Name: Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a controlar a atividade de pequenas GTPases em nível subcelular usando luz UV e sistemas de fotoengenharia com rapamicina em células vivas. Este método permite manipulação precisa de sinalização celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi financiado pelo NIH o financiamento da investigação (DK090868 e GM092930 de TI). Existe uma patente pendente sobre um análogo rapamicina enjaulado.

1. A transfecção de DNA de plasmídeo <ol><li> Adicionar DNAs plasmídicos, 0,5 ug FRB membrana amarrado (daqui em diante referido como LDR) e 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell lymphoma invasão e metástase indutora de proteína 1: Rac activador) marcado com proteína fluorescente para 37,5 uL dH 2 O. Adicionar 1 ml FuGENE HD. </li><li> Vortex e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. Enquanto isso, vá para as etapas 1,3-1,8. </li><li> Lava-se cada poço de uma câmara de 8-bem com 50 uL de poli-D-lisina. </li><li> Lavar o centro de cada poço com dH 2 O. </li><li> Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 e diluir até 10 mL meio de cultura (DMEM com FBS 10%). </li><li> Remover 375 ul de suspensão e centrifugar a 1750 rpm durante 3 minutos. </li><li> Aspirar a mídia, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 750 ul de DMEM FBS w / 10% e ressuspender. </li><li> Adicionar suspensão de células de dH 2 O / DNA / solução FuGENE HD e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 250ul de célula / DNA suspensão a cada poço (irá preencher até 3 poços). </li><li> Incubar as células transfectadas a 37 ° C e 5% de CO2 durante 15-18 hr. </li></ol> 2. Preparação de crb-se uma solução <ol><li> Sintetizar enjaulado aduto rapamicina-biotina (CRB). Consulte &quot;esquema sintético do crb&quot; para detalhes. Resumidamente, porções enjaulamento e biotina são preparados separadamente. A porção de encarceramento é então conjugado de rapamicina (LC laboratório), o produto subsequentemente acoplado à porção de biotina por um meio de reacção clique 7 para se obter CRB. </li><li> Preparar uma solução-mãe 1 mM de crb em DMSO. </li><li> Dissolve-se avidina 1mg em 250 ul de PBS em um tubo Eppendorf 0,5 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de solução estoque para crb avidina dissolvido. Misturar invertendo várias vezes. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 15 min para se obter CRB-avidina conjugada (CRB-A) De solução. </li><li> Excluir pequenas moléculas não ligadas e purificar CRB-A. Utilizando uma coluna de exclusão de tamanho </li></ol> 3. Microscopia e Iluminação Luz em nível subcelular <ol><li> Soro fome células transfectadas em DMEM sem FBS durante 12 horas. </li><li> Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação fora das células e adicionar 250 uL da nM 400 preparada CRB-se uma solução (a partir do passo 2.6). </li><li> Para visualizar dinâmica de proteínas em células vivas em resolução subcelular antes e após tratamento com luz, microscopia de disco giratório foi utilizado (Figura 2a). Iluminação UV foi conseguida por acoplamento óptica para luz do LED UV (365 nm) com epi-fluorescência de luz (Figura 2b). </li><li> MetaMorph software foi usado para capturar imagens de fluorescência de células transfectadas a cada 15 segundos. </li><li> Definir as coordenadas e tamanho de um ponto de iluminação usando uma placa de vidro revestida com corantes fluorescentes excitadas pela luz UV. O tamanho podeser variado através da aplicação de lente objectiva com ampliações diferentes e seleccionando as fibras ópticas com tamanho do núcleo diferente. </li><li> Após a determinação dos níveis de fundo de luz membrana ruffling UV, irradiam na periferia das células. Os dois passos seguintes são para contrastar anterior efeitos localizados. </li><li> Globalmente irradiar as células com luz de 365 nm fornecida por uma lâmpada de mercúrio. </li><li> Dissolver uncaged, assim rapamicina original em DMSO e em seguida em PBS (400 nM final), e adicionar a solução para a câmara de imagem para induzir efeitos globais. </li></ol> 4. Os resultados representativos Um exemplo de resultados representativos é mostrado na Figura 3. Irradiação com luz UV a uma pequena região perto de uma aresta celular rapidamente induzida a formação de zonas plissados ​​apenas na e próximo da área irradiada. Para confirmar que esta era de fato a atividade local, em seguida, globalmente irradiados células com UV, ou adicionado a rapamicina para os meios de comunicação em massa, tanto de which induziram a formação ruffle global ao longo da membrana. Para uma análise quantitativa, as células alvo dividida em quatro quadrantes, e contados a frequência de formação de plissado em cada quadrante sobre local, bem como após a estimulação global sob várias condições, incluindo os controlos (Figura 4). É apenas esta combinação de irradiação UV, CRB-A, e adequados FKBP-FRB construções que induz ruffling local. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática da dimerização de proteínas espacialmente confinado usando gaiolas rapamicina-avidina conjugada (CRB-A) e luz UV. Irradiação UV cliva o ligante entre rapamicina e biotina, resultando na libertação de química dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroxietil) rapamicina) e do seu sub-produto. O dimerizer liberado em seguida, difunde para as células e induz a dimerização entre FKBP-POI (proteína de interesse) e memb plasmarane ancorado FRB apenas na proximidade da região irradiada (círculo azul). Sem a irradiação UV, FKBP e FRB não associado (cruz vermelha), portanto, não produzindo efeito. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem do microscópio confocal personalização de fluorescência. (A) Vista frontal do microscópio confocal (invertido Axiovert 200, Zeiss). (B) Close-up vista, topo de uma unidade de acoplamento de EPI fluorescência e iluminação UV. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" /> Figura 3. Formação plissado espacialmente confinado numa célula NIH3T3 transfectadas induzida por irradiação UV localizada. Confocal imagens de fluorescência de uma célula de fibroblastos NIH3T3 que é transfectada com YFP-marcado FKBP-Tiam1 (Rac ativador) e LDR (membrana ancoradas FRB) foram submetidos à irradiação em uma área restrita perto de sua borda com LED luz a 365 nm durante 15 seg 210 seg a partir de, na presença de CRB-Um conjugado nos meios de comunicação a granel. Este tratamento foi seguido de iluminação global com lâmpada de mercúrio durante 1 seg a 1063 adição seg e global de rapamicina finais 400 nM em 1560 seg. A célula mostrou quase nenhuma atividade despenteando no início (a), mas mostrou espacialmente confinado despenteando após a iluminação localizada (círculo amarelo) (b). A célula mostrou a formação plissado global após iluminação global e adição de rapamicina (cd), indicando que a formação de plissado local foi causada por activação espacialmente confinado de rac. Barra de escala: 10 um. (Copyright @ ACS2011) 6 <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" /> Figura 4. Frequência de formação de plissado em quadrantes de transfectadas células NIH3T3. Irradiação UV local com CRB-A e irradiação UV seguinte global foram realizados em 13 células. CRB-A </sTrong&gt; adição (sem irradiação de UV), irradiação UV local com ou sem avidina foram aplicadas sobre as células 13, 5 e 6, respectivamente. Nenhuma das células observados mostrou a formação de plissado com CRB-A, sem irradiação de UV, ou irradiação de UV local com ou sem avidina em meios a granel. Foram colhidos dados a partir de células com baixa formação de fundo plissado, mas que tinha a capacidade de rapamicina induzida por formação de plissado, que verificada após cada experiência, confirmando a formação de plissado global como um resultado da adição de rapamicina (finais 400 nM). Estes resultados mostraram que CRB-A e irradiação UV local são necessários para a formação plissado local nas células. (Copyright @ ACS2011) 6 Abreviaturas: FKBP: FK506-binding protein FRB: FKBP-rapamicina-binding protein Tiam1: T-cell lymphoma invasão e metástase indutor de proteína 1 (Rac GEF) LDR: Lyn-DSAG ligante-FRB (Lyn: N-terminal 11 aminoácidos da Lyn quinase) HE-Rapa: C40-O - (2-hidroxietil) rapamicina crb: rapamicina enjaulado com porção biotina CRB-A: crb conjugada com avidina

