Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

O objetivo geral do experimento a seguir é criar uma biblioteca altamente diversificada de capídeos virais adeno-associados sintéticos, a partir da qual partículas com uma propriedade desejada possam ser selecionadas. Isso é alcançado primeiramente fragmentando, clonando e selecionando genes de capídeo de aav por meio de digestão controlada de DNA com enzima de restrição, permitindo sua subsequente recombinação em sequências quiméricas por meio de duas reações de PCR. Como segundo passo, o produto de PCR resultante é clonado de volta em um vetor de aav com capacidade de replicação, gerando uma biblioteca de plasmídeos que compreende pelo menos 1 milhão de genes diferentes de capídeo de aav.

Em seguida, esta biblioteca de plasmídeos é transfectada em células 293T, juntamente com um plasmídeo auxiliar adenoviral, a fim de produzir uma biblioteca de vírus quiméricos que possa então ser seleccionada em células-alvo ou em animais. Os resultados demonstram a engenharia molecular bem-sucedida e a evolução de novos vetores sintéticos de AAV baseados na expressão melhorada ou mais específica de genes repórter em células cultivadas ou em camundongos adultos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a exposição de peptídeos, é que a recombinação genética por DNA tem o potencial de alterar e melhorar simultaneamente múltiplas características do capsídeo do AAV, desde a ligação celular e o tráfego intracelular até a desencapsulação e a expressão gênica no núcleo.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de terapia gênica e virologia, como, por exemplo, como obter um vetor ideal para uma determinada aplicação terapêutica ou como identificar os domínios de um capsídeo viral responsáveis por uma propriedade específica. As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de múltiplas doenças humanas, incluindo infecções por patógenos virais, pois nosso método permite a evolução molecular de vetores A V que infectam de forma específica e potente células-alvo virais, como linfócitos T para o HIV ou hepatócitos para vírus da hepatite. Embora este método possa fornecer informações sobre a biologia do A V e possa ser utilizado para aprimorar vetores AV para terapia gênica.

Ele também pode ser facilmente aplicado a outras famílias gênicas de relevância básica ou aplicada, como fluorescência codificadora de dose, três repórteres, enzimas celulares ou proteínas envolvidas na interferência de RNA. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando estávamos tentando encontrar um bom vetor para transfectar fragmentos de camundongos adultos com genes terapêuticos e percebemos que todos os sorotipos virais adeno-associados (AV) naturalmente ocorrentes apresentavam desvantagens, tais como alta prevalência na população humana e, consequentemente, alta incidência de imunidade pré-existente, ou desempenho insatisfatório in vivo, apesar da eficiente transdução em cultura. A demonstração visual deste método é essencial, pois a fragmentação do gene da cápside viral baseada em DNA e algumas das etapas da produção da biblioteca viral são difíceis de aprender, pois exigem experiência e conhecimento das etapas críticas, a fim de facilitar a preparação rotineira de quantidades suficientes dos diversos genes da cápside viral adeno-associada.

Para a recombinação de DNA, esses genes são inicialmente subclonados em um vetor plasmidial comum. Para isso, os genes cap desejados são primeiramente amplificados por PCR a partir de plasmídeos AAV comumente disponíveis, utilizando os primers cap F e cap R. Os genes cap são então clonados em um plasmídeo projetado para conter sítios específicos de ligação de primers, bem como sítios de restrição. Neste exemplo, o gene cap é clonado nos sítios PAC um e SC um, que estão presentes nos primers utilizados para a amplificação de cap e no plasmídeo receptor, mas ausentes na maioria dos AAVs. Após a geração dos conjuntos de plasmídeos que codificam os genes da capa do AAV, inicia-se o procedimento de recombinação de cap por PCR, amplificando os genes cap escolhidos utilizando os primers T três e T sete.

