Name: Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprenda a técnica de injeção retiniana direcionada e eletroporação in ovo em embriões de galinha no estágio E4. Este método permite estudar expressão gênica e desenvolvimento da retina em nível de célula única.

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Gostaríamos de agradecer ao Sr. Maaz Enver para o uso de sua câmera HD (Cannon VIXIA HFS100). Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH (EY018738), Nova Jersey, Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal (08-3074-SCR-E-0 e 10-3091-SCR-E-0), e Prêmio de Pesquisa Biomédica Busch.

Uma vez que algumas partes do protocolo são realizados conforme descrito anteriormente em outros vídeos Jové 2 e papéis 3 com modificações menores não vamos discutir aqueles em detalhe aqui. 1. Manuseio de ovo e Preparação Agulha <ol><li> Os ovos podem ser armazenados em um refrigerador de vinho menos cerca de 13 ° C por até 1 semana. Se a temperatura é demasiado elevada, os embriões vai começar a desenvolver de forma anormal, enquanto que, baixa temperatura provoca uma mortalidade de alta. Quando estiver pronto para incubar tirar os ovos do refrigerador de vinho e definir os ovos na vertical com a extremidade maior até. Mantenha os ovos em a temperatura da sala durante pelo menos 2 horas antes de colocá-los no 37,5 ° C incubadora. </li><li> Incubam os ovos para 96-100 horas, que é sobre o dia embrionário 4 para obter embriões que estão na fase Hamburger e Hamilton 22 4-5. </li><li> Prepare agulhas micropipeta de tubos de vidro puxado capilares e quebrar a ponta em uma micro dissecaçãoescopo com uma pinça para conseguir uma abertura cerca de 0,1 m de diâmetro e um cone de 20 mm. Agulhas com pontas maiores têm dificuldade perfurar a membrana vitelina enquanto pontas menores têm dificuldade de carregar e entregar a solução de DNA. </li><li> Anexar a agulha para um 0,1 ml Hamilton estanque ao gás seringa montada sobre um micromanipulador. Use um pequeno pedaço de Masterplex tubo de silicone para anexar a agulha para a seringa. Uma vez que as conexões estão apertadas não há necessidade de adicionar óleo mineral para selar este anexo. </li><li> Misture 2 uL de repórter solução de ADN plasmídeo com uma concentração que varia 3-6 ug / uL e 0,2 uL de verde rápido (0,025%) em um pedaço de parafilme. Corante verde rápido vai ajudar a visualizar a injeção. Lentamente, carregar a agulha com a mistura. </li><li> Para liberar a membrana vitelina da membrana interna girar o ovo suavemente cerca de 180 ° e esperar por alguns minutos, em seguida, gire-o de volta à posição original e configurá-lo para eletroporação. </li><li> Limpe a forceps e casca de ovo com etanol a 70% para evitar a infecção para o embrião. </li><li> Faça um pequeno buraco sobre o ovo imediatamente acima da célula de ar com um par de fórceps tamanho AA. Tenha cuidado para não quebrar a casca do ovo. Remover pedaços pequenos um de cada vez para fazer uma pequena janela. Cuidadosamente remova a membrana interna usando os fórceps sem tocar a membrana vitelina. </li></ol> 2. Injeção e Eletroporação <ol><li> Para evitar danos para o cérebro ou o coração posição, o contra-agulha lateral para o bundle principal de vasos sanguíneos que entram no olho e apontando em direção ao bico. </li><li> Pierce através da membrana vitelina, esclera, retina e humor vítreo por um impulso súbito suave da agulha. Se a agulha perfura através de a outra extremidade do olho que deve ser alright, a menos que ele danifica qualquer veia sangue major. </li><li> Lentamente, puxe de volta a agulha na borda da abertura e colocá-lo quase tangente à parede exterior do globo