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
<li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li>
<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
<li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am+.Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li>
<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos uma técnica que utiliza um novo composto engaiolados em conjunto com o sistema de heterodimerização FKBP-FRB, a fim de manipular Rho actividade GTPase a uma localização precisa subcelular numa escala de tempo de segundos. Há três limitações da presente abordagem. Em primeiro lugar, porque o método baseia-se na prevenção ou permitindo a difusão de dimerizer através da membrana plasmática, a localização do alvo celular necessita de ser membrana plasmática ou na sua vizinhança. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Rapamicina </td><td> Tecoland </td><td> RAPA99 </td></tr><tr><td> FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709691001 </td></tr><tr><td> Avidina </td><td> Sigma </td><td> A9275-10MG </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650-5X5ML </td></tr><tr><td> Coluna de exclusão de tamanho </td><td> GE Healthcare </td><td> Giro Armadilha G-25 </td></tr><tr><td> Com fundo de vidro câmara de 8-bem </td><td> Thermo Scientific </td><td> 12-565-47 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert200M </td></tr><tr><td> UV fonte de luz LED </td><td> Rapp Opto Eletrônica </td><td> UVILED </td></tr><tr><td> Disco giratório Confocal </td><td> Yokogawa Electric Corp </td><td> CSU10 </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> ORCA-ER </td></tr><tr><td> Da Objectiva 100x </td><td> Zeiss </td><td> Apochromat Plano </td></tr></tbody></table> Esquema sintético do crb (Copyright ACS2011) 6 <a href="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3794/3794scheme1.jpg" alt="Esquema 1" /></a> Condições sintéticas: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) f.HNO 3, AcOH (c) TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gato glicerol,. PTSA, tolueno (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf 2 O, piridin (h) de metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, piridina, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butilpiridina, 2 CH Cl 2 (m) 13, CuSO4, ascorbato, 2-propanol, H2O, CH 2 Cl 2.