Monte uma reação de PCR de 50 microlitros contendo 200 nanogramas de plasmídeo cap, cada iniciador numa concentração final de dois micromolares, 10 microlitros de tampão five x high five e um microlitro de polimerase high five. Esta reação produzirá cerca de três microgramas de produto de PCR, quantidade suficiente para até seis reações de shuffling, dependendo do número de genes cap a serem incluídos na biblioteca. Inicie com cinco minutos a 95 graus Celsius e, em seguida, execute 40 ciclos de 15 segundos a 94 graus Celsius, 30 segundos a 57 graus Celsius e três minutos a 68 graus Celsius, seguidos por uma etapa final de 10 minutos a 72 graus Celsius.

Após a purificação dos produtos de PCR, realiza-se uma digestão controlada de DNA para criar fragmentos do gene cap que serão rearanjados em Kyra. Um dos aspectos mais difíceis deste procedimento é obter uma faixa útil específica de fragmentos de DNA do gene cap digeridos para o rearrajo em kyras. Para alcançar esse objetivo, preparamos quantidades PLE de genes cap purificados desde o início e, em seguida, montamos múltiplas reações paralelas com condições variadas. Para preparar a digestão de forma uniforme, misture os diversos produtos de PCR do gene cap em uma quantidade total de quatro microgramas em 54 microlitros de água e, então, adicione cuidadosamente seis microlitros de tampão de reação DS e 0,5 microlitro de DNAse I à reação. Vortexe o tubo três vezes, centrifugue brevemente e coloque imediatamente em um bloco térmico a 25 graus Celsius.

Incube esta primeira reação por um minuto. Em seguida, prepare uma segunda reação de digestão, mas incube a 25 graus Celsius por um minuto e 15 segundos. Dessa forma, monte múltiplas reações paralelas com tempos de incubação entre um e dois minutos, variando o tempo de incubação em incrementos de 15 segundos.

Interrompa cada reação adicionando seis microlitros de EDTA 25 milimolar. Vortexe brevemente o tubo e incube por 10 minutos a 75 graus Celsius. As múltiplas reações paralelas resultarão em cinco amostras de cap digeridas com DNAs, uma para diferentes tempos de incubação, purificando os fragmentos de cap em um gel padrão de AROS 1%.

Idealmente, uma mancha deve ser visível entre 100 e 500 pares de bases, como mostrado neste exemplo com tempos de incubação de um minuto, 45 segundos ou dois minutos no início. A recombinação por DNA familiar dos fragmentos cap é inicialmente realizada, montando-os novamente em sequências completas por meio de uma PCR na qual eles se autoprimeriam com base em homologias parciais. Prepare uma reação de 50 microlitros com 500 nanogramas de fragmentos purificados, 10 microlitros de tampão 10x de fusão, um microlitro de dNTPs 10 milimolares, 1,5 microlitros de DMSO e 0,5 microlitros de fusão.

Duas polimerases são incubadas por 30 segundos a 98 graus Celsius e, em seguida, realizam-se 40 ciclos de 10 segundos a 98 graus Celsius, 30 segundos a 42 graus Celsius e 45 segundos a 72 graus Celsius, seguidos por um passo final de 10 minutos a 72 graus Celsius. Em seguida, amplifique os genes do capsídeo remontados para clonagem subsequente por uma segunda PCR utilizando primers que se ligam às sequências conservadas flanqueantes. Por exemplo, SAF e SAR ou CUF e CUR montam uma reação de 50 microlitros contendo dois microlitros da primeira PCR, cada primer numa concentração final de dois micromolares, 0,5 microlitros de cloreto de magnésio, 10 microlitros de tampão cinco x high-FI e um microlitro de polimerase high-FI.

Recomenda-se realizar de 16 a 24 PCR para garantir rendimentos suficientemente altos para a clonagem subsequente. Após reunir os produtos de PCR e purificar a banda completa do cap, o próximo passo é digerir o pool purificado do gene cap com PAC I e SC I para clonagem em um plasmídeo AAV com capacidade de replicação. O plasmídeo receptor possui repetições terminais invertidas do AAV delimitando o gene rep do AAV2 sob controle do promotor P5 do AAV, além dos sítios PAC I e ASC I.