ocular. </li><li> Insert a agulha para dentro do espaço sub da retina entre a esclera e da retina. </li><li> Injectar o DNA até que você possa visualizar a solução verde de enchimento o lado do globo ocular e empurrando a fressura da retina através da criação de um bojo. </li><li> Se a sua colocação da agulha não é correto, então você vai ver a solução de DNA se espalhando dentro do humor vítreo enchendo até o meio do globo ocular. Além disso, se você danificar a retina muito, então você vai ver a solução de DNA está saindo do globo ocular. </li><li> Lentamente, retirar a agulha e coloque imediatamente os eletrodos em paralelo dentro do ovo após imersão em PBS. Empurre os eletrodos para submergir no líquido amniótico de uma forma para que o olho injetado está localizado entre os eletrodos. Evite tocar em qualquer grande vaso sanguíneo ou o coração com os eletrodos, enquanto colocá-los. O eletrodo negativo deve ser na parte lateral da injecção para que o DNA pode ser transportados a partir do espaço da retina sub para a retina em direção eletrodo positivo. Electrocorporar a retina com 5 pulsos de 15V para 50 ms com intervalos de 950 ms. </li><li> Com cuidado, retire os eletrodos e selar a janela do ovo com pedaços de fita adesiva transparente. </li><li> Etiqueta e datar o ovo injetado antes de colocá-lo de volta para a incubadora. Tipicamente, ele leva cerca de 3 a 5 minutos para completar o processo de electroporação todo. </li><li> Expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a electroporação. No entanto, você pode esperar até que o embrião atinge a fase desejada antes da colheita. </li></ol> 3. Os resultados representativos Em nosso estudo, nós usamos vários construtos plasmídicos para estudar a regulação da expressão de gene que envolveu o desenvolvimento de células de retina. Neste vídeo pCAG-GFP (controle de transfecção) foi usado para siga uma injecção de bem-sucedida e electroporação. No entanto, qualquer constructo plasmídeo com gene repórter (GFP, RFP etc) pode ser usado. Mesmo embora expressão da GFP pode ser visto tão cedo quanto 8 horas após a elemenctroporation, que normalmente começar a colher o óvulo no dia 6 (E6) e em diante. Eletroporados retinas foram dissecadas para fora do embrião e analisados ​​em microscópio fluorescente dissecção antes de incorporação e de corte. Tipicamente, expressão do gene repórter pode ser visto, pelo menos, em um quarto da retina após uma electroporação bem-sucedida (Fig. 1). Os tecidos da retina transfectadas foram analisados ​​por meio de seccionamento de uma clara visualização de morfologias celulares. A imuno-histoquímica utilizando marcadores de células tipo específico (Brn3a, Pax6 etc) de caracterização permitido de célula-específica expressão da GFP (Fig 2). <img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig1.jpg" align="Figure 1" /> Figura 1. Eletroporação sucesso de expressão plasmídeo repórter GFP resultados positivos. Chicken embrionário retinas foram injetados e electroporados no dia embrionário 4 e colhidas no dia embrionário 6. , Pelo menos, 25% da retina com êxito foi transfectado (Um modo de exibição = Top, B= View Inferior). Escala Bar = 1mm. <img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig2.jpg" align="Figure 2" /> Figura 2. Caracterização de células da retina expressando GFP utilizando imuno-histoquímica. GFP expressar tecidos da retina em E7 foram palco fixo e seccionados. Estas secções foram, então, corados com marcadores de células vários específicas. Brn3a foi utilizado para determinar células ganglionares (A) enquanto Pax6 foi utilizado para determinar amacrina, horizontal e células ganglionares (B). Barra de escala = 50 mM.

