Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

O objetivo geral deste experimento é observar os efeitos de Pseudomonas syringae pv. tomato em proteínas reguladas por redox em plantas de tomateiro. Primeiro, inocule plantas de tomateiro com Pseudomonas syringae pv. tomato para induzir infecção pelo patógeno e resposta proteica. Em seguida, proceda à coloração com diaminobenzidina para observar alterações nas espécies reativas de oxigênio.

Em seguida, realize a marcação de cistemas com TMT para examinar cistemas regulados pela redox em proteínas. Os resultados obtidos podem medir alterações entre amostras tratadas e controles. Olá, sou Chen do departamento de biologia e da instalação de proteômica aqui na Universidade da Flórida.

A vantagem da nossa marcação CTMT em comparação com métodos existentes, como a marcação com isótopos revestidos em nadadeiras, também conhecida como ASCA, é a capacidade de multiplexação ao analisar proteínas responsivas ao estado redox em larga escala. Embora esta demonstração forneça informações sobre proteínas reguladas pelo estado redox em tomate em resposta à infecção por patógenos, o experimento pode ser aplicado a outros sistemas, como joof, camundongos cu e outras plantas, bem como ao controle de condições de estresse. Tivemos inicialmente a ideia deste método após observarmos variações acentuadas entre experimentos ICAD, pois apenas duas marcas estão disponíveis.

A demonstração em vídeo deste método é essencial, pois as etapas de marcação e enriquecimento são difíceis de aprender. As variações experimentais entre amostras marcadas devem ser minimizadas e as regiões removidas devem ser reduzidas para garantir uma marcação eficiente. Vamos começar. Cultive duas mudas de tomate transplantadas de tamanho semelhante em vasos de quatro polegadas de diâmetro para a cultura do inóculo.

Uma camada uniforme de pseudomona singe em uma placa A KBM. Raspe as bactérias em 20 mililitros de água e prepare um inóculo bacteriano de aproximadamente 10 elevado a seis unidades formadoras de colônia por mililitro. Em um litro de tampão de inoculação, mergulhe as plantas de quatro semanas na solução de inoculação bacteriana por 30 segundos.

Em seguida, cubra imediatamente com sacos plásticos transparentes. Após o tempo de inoculação desejado, colete a folha totalmente expandida, posicione o lado epidérmico voltado para cima em uma solução de um miligrama por mililitro de corante DAB e infiltre a vácuo por 15 minutos. Incube então as folhas no escuro, à temperatura ambiente, durante a noite.

Agora ferva as folhas coradas em etanol 95% por 10 minutos e armazene em etanol 75% usando um almofariz para moer. Triture as folhas colhidas a um pó fino em nitrogênio líquido. Em seguida, realize extrações com fenol conforme descrito no texto acompanhante.

Em seguida, precipite as proteínas extraídas com fenol utilizando cinco volumes de acetato de amônio 0,1 molar frio em metanol 100%. Recolha as proteínas por centrifugação e realize lavagens do pellet. Em seguida, ressuspenda as amostras em 1,5 mililitros de etanol 70% frio e transfira para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Após a centrifugação, descarte o sobrenadante de etanol e seque brevemente o pellet em um speed vac. Dissolva as amostras em um tampão de extração de proteínas desnaturante após centrifugar para formar um pellet, colete o sobrenadante e meça a concentração de proteína de acordo com o manual do fabricante. Para cada uma das seis marcas isotópicas, inicie com 100 microgramas de amostra de proteína em volume igual de tampão de alquilação de acetamida IO 200 milimolar recém-preparado para bloquear os grupos tiol livres. Incube a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, para precipitar as proteínas, adicione um mililitro de acetona fria a 80% e mantenha a menos 20 graus Celsius durante a noite.

Pelotize a proteína por centrifugação e realize três lavagens com acetona a 80%. Após secar as amostras ao ar sobre gelo, ressuspenda o pellet em 50 microlitros de tampão de lise. Em seguida, para reduzir as ligações dissulfeto, adicione 0,5 microlitros de TCEP 100 milimolar e incube por uma hora à temperatura ambiente.

Solubilize as etiquetas adicionando 20 microlitros de acetonitrila aos tubos de reagente. Vortex e centrifugue brevemente em seguida para remover o excesso de TCEP. Aplique 50 microlitros da amostra em uma coluna MicroCon de três kD. Adicione 50 microlitros de tampão de lise e centrifugue por 15 minutos a 10.000 ×g e 4 °C.

Para coletar a amostra, remova a coluna, inverta-a em um tubo limpo e centrifugue. Verifique o pH da amostra, se necessário. Ajuste entre pH sete e oito com ácido clorídrico um molar.