Os sítios de restrição localizados a jusante de rep permitem a clonagem em quadro de leitura do conjunto de cap shufflado. Os sítios de ligação do iniciador LSE indicados por setas são úteis para o sequenciamento do gene cap, digira os fragmentos de cap e o esqueleto do plasmídeo receptor cortado apropriadamente em uma proporção molar de três para um. Prepare uma mistura-mestra com volume total de 40 microlitros, suficiente para 20 transformações, com concentração final de DNA de 15 nanogramas por microlitro.

Incubar durante a noite a 16 graus Celsius no dia seguinte, transformar a reação de ligação em e coli. Misturar dois microlitros da reação de ligação com 30 microlitros de e coli eletrocompetente e transferir para cubetas de eletroporação previamente resfriadas em gelo; eletroporar a 1,8 quilovolts, 200 ohms e 25 microfarads. A constante de tempo deve ser próxima a cinco milissegundos; adicionar imediatamente um mililitro de meio SOC pré-aquecido e transferir para um frasco de 250 mililitros.

20 dessas eletroporações produzirão uma biblioteca com uma diversidade de cerca de um vezes 10 elevado a seis clones diferentes. Adicione um volume de meio SOC pré-aquecido às transformações agrupadas e agite a 37 graus Celsius e 180 RPM por uma hora. Em seguida, adicione 40 mililitros das transformações agrupadas a 800 mililitros de meio LB contendo ampicilina e incube por mais 16 horas nas mesmas condições; então, o DNA plasmidial da biblioteca é purificado utilizando um kit comercialmente disponível.

A produção da biblioteca viral começa com a transfeção de células HEC 2 9 3 T com a biblioteca a a v. Para iniciar este procedimento, semeie placas quadradas de 10 a 15 centímetros de células HEC 2 9 3 T e cultive-as por 48 horas a 37 graus Celsius. Para cada transfeção, prepare as seguintes duas misturas de reagentes em dois tubos separados. As quantidades a seguir são dadas por 10 placas no primeiro tubo.

Misture 7,9 mililitros de cloreto de sódio e DNA e adicione água até um volume total de 15,8 mililitros. No segundo tubo, adicione 3,52 mililitros de polietilenoamina, 7,9 mililitros de cloreto de sódio e 4,38 mililitros de água. Combine as misturas, vortexie e incube por 10 minutos à temperatura ambiente, distribuindo a solução uniformemente em cada placa de células HEK 293T. Incube a 37 graus Celsius.

Após 48 horas, a biblioteca viral pode ser coletada. Raspe as células para o meio, reúna as células de todos os recipientes em um único tubo e centrifugue a 1200 RPM durante 15 minutos. Re-suspenda o pellet celular em seis mililitros de tampão de lise e, em seguida, submeta a cinco ciclos de congelamento-descongelamento; após os cinco ciclos, incube com Benonase por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, centrifugue os detritos celulares a 3.750 RPM durante 20 minutos. Prepare um gradiente para purificação por gradiente de densidade utilizando uma pipeta Pasteur para adicionar cinco mililitros de suspensão viral a um tubo de centrífuga Beckman Quick-Seal, seguido de 1,5 mililitro de cada solução de sacarose 15%, 25% e 40%. Complete o gradiente com tampão de lise e ultracentrifugue a 50.000 × g por duas horas a quatro graus Celsius.

Após a conclusão da ultracentrifugação, retire o tubo do rotor e limpe a parte externa do tubo com etanol a 70%. Introduza uma agulha no topo do tubo para ventilação e utilize outra agulha para retirar 1,2 mililitros da fração de 40% IOL. Tenha cuidado para evitar a retirada da fração de 25%, pois ela contém partículas vazias.

Os capsídeos AAV. Clones individuais da biblioteca original de plasmídeos são analisados quanto à sua funcionalidade e diversidade ao utilizá-los para produzir vetores recombinantes. Células cultivadas ou animais que expressam um gene repórter são então infectados com diferentes quantidades do vírus purificado e a eficiência de transdução é determinada.

