minutos cada.

Em seguida, desidrate o tecido por meio de uma série de etanol a 70%, 95% e 100%, mantendo dois minutos em cada solução. Por fim, seque as lâminas em uma capela por pelo menos 30 minutos. Primeiro, para determinar se um sinal radioativo está presente no tecido.

Coloque as lâminas secas em uma cassete para filme, trabalhando em um ambiente escuro com luz segura, e posicione o filme radiográfico sobre as lâminas. Certifique-se de que as lâminas estejam voltadas para o lado da emulsão do filme e, em seguida, feche a cassete. Exponha as lâminas ao filme por um a sete dias, dependendo da abundância esperada dos transcritos.

Após a conclusão da exposição, desenvolva o filme de raios X em revelador e fixador padrão. O sinal de hibridização aparecerá como áreas escuras no filme, resultantes de grãos de prata expostos na emulsão, próximos para determinar a resolução celular e para observar o sinal no próprio tecido. As lâminas são mergulhadas em emulsão fotográfica e, em seguida, contracoradas.

Se as lâminas devem ser contracoradas com violeta de genciana, então as seções devem ser desparafinizadas de acordo com as instruções no protocolo escrito. Neste momento, trabalhando no escuro, despeje água destilada em um tubo. Retire a emulsão NTB uc e dilua a emulsão com água destilada na proporção de um para um.

Após derreter a emulsão em banho-maria a 42 graus Celsius por 20 a 30 minutos, transfira-a para um recipiente de vidro para imersão mantido em banho-maria a 42 graus Celsius por 20 a 30 minutos. O nível da emulsão diluída deve agora cobrir todas as seções de uma lâmina quando esta for mergulhada nela. Se houver um grande número de lâminas, pode ser necessário emulsão adicional.

Agora mergulhe as lâminas na emulsão diluída em um banho-maria a 42 graus Celsius e, em seguida, seque as lâminas mergulhadas em um recipiente fechado, à prova de luz, durante a noite, no escuro, ou em uma estufa a 37 graus Celsius por duas a três horas com as luzes apagadas. Após a secagem, transfira as lâminas para uma caixa de lâminas. Sobreponha as bordas com fita isolante preta e depois cubra com papel alumínio.

Guarde as caixas a quatro graus Celsius por vários dias a semanas até o momento de revelar; aqueça as lâminas à temperatura ambiente. Em seguida, trabalhando em câmara escura, remova a grade que contém as lâminas das caixas e revele-as no revelador codec D 19 a 16 graus Celsius por três a cinco minutos. A seguir, lave as lâminas reveladas em água da torneira à temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, incubar as lâminas duas vezes em solução fixadora a 19 graus Celsius por seis minutos cada; as luzes do ambiente podem ser acesas durante a segunda incubação com o fixador. Agora, lavar as lâminas em água corrente à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear, raspar a emulsão do verso da lâmina enquanto ainda estiver úmida.

Por fim, contra-estaine com violeta de cristal a 0,3%, depois desidrate e monte as lâminas de acordo com as instruções no protocolo escrito, se necessário. Remova ainda qualquer emulsão em excesso na parte traseira das lâminas umedecendo com água e raspando com uma lâmina de barbear. Enxágue as lâminas em solução de etanol a 80% e limpe uma a duas vezes suavemente para se livrar de detritos e poeira.

Tire imagens sob iluminação em campo escuro ou campo claro. Os passos de raspagem e limpeza podem precisar ser repetidos duas a três vezes para obter boas imagens sem partículas de poeira, que são facilmente visíveis em campo escuro ao microscópio estereoscópico. As imagens a seguir são exemplos de autorradiografia de hibridização in situ obtidas a partir de filmes de raios X.