<ol><li>Doh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+retinal+cell+development+in+chick+embryo+by+immunohistochemistry+and+in+ovo+electroporation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques.</a> BMC. Dev. Biol. 10, (2010).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn.%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stage+series+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The stage series of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).</li>
</ol>

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Instalações da Universidade Rutgers.

Targeted injecção da retina e em eletroporação in ovo em retina embrionária no estádio de E4 podem objetivar especificamente as células progenitoras da retina, resultando em a habilidade de visualizar todos os seis principais tipos de células da retina no nível da célula única. Em electroporação in ovo em HH10 (~ E1.5) alvejando o vesícula óptica é capaz de transfectar células que se desenvolvem para formar o olho. No entanto, estas células têm um volume de negócios muito elevado nest...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Fertilizados livres de patógenos (SPF) de frango ovos brancos leghorn </td><td> Fazendas Sunrise (Catskill, Nova Iorque) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chicken ovo incubadora </td><td> GQF fabricação, Savannah, GA </td><td> Modelo-1550 </td><td> Definir a 60% de umidade e 37,5 ° C. </td></tr><tr><td> Os tubos de vidro capilares </td><td> Precision Mundial Instrument Inc. </td><td> TW150F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 ml seringa </td><td> Hamilton Co. Reno, Nevada </td><td> Estanques 1710 </td><td> Seringa Alternativamente 1ml pode ser usado como bem </td></tr><tr><td> Masterflex Silicone (peróxido) Tubulação </td><td> Cole-Parmer </td><td> HV-96.400-13 </td&gt; <td> Corte um pedaço pequeno (1 cm) para anexar a agulha de vidro para a seringa </td></tr><tr><td> Pinça </td><td> Dumont </td><td> AA </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Precision Mundial Instrument Inc. </td><td> M3301-M3 </td><td></td></tr><tr><td> O DNA de plasmídeo </td><td></td><td></td><td> pCAG-GFP foi emprestado do Dr. Connie Cepko </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Diluir-lo para 0,025% com PBS </td></tr><tr><td> Gerador de pulso </td><td> Harvard Apparatus, MA </td><td> BTX ECM 830 </td><td> Gerador de onda quadrada </td></tr><tr><td> Eletrodos </td><td> Harvard Apparatus, MA </td><td> BTX modelo 514 </td><td> Nossos eletrodos foram espaçadas 3-5 mm além </td></tr><tr><td> Câmera Digital Monocromático </td><td> Zeiss, Alemanha </td><td> Axiocam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção fluorescente </td><td> Leica Microsystems, Alemanha </td><td> Leica MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência Upright </td><td> Zeiss, Alemanha </td><td> Zeiss Axio Imager A1 </td><td></td></tr></tbody></table>

em eletroporação ovo na retina de pinto embrionário

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento da retina em vertebrados mais elevados. Por causa de grande tamanho e desenvolvimento externo, ele é comparativamente muito fácil de manipular a retina de pinto embrionário usando recombinante DNA / tecnologia de RNA. Electroporação de ADN / ARN construtos para a retina embrionária têm uma grande vantagem para estudar regulação do gene em retinianas-tronco / progenitoras células durante o desenvolvimento da retina. Tipo diferente de ensaios, tais como ensaio de repórter gene, gene over-expressão, gene knock down (shRNA), etc pode ser realizada utilizando a técnica de electroporação. Este vídeo demonstra alvejado injecção da retina e em eletroporação in ovo dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Aqui nós mostramos uma rápida e conveniente em técnica de eletroporação in ovo através do qual um DNA de plasmídeo que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) como um marcador está diretamente entregue napinto espaço sub-retiniano embrionário e seguido por pulsos elétricos para facilitar a absorção de DNA por retina estaminais / progenitoras das células. O novo método de injecção de retina e electroporação em E4 permite a visualização de todos os tipos celulares da retina, incluindo a neurônios tardia-nascido 1, que tem sido difícil com o método convencional da injecção e electroporação em E1.5 2.

O objetivo geral deste vídeo é mostrar como executar alvo injeção de retina e<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporação de ADN / ARN construtos dentro da retina de pinto embrionário no Hamburger e do estágio Hamilton 22-23, o que é de cerca de dia embrionário 4 (E4). Esta técnica é muito útil para estudar a expressão do gene, regulação do gene, e mudança morfológica no desenvolvimento de retina do pintinho.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

A retina embrionária de galinha é uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento retiniano em vertebrados superiores. Devido ao tamanho reduzido e ao desenvolvimento externo, ela é...