Adicione cinco microlitros do reagente TMT para liberação de cistos e incube a reação por duas horas à temperatura ambiente. Combine as amostras e adicione volume igual de tampão amostral Laemmli, ferva por cinco minutos e separe em um gel pré-moldado de poliacrilamida a 12%. Após lavar o gel três vezes com água filtrada, cora com azul de Comassie por uma hora e descora durante a noite em água, com base nas concentrações das bandas proteicas. Divida 12 frações por cada linha do gel. Corte cada fração em pedaços de um milímetro e coloque em um tubo de 1,5 mililitro.

Retenha completamente os fragmentos de gel com bicarbonato de amônio 0,1 molar em acetonitrila a 50%. Agora, cubra os fragmentos com acetonitrila a 100% por 15 minutos. Remova o líquido e seque os fragmentos utilizando um evaporador rápido.

Em seguida, adicione um volume igual de solução de tripsina e coloque no gelo para reidratar. Incube então a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas para digestão tríptica. Em seguida, remova o extrato proteico líquido das amostras incubadas.

Interrompa a reação e remova qualquer digestão proteica remanescente cobrindo os pedaços de gel com ácido fórmico 5%, acetonitrila 50%. Em seguida, agite os pedaços de gel por 20 minutos à temperatura ambiente. Transfira o sobrenadante para os tubos das amostras de proteína extraída após mais duas extrações.

Seque as amostras sob vácuo em tubos de 0,5 mililitro. Prepare uma suspensão a 50% do resina anti-TMT em TBS numa concentração proporcional à intensidade da respectiva banda proteica. Lave a resina três vezes com um volume de coluna de TBS 1x e prossiga adicionando 200 microlitros de TBS a cada amostra.

Em seguida, transfira para resina anti-TMT e agite à temperatura ambiente por duas horas, seguido de agitação lenta durante a noite a quatro graus Celsius. Carregue cada amostra em uma coluna. Realize lavagens da coluna com 200 microlitros cada.

Em seguida, elua cada amostra três vezes com 200 microlitros de tampão de eluição a 50% e seque sob vácuo. Reese, suspenda as amostras em 12 microlitros de acetonitrila a 3% com ácido fórmico a 0,1% e injete cinco microlitros diretamente em uma coluna de HPLC. Elua os peptídeos utilizando um gradiente de aumento de acetonitrila conforme detalhado no texto acompanhante.

Utilize espectrometria de massas para detectar peptídeos em um fluxo de trabalho top two by three. Inicie com um único estágio de ms. Em seguida, adquira três espectros Ms.Ms com dissociação por colisão com energia mais alta no trampa de íons, seguido por três.

Ms.MS com dissociação induzida por colisão para identificação de proteínas. Analise os dados de espectrometria de massas utilizando um fluxo de trabalho ramificado. Implemente um quantificador de íons marcadores para quantificar a proporção.

Além disso, processe o espectro MS do MSM pelos nós seletor de espectro, normalizador de espectro e agrupador de espectros, consultando os dados contra o mecanismo de busca Seaquest. Esta imagem mostra exemplos de uma folha de planta de tomateiro controle à esquerda e uma folha inoculada com Pseudomonas à direita, após as folhas serem coradas com DAB. O processo de coloração com DES permite que a coloração histoquímica mostre sinais de espécies reativas de oxigênio no tecido foliar.

Como esperado, o controle não apresenta coloração significativa, enquanto as folhas tratadas com pseudomonas apresentam coloração positiva para a produção de peróxido de hidrogênio. Este exemplo mostra a saída de dados do Proteome Discover, na qual a área do pico de uma proteína regulada diferencialmente no estado redox permite a quantificação absoluta para cada amostra. A área do pico entre as amostras controle e inoculadas indica quantidades relativas.

Aqui, a regulação redox de uma proteína entre uma amostra controle e uma inoculada é semelhante. Picos de intensidade semelhante sugerem a presença de ligações dissulfeto não reguladas por uma mudança no tratamento. Após dominar a técnica, ela pode ser realizada corretamente em uma semana.

Lembre-se de manter as amostras frias e as etiquetas organizadas. Além disso, tome precauções ao usar fenol, como luvas descartáveis e trabalhar na câmara de fluxo, seguindo este procedimento. Outras medidas, como análises específicas de espectrometria de massas de modificações pós-traducionais, podem ser realizadas para determinar outras modificações no sistema, como ácido ônico e simulação de glúten.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a aquisição de CTMD com DIB em posição ortostática e a qualificação redox 16.