Esta imagem de filme de raios X mostra uma seção sagital de toda a cabeça do pássaro canoro zebra no dia embrionário 10, hibridizada com uma sonda ribonucleotídica antissenso para Fox P1. Os grãos pretos expostos no filme indicam a expressão de RNA mensageiro, que pode ser observada dentro dos quatro locais cerebrais; o RNA mensageiro de Fox P1 está enriquecido no mesoalium striatum e no tálamo dorsal aqui. A imagem de filme de raios X mostra uma seção do mesmo pássaro canoro zebra que foi hibridizada com a sonda RIBA de 90 centavos para Cuper.

TF dois Co.TF dois é enriquecido na região do palatum alium e do tálamo mais ventral. As imagens a seguir são exemplos de auto-radiografia de hibridização in situ obtidas a partir de lâminas submersas em emulsão. Esta imagem de campo escuro, obtida com microscópio estereoscópico, mostra uma seção sagital de toda a cabeça de um tentilhão-zebra no sexto dia após a eclosão, que foi hibridizada com uma sonda RIBA antissenso para Fox P um.

Os grãos de prata brancos expostos na emulsão acima do tecido indicam a expressão de RNA mensageiro. A cor vermelha representa a coloração com violeta de cresila. A barra de escala representa um milímetro.

Aqui, a imagem mostra uma seção do mesmo pássaro canoro, o tentilhão-zebra, que foi hibridizado com uma sonda de riboprova antissenso para o fator de transcrição Coop TF dois. As imagens seguintes comparam a marcação antissenso e sessenso, que revelam padrões diferentes nesta auto-radiografia em filmes de raios X de cortes sagitais de cabeças de tentilhão-zebra no dia embrionário 12. A linha tracejada indica o contorno de todo o cérebro e a letra C marca o cerebelo.

Pode-se observar que a fita antissenso do PAC seis é expressa no cérebro, especialmente na zona ventricular. Esta seção adjacente hibridizada com a fita senso do pacote seis revela ausência de expressão de fundo em toda a cabeça do embrião, mas expressão aparente na camada pigmentar da retina, como ocorre com a fita antissenso. As imagens a seguir mostram, em C, dois sinais de expressão gênica e lâminas mergulhadas em emulsão obtidas do cérebro de tentilhão-zebra durante estágios embrionários tardios, vistas em campo claro e campo escuro.

Esta imagem em campo claro mostra a expressão de D one B no dia embrionário 10. A partir de uma exposição normal ao emulsão, o marcador que aparece preto mal pode ser visto nesta ampliação. Esta imagem mostra uma seção idêntica e a mesma ampliação da imagem anterior, mas com a visualização em campo escuro, mostrando a marcação em branco no estriado e no tálamo.

Esta imagem de campo claro mostra a expressão do gene slit três no dia embrionário 12. Após uma superexposição à emulsão, o marcador preto pode ser facilmente visualizado. SC marca a posição da medula espinhal e CB marca a posição do cerebelo.

O polo rostral está orientado para a esquerda. A imagem mostrada aqui corresponde à mesma seção, com aumento idêntico, apenas alterada para a visão em campo escuro, mostrando marcação em branco na medula espinhal que corresponde à imagem em campo claro. As imagens seguintes mostram a resolução dos grãos de prata ao nível celular.

Mostrado aqui está o marcador do RNA mensageiro Fox P1, com grãos de prata visíveis como pontos pretos acima das células coradas com violeta de genciana. Esta imagem mostra expressão de alta abundância sobre células individuais no mesoalículo de um zebra-fino adulto. Esta imagem mostra expressão de baixa abundância sobre células individuais no alículo adjacente da mesma seção aqui.

Olá Fox. A expressão do mensageiro P um de RNA ao longo das células é observada no mesentério do dia embrionário 12.

As células embrionárias vistas aqui são menores e mais densamente empacotadas em comparação com as células adultas vistas nas duas imagens anteriores. Por fim, esta imagem mostra expressão de baixa abundância nas células do alium adjacente da mesma seção. Após seguir este procedimento, outros métodos, como imunoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como em qual tipo celular o gene alvo é expresso.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a hibridização in situ. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como proteções pessoais, devem sempre ser tomadas durante este procedimento.