Mostram-se aqui resultados de microscopia de fluorescência de três linhagens celulares humanas infectadas com cinco vetores recombinantes diferentes expressando YFP com genes cap reorganizados. Um método alternativo para analisar a eficiência de transdução é a medição baseada em fatos da expressão do gene repórter fluorescente. Esta figura mostra um resultado típico de quatro tipos celulares, rim humano, colo do útero humano, fibroblastos murinos e linfócitos T humanos, infectados com 18 vetores recombinantes diferentes expressando YFP com genes cap reorganizados, selecionados aleatoriamente a partir de uma biblioteca original.

A expressão de YFP foi codificada por cores para facilitar a visualização. Os percentuais representados correspondem às células transduzidas, em que o preto indica 0% e o branco indica o número mais alto medido em cada clone do tipo celular. O clone B dois vermelho exemplifica um clone com baixa eficácia geral, como pode ser esperado de capídeos não selecionados. A seguir, a biblioteca viral pode ser triada em busca de partículas individuais que exibam a maioria ou todas as propriedades desejadas em uma linhagem celular específica ou em animais, para seleção.

Em células cultivadas, as células são primeiramente co-infectadas com várias alíquotas da biblioteca e vírus ENO cinco para suportar um crescimento a a v, então as células são colhidas e o a a v amplificado é extraído e usado para reinfectar novas células. A determinação das proporções ideais de adenovírus a a v para a co-infecção de células é importante, e uma boa medida de infecção potente por arius é a ocorrência de efeitos citopáticos três dias após a inoculação do vírus, evidenciada pelo arredondamento e destacamento celular. Nesta figura, o painel superior esquerdo mostra células não infectadas, enquanto os outros painéis mostram células infectadas com as quantidades indicadas em partículas por célula de adenovírus. Outro indicador útil para infecção e amplificação de a a v é a detecção de proteínas do capsídeo por meio de western blotting utilizando o anticorpo B um, que reconhece um epítopo altamente conservado do capsídeo de a a v.

O blot à esquerda mostra células co-infectadas com diversos volumes em microlitros de uma biblioteca a a V e vírus auxiliar ENO. As duas primeiras linhas são bons exemplos de condições que resultam em expressão de proteína a a v mal detectável, indicando infecção e amplificação de a a v suficientes, mas não excessivas, e, portanto, uma ligação desejável entre genótipo e fenótipo. Assim, 0,11 ou 10 microlitros desses sobrenadantes foram utilizados para reinfecção de células frescas.

Os resultados do western blot são mostrados nas células à direita. Em LA, c foram infectadas com um v isolado como controle negativo. Também é fundamental monitorar a diversidade da biblioteca durante rodadas repetidas de infecção por meio de sequenciamento de DNA.

Este diagrama mostra as comparações das sequências de proteínas de clones de AAV a partir de uma biblioteca baseada nos AAV dois, oito e nove, antes e após a seleção. As sequências acima da linha vermelha mostram os AAV parentais. As setas roxas indicam eventos de recombinação homóloga. A seta vermelha marca uma troca entre o AAV dois e o AAV nove, observada em todos os clones selecionados. Para a seleção em animais, a biblioteca de a a V é infundida nos animais, recuperada das células ou tecidos-alvo por PCR e, em seguida, reciclada e reempacotada para uma nova rodada de infecção.

Mostrado aqui está um exemplo de resgate de clones de vírus AAV com infecção bem-sucedida a partir de fígados de camundongos uma semana após a infusão periférica da biblioteca. A linha um mostra a banda esperada de 2,2 quilobases, enquanto a linha dois é um controle sem molde; os tamanhos das bandas do marcador de DNA na linha M são indicados em quilobases. Independentemente do procedimento de seleção, a variância do capsídeo enriquecida deve, em última instância, ser validada em sistemas apropriados.

Um exemplo do desempenho superior de um címera a a V enriquecido em células cultivadas é mostrado aqui. Cores mais escuras indicam maior infectividade por número de partículas, portanto por clone. O A-A-V-D-J supera uma coleção de oito tipos selvagens naturais a a v em uma ampla variedade de linhagens celulares.

Por fim, é apresentada uma análise de um clone de AAV KYMERA selecionado no fígado de camundongo. Um AAV DