Name: Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Aprenda a criar bibliotecas diversificadas de cápsides de AAV sintético usando DNA family shuffling. Este método permite a evolução molecular de vetores virais com propriedades aprimoradas para aplicações em terapia gênica.

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Os autores agradecem o apoio notável de seu laboratório, os membros da equipe e do trabalho pelo Cluster de CellNetworks Excelência na Universidade de Heidelberg, bem como pela Chica e Schaller Heinz (CHS) da fundação. Nós apreciamos que a evolução molecular de AAV via DNA família baralhar tornou-se um campo muito ativo desde a nossa primeira publicação há três anos e, portanto, peço desculpas a todos os autores de publicações relevantes, cujo trabalho não pode ser citado aqui, devido a limitações de espaço.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Todos os autores declaram que não têm nada a revelar.

Aqui, nós descrevemos essenciais etapas experimentais e diretrizes para AAV capsídeo de engenharia através da família de DNA shuffling e para a evolução em células ou em animais. Em essência, estes protocolos são versões padronizadas de os procedimentos relatados, primeiro dentro do campo AAV em 2008 3. Enquanto uma onda de estudos de acompanhamento por outros relataram por exemplo, inúmeras modificações, 10-13, nossas versões atuais representam estratégias básicas que rendem resultados re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 </td></tr><tr><td> Polietilenoimina (PEI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td></tr><tr><td> As enzimas de restrição </td><td> NEB </td><td> Vário </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> NEB </td><td> M0202T </td></tr><tr><td> Gel extraction kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Phusion Kit polimerase II </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S </td></tr><tr><td> HotStar Kit polimerase Hifi </td><td> Qiagen </td><td> 202602 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Finnzymes (NEB) </td><td> F-540S (parte do kit) </td></tr><tr><td> EDTA (25 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 18068-015 (parte do kit) </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Roth </td><td> 4855,2 </td></tr><tr><td> Ampicilina sal de sódio </td><td> Roth </td><td> K029.2 </td></tr><tr><td> dNTPs (10 mM, 100 ul) </td><td> Invitrogen </td><td> 18427013 </td></tr><tr><td> Iodixanol (OptiPrep) </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114739 </td></tr><tr><td> Phenolred </td><td> Merck </td><td> 107241 </td></tr><tr><td> Kit de preparação plasmídeo mega- </td><td> Qiagen </td><td> 12181 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Optima L90K </td></tr><tr><td> Seal-Quick tubos de centrífuga </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 342414 </td></tr><tr><td> Unidade de Eletroporação </td><td> Bio-Rad </td><td> GenePulserXcell </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Eppendorf </td><td> Vapo Protect </td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td> BIOER </td><td> MB-102 </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Olimpo </td><td> IX81 </td></tr><tr><td> Analisador FACS </td><td> Beckman-Coulter </td><td> Cytomics FC500 MLP </td></tr><tr><td> MegaX DH10B células T1R </td><td> Invitrogen </td><td> C640003 </td></tr><tr><td> Benzonase </td><td> Merck </td><td> 101695 </td></tr><tr><td> Adenovírus-5 </td><td> ATCC </td><td> VR-5 </td></tr><tr><td> pBluescript II KS (+) do plasmídeo </td><td> Stratagene </td><td> 212207 </td></tr><tr><td> cap5F (Pac site que em amarelo, CAP5-sequências específicas em negrito): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC </td><td> IDTDNA </td><td> Cartilha personalizado </td></tr><tr><td> cap5R (Asc site que em verde, CAP5-sequências específicas em negrito): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC </td><td> IDTDNA </td><td> Cartilha personalizado </td></tr></tbody></table>