espaço-temporal manipulação de atividade gtpase pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Regulação dinâmica da família Rho de trifosfatases guanosina pequenas (GTPases) com precisão espaço-temporal grande é essencial para várias funções celulares e eventos 1, 2. A sua natureza dinâmica spatiotemporally foi revelada pela visualização da sua actividade e localização em tempo real 3. A fim de obter uma compreensão mais profunda dos seus papéis em diversas funções celulares a nível molecular, o próximo passo deve ser perturbação das actividades de proteína a uma localização precisa subcelular e de temporização. Para atingir este objectivo, desenvolvemos um método para a induzida pela luz, num espaço-temporal activação controlada de GTPases pequenas pela combinação de duas técnicas: (1) rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e (2) um método de foto-enjaulamento de rapamicina. Com o uso de rapamicina mediada heterodimerização FKBP FRB-, desenvolvemos um método para rapidamente induzível activação ou inactivação de pequeno GTPases including Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 e 5 Ras, em que a rapamicina induz a translocação de FKBP-fundidos GTPases, ou os seus activadores, para a membrana plasmática, onde está ancorada FRB. Para o acoplamento com o presente sistema de heterodimerização, também desenvolvido um sistema foto-enjaulamento de análogos de rapamicina. Um composto de foto-engaiolados é uma molécula pequena, cuja actividade é suprimida com um grupo fotocliváveis ​​proteger conhecido como um grupo de encarceramento. Para suprimir a actividade heterodimerização completamente, foi elaborado um rapamicina engaiolados que está preso a uma macromolécula tal que o complexo resultante grande não pode atravessar a membrana plasmática, levando a virtualmente nenhum fundo actividade como um dimerizer química no interior das células 6. A Figura 1 ilustra um esquema do nosso sistema. Com a combinação destes dois sistemas, é localmente recrutado um activador Rac para a membrana plasmática num espaço de tempo de segundos, e conseguido induzida pela luz de activação Rac no lev subcelularel 6.

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

A regulação dinâmica da família Rho de pequenas guanosina trifosfatases (GTPases) com grande precisão espaciotemporal é essencial para vários processos celulares...

Este vídeo demonstra um método no qual a luz UV é utilizada para manipular a atividade de uma proteína na membrana plasmática. Para isso, as células são cotransfectadas com a proteína FRB ancorada na membrana e a proteína de interesse fundida à FKBP. Um derivado de rapamicina fotoconfinado é adicionado ao meio.Em seguida, durante a microscopia em tempo real em células vivas, luz UV é aplicada a uma região específica da célula. O ligador entre a rapamicina e a biotina é clivado, liberando o dimerizador químico e seu subproduto; o dimerizador liberado difunde-se para dentro das células e induz a dimerização entre a proteína de interesse marcada com FKBP e a FRB ancorada na membrana plasmática na região irradiada. Na ausência de radiação UV, FKBP e FRB não se associam, não produzindo, portanto, nenhum efeito.A análise dos dados revela o recrutamento altamente localizado da proteína de interesse fundida com FKBP, com base em seu efeito fisiológico. A vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como abordagens farmacológicas e genéticas, é a combinação de rapidez de ação, especificidade do alvo e resolução espacial. As implicações desta técnica estendem-se à terapia de cânce

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este artigo detalha os procedimentos envolvidos na análise da superexpressão e GTPases pequenas células epiteliais polarizadas utilizando a técnica de microinjeção.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese, a fase final na divisão celular. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para analisar diferentes eventos cytokinetic em células de levedura de fissão ao vivo.

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

Inibidores típicos de microtúbulos, amplamente utilizados em pesquisas básicas e aplicadas, têm efeitos de longo alcance nas células. Recentemente, as fotostatinas surgiram como uma classe de inibidores de microtúbulos fotossentaráveis, capazes de manipulação instantânea, reversível e espacialmente precisa de microtúbulos. Este protocolo passo a passo detalha a aplicação de fotostatinas em um embrião de rato de pré-implantação 3D vivo.

Manipulação subcelular espiostemporal do Citoesqueleto microtubulo no embrião do rato de pré-implantação vivo usando Fotostatinas

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

As funções das proteínas da superfamília da dinamina dependem de mudanças conformacionais associadas à hidrólise do GTP. Um sistema é descrito usando a técnica FRET de molécula única (smFRET) para monitorar a dinâmica conformacional da GTPase aplastina semelhante à dinamina em diferentes estados de carga de nucleotídeos.

Imagem FRET de molécula única para observar a dinâmica conformacional da GTPase Atlastin semelhante à dinamina

Aprenda a controlar a atividade de pequenas GTPases em nível subcelular usando luz UV e sistemas de fotoengenharia com rapamicina em células vivas. Este método permite manipulação precisa de sinalização celular.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Explorar mais vídeos