Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Este vídeo demonstra um método no qual a luz UV é usada para manipular a atividade de uma proteína na membrana plasmática. Para fazer isso, as células são transfectadas com proteína FRB ancorada em membrana e a proteína fundida FK BP de interesse. Um derivado de rapamicina enjaulado com foto é adicionado ao meio.

Então, durante a imagem de células vivas, a luz UV é aplicada a uma região específica da célula. O ligante entre rapamicina e biotina é clivado, liberando dimerizante químico e seu subproduto, o dimerizador liberado, difunde nas células e induz a dimerização entre a proteína de interesse marcada com FKBP e a FRB ancorada na membrana plasmática na região irradiada. Sem a radiação UV, FKBP e FRB não se associam, portanto, não produzem efeito.

A análise dos dados revela recrutamento altamente localizado da proteína fundida FKBP de interesse com base em seu efeito fisiológico. A vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como farmacologia e abordagem genética, é a combinação de velocidade de ação, especificidade do alvo e resolução espacial. As implicações desta técnica se estendem para a terapia do câncer metastático é uma consequência da migração pelas células cancerígenas.

Portanto, a manipulação da atividade dos principais fatores de migração pode revelar seu mecanismo molecular preciso, que é pré-requisito para seu tratamento e cura. O procedimento de demonstração será Chris Paul Meyer, um estudante de pós-graduação e Bob de Rose, um técnico do meu laboratório. Comece este protocolo combinando o seguinte em um plasmídeo de tubo de microcentrífuga estéril, DNA, membrana amarrada FRB FLUORESCENTE marcada com FKBP, TIA um e água deionizada adicione um microlitro a alguns genes HD à mistura e vórtice.

Incube o tubo em temperatura ambiente por 20 minutos. Durante a incubação, adicione 50 microlitros de poli de licina a cada poço de um lado de vidro de oito poços e incube por um minuto para revestir a superfície, depois aspire a solução e lave o centro de cada poço com 50 de água deionizada. A próxima tripsina é 80 a 85% confluente NIH três células T.

Depois que as células se separarem, adicione 10 mililitros de DMEM contendo 10% de FBS, transfira 375 microlitros da suspensão para um tubo estéril de 15 mililitros e centrifugue a 1.500 G por três minutos. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o meio. Adicione 750 microlitros de DMEM com 10% FVS e Resus.

Suspenda o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Por fim, adicione a suspensão celular à solução de transfecção e, usando a ponta da pipeta, mexa delicadamente, adicione 250 microlitros da suspensão de transfecção celular a cada poço da câmara. Deslize e incuba.

37 graus Celsius por 15 a 18 horas. Para sintetizar rapamicina em gaiola, aduto de biotina. Comece preparando uma solução estoque de um milimolar de CRB em DMSO em um tubo de fuga estéril em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro e dissolva um miligrama de avadon em 250 microlitros de PBS.

Em seguida, conjugar a porção de gaiola com a rapamicina. Adicione 0,5 microlitros da solução estoque de CRB ao AVID dissolvido em misturado invertendo várias vezes e, em seguida, incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. Para produzir CRB AVID em solução conjugada para excluir pequenas moléculas não ligadas e purificar o CRBA, equilibre uma coluna de exclusão de tamanho G 25 com 300 microlitros de PBS.

Repita cinco vezes depois que a coluna estiver equilibrada. Carregue 125 microlitros de solução de CRBA no leito central da coluna. Em seguida, gire a solução por dois minutos a 800 G À temperatura ambiente, colete o fluxo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro após a transfecção das células.

Troque o meio por DMEM sem FBS para que as células incubem de fome de soro por 12 horas. Após a incubação, aspire suavemente o meio e adicione 250 microlitros da solução micromolar preparada de CRBA. Em seguida, para visualizar a dinâmica de proteínas em células vivas, use um microscópio confocal de disco giratório com iluminação UV para acoplar a óptica para luz LED UV a 365 nanômetros.

Com luz de fluorescência epi. Defina as coordenadas e o tamanho de um ponto de iluminação usando uma placa de vidro revestida com corantes fluorescentes excitados pela luz UV. Isso permite o ajuste fino da área a ser irradiada.

Coloque a lâmina da câmara com as células no palco usando uma objetiva de 100 x e epifluorescência. Coloque as células em foco e encontre uma célula. Para imagens, comece a visualizar as células depois de determinar os níveis de fundo do efeito fisiológico.

Aqui, o enrugamento da membrana é medido irradiar luz UV em um quadrante escolhido da célula, dissolver sem gaiola, portanto, rapamicina original em DMSO e depois em PBS até uma concentração final de 400 nanomolares. Adicione 100 microlitros da solução à câmara de imagem para induzir efeitos globais. Capture imagens de fluorescência a cada 15 segundos por 20 minutos para determinar se a ativação localizada do RAC pode induzir a formação de babados locais.

NIH três células T três foram transfectadas com ativador RAC marcado com YFP FK bp, TIA um e LDR, que é uma membrana ancorada. A irradiação localizada na borda da célula indicada pelo círculo amarelo foi seguida por iluminação global com uma lâmpada de mercúrio por um segundo a partir de 1063 segundos. Como pode ser visto aqui, quase nenhum rugido da membrana estava presente no início.

No entanto, após a iluminação localizada, foi observado um rugido espacialmente confinado após a iluminação global e a adição de rapamicina, que causa a translocação de FK bp TIA um para a membrana plasmática. A célula mostrou formação global de babados, indicando que a formação local de babados observada anteriormente foi causada pela ativação espacialmente confinada do rack. Para uma análise quantitativa, as células-alvo foram divididas em quatro quadrantes e a frequência de formação de babados em cada quadrante após a estimulação local e global foi determinada como visto neste gráfico.

Nenhuma das células observadas apresentou formação de babados com CRBA sem uve a radiação ou uve local, uma radiação com ou sem Aden em meio a granel. No entanto, quando o CRBA foi adicionado e a irradiação UV foi realizada, a formação de babados foi observada aproximadamente da mesma forma, aproximadamente 90% em todos os quadrantes com radiação global quando apenas o quadrante um foi irradiado, a frequência de formação de babados foi de 100% em comparação com 30% 25% e 30% nos quadrantes dois a quatro. Esses resultados indicam que o desenjaulamento localizado da rapamicina pode ser usado para induzir efeitos fisiológicos altamente localizados em uma única célula.

Neste caso, o enrugamento da membrana causado pela ativação do rack. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter o controle espaço-temporal da atividade de pequenos g TPAs pela luz. Este método pode ser aplicado a qualquer processo fisiológico que dependa de proteínas específicas que se translocam para a membrana plasmática.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar soluções, reagentes e células para cada procedimento. Não se esqueça de que trabalhar com luz UV pode ser extremamente perigoso e precauções como óculos UV devem sempre ser usadas.