engenharia e evolução da synthetic vírus adeno-associado (aav) gene vetores de terapia através de dna família shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Virais adeno-associados (AAV) vectores representam alguns dos veículos mais potentes e promissora para a transferência de gene terapêutico humano devido a uma combinação única de propriedades benéficas 1. Estes incluem o apathogenicity dos vírus tipo selvagem subjacentes e as metodologias altamente avançadas para a produção de título elevado, de elevada pureza e grau clínico vectores recombinantes 2. Uma outra vantagem particular do sistema de AAV sobre outros vírus é a disponibilidade de uma variedade de ocorrência natural serotipos que diferem em propriedades essenciais ainda podem ser facilmente concebido como vectores utilizando um protocolo comum 1,2. Além disso, um número de grupos incluindo o nosso próprio recentemente desenvolvido estratégias para usar estes vírus naturais como modelos para a criação de vectores sintéticos que ou se combinam os activos de serotipos de entrada múltiplas, ou que melhoram as propriedades de um único isolado. As respectivas tecnologias para alcançar essas metas are ambas as famílias de DNA baralhar 3, isto é, a fragmentação de vários genes de AAV cápside, seguida da sua re-montagem com base em homologias parciais (tipicamente&gt; 80% para a maioria dos serotipos de AAV), ou de exibição de péptidos 4,5, inserção ou seja, de geralmente sete aminoácidos na um circuito exposta da cápside viral em que o peptídeo idealmente medeia re-direccionamento para um tipo de célula desejado. Para o máximo sucesso, ambos os métodos são aplicados de uma forma de alto rendimento em que os protocolos são-up escalado para produzir bibliotecas de cerca de um milhão distintas variantes do capsídeo. Cada clone é então constituído por uma combinação única de numerosos vírus parentais (ADN abordagem baralhar) é ou contém um péptido distintivo dentro da espinha dorsal mesmo viral (abordagem de exibição de péptidos). O passo final subsequente é iterativo selecção de uma biblioteca em células alvo, a fim de enriquecer para cápsides individuais que preenchem mais ou, idealmente, todos os requisitos do processo de selecção. O último de preferência penteines pressão positiva, como o crescimento de um tipo de célula certa de interesse, com seleção negativa, para a eliminação exemplo de todos os capsídeos reagem com anticorpos anti-AAV. Esta combinação aumenta a probabilidade de que cápsides sintéticos sobreviventes a selecção correspondem às necessidades da aplicação dada de uma forma que, provavelmente, não têm sido encontrados em qualquer AAV que ocorre naturalmente isolar. Aqui, vamos nos concentrar no método DNA família baralhar como teórica e experimentalmente mais desafiador das duas tecnologias. Descrevemos e demonstrar todas as etapas essenciais para a geração e seleção de bibliotecas embaralhadas AAV (Fig. 1), e depois discutir as armadilhas e os aspectos críticos dos protocolos de que é preciso estar ciente, a fim de ter sucesso com a evolução molecular de AAV.

Nós demonstramos a base técnica para projetar e evoluir molecularmente sintéticos virais adeno-associados (AAV) vetores de terapia genética através de DNA da família baralhar. Além disso, fornecer orientações gerais e exemplos representativos para a selecção ea análise de individuais cápsides quiméricos com propriedades melhoradas sobre células alvo em cultura ou em ratinhos.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Os vetores virais adenoassociados (AAV) representam alguns dos veículos mais potentes e promissores para a transferência gênica terapêutica em humanos devido a um...

O objetivo geral do experimento a seguir é criar uma biblioteca altamente diversificada de capídeos virais adeno-associados sintéticos, a partir da qual partículas com uma propriedade desejada possam ser selecionadas. Isso é alcançado primeiramente fragmentando, clonando e selecionando genes de capídeo de aav por meio de digestão controlada de DNA com enzima de restrição, permitindo sua subsequente recombinação em sequências quiméricas por meio de duas reações de PCR. Como segundo passo, o produto de PCR resultante é clonado de volta em um vetor de aav com capacidade de replicação, gerando uma biblioteca de plasmídeos que compreende pelo menos 1 milhão de genes diferentes de capídeo de aav.Em seguida, esta biblioteca de plasmídeos é transfectada em células 293T, juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral, a fim de produzir uma biblioteca de vírus quiméricos que possa então ser seleccionada em células-alvo ou em animais. Os resultados demonstram a engenharia molecular bem-sucedida e a evolução de novos vetores sintéticos de AAV baseados na expressão melhorada ou mais específica de genes repórter em células cultivadas ou em camundongos adultos. A principal vantagem desta técnica

engineering-evolution-synthetic-adeno-associated-virus-aav-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Geração de biblioteca de exibição de peptídeos AAV e posterior validação através do código de barras de candidatos com novas propriedades para a criação de AAVs de próxima geração.

Isolamento de vetores de terapia gênica de próxima geração por meio de engenharia, código de barras e triagem de variantes do capsídeo do vírus adenoassociado (AAV)

Aqui, apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e validação de boas práticas laboratoriais na detecção aderente de vetores virais adenoassociados em lágrimas humanas por reação em cadeia da polimerase digital em gotículas em apoio ao desenvolvimento clínico de vetores de terapia gênica.

Um ensaio de reação em cadeia da polimerase digital validável em gotículas para a detecção de vetores virais adenoassociados em estudos de biosshedding de lágrimas

O vírus adenoassociado recombinante (rAAV) é amplamente utilizado para liberação clínica e pré-clínica de genes. Um uso subestimado para rAAVs é a transdução robusta de células cultivadas sem a necessidade de purificação. Para pesquisadores iniciantes no rAAV, fornecemos um protocolo para clonagem de transgênico, produção bruta de vetores e transdução de cultura celular.

Expressão de Transgenes em Células Cultivadas Usando Vetores Virais Adenoassociados Recombinantes Não Purificados

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Esse protocolo visa introduzir um método para produzir e purificar biomiméticos extracelulares derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) para terapia gênica. A nanovesícula é confinada com bicamadas lipídicas derivadas da MSC e encapsula AAVs recombinantes que carregam o gene de interesse no lúmen. Essa nanovesícula oferece um vetor aprimorado para a entrega de genes in vivo .

Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Aprenda a criar bibliotecas diversificadas de cápsides de AAV sintético usando DNA family shuffling. Este método permite a evolução molecular de vetores virais com propriedades aprimoradas para aplicações em terapia gênica.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

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