Olá, eu sou Mohammed Islam. Sou aluno de pós-graduação no laboratório da Dra. Lee, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Rutgers. Hoje vou mostrar como realizar injeção retiniana direcionada e eletroporação in vivo.No embrião de chi, vamos injetar a retina embrionária de galinha no estágio do quarto dia embrionário, que é cerca de 96 horas após a inflamação. Esta técnica é considerada um método novo para o estudo do desenvolvimento retiniano. Este método tem como alvo especificamente as células progenitoras retinianas, resultando na capacidade de visualizar todos os tipos celulares da retina ao nível de célula única.Também pode ser aplicado em estudos de ganho ou perda de função, nos quais um gene de interesse pode ser direcionado a um estudo sobre o desenvolvimento normal ou doenças da retina. X pode ser armazenado em um refrigerador de vinho a cerca de 13 graus Celsius por até uma semana. Se a temperatura for muito alta, os embriões começarão a se desenvolver de forma anormal, enquanto temperaturas mais baixas causam alta mortalidade.Uma vez que esteja pronto para a incubação, retire os ovos do refrigerador de vinho e posicione-os verticalmente com a extremidade maior voltada para cima. Mantenha os ovos em temperatura ambiente por pelo menos duas horas antes de colocá-los no incubador 37.5 Gcel Yes. Incube os ovos por cerca de 96 horas, o que corresponde aproximadamente ao quarto dia embrionário.Para obter embriões na fase Hamburger e Hamilton 22, prepare micropipetas a partir de tubos capilares de vidro e quebre a ponta sob um microscópio estereoscópico com pinças, obtendo uma abertura de aproximadamente 0,1 micrômetro de diâmetro e uma ponta cônica de dois milímetros. Micropipetas com pontas maiores têm dificuldade para perfurar a membrana vitelina, enquanto pontas menores apresentam dificuldade para carregar e liberar a solução de DNA. Em seguida, fixe a micropipeta a uma seringa gastrica Hamilton montada em um micromanipulador.Use um pequeno pedaço de tubo de silicone plex mestre para fixar a agulha à seringa. Como as conexões são amarradas, não é necessário adicionar óleo mineral. Para selar esta fixação, misture dois microlitros de solução de DNA do plasmídeo repórter com uma concentração variando entre três e seis microgramas por microlitro e 0,2 microlitro de azul rápido. O corante azul rápido na periferia ajudará a visualizar a injeção; carregue lentamente a agulha com a mistura para liberar a membrana vital da membrana interna. Gire suavemente o ovo cerca de 180 graus e aguarde alguns minutos.Em seguida, gire-o de volta para a posição original e prepare-o para eletroporação. Limpe a pinça e a casca do ovo com etanol 70% para evitar infecção do embrião. Faça um pequeno orifício no ovo imediatamente acima da câmara de ar com uma pinça.Tenha cuidado para não rachar a casca do ovo. Remova pequenos pedaços um de cada vez para fazer uma pequena janela. Remova cuidadosamente a membrana interna usando a pinça, sem tocar a membrana vital, para evitar danos ao cérebro ou ao coração.Posicione a agulha contralateralmente ao feixe principal de vasos sanguíneos que entram no olho, conforme indicado pela seta e apontando em direção ao bico. Perfure a membrana vítrea, a esclera, a retina e o humor vítreo. Com um empurrão súbito da agulha, se ela atravessar a outra extremidade do olho, isso deve ser aceitável, desde que não danifique nenhuma veia sanguínea importante.Puxe lentamente a agulha na borda da abertura e posicione-a quase tangente à parede externa do globo ocular. Insira a agulha no espaço sub-retiniano entre a esclera e a retina. Injete o DNA até que seja possível visualizar a solução verde preenchendo o lado do globo ocular e empurrando a retina para dentro, criando uma protuberância.Aqui há outro bom exemplo de uma injeção bem-sucedida com a formação de uma protuberância, ilustrado neste diagrama. Se a colocação da sua agulha não estiver correta, você verá a solução de DNA se espalhando dentro do humor vítreo, preenchendo o centro do globo ocular. Além disso, se você danificar muito a retina, verá a solução de DNA saindo do globo ocular.Remova lentamente a agulha e coloque imediatamente os eletrodos em paralelo dentro do ovo. Após a imersão em PBS, pressione os eletrodos para baixo de modo a submergi-los no líquido amniótico, de forma que o olho injetado fique localizado entre os eletrodos. Evite tocar qualquer veia sanguínea principal ou o coração com os eletrodos durante a colocação.Os eletrodos negativos devem estar no local da injeção para que o DNA possa ser transportado do espaço sub-retiniano para a retina em direção ao eletrodo positivo. Eletroporar a retina com cinco pulsos de 15 volt por 50 milissegundos com intervalos de 950 milissegundos. Remover cuidadosamente os eletrodos e selar a janela do ovo com pedaços de fita adesiva transparente, rotulando e datando o ovo injetado antes de devolvê-lo ao incubador.Normalmente, leva cerca de três a cinco minutos para concluir todo o processo de eletroporação. A expressão de GFP pode ser observada já oito horas após a eletroporação. No entanto, você pode esperar até que o embrião atinja o estado desejado antes de colher o ovo.Espero que este vídeo tenha sido útil para você realizar seu próprio experimento. Obrigado por assistir.

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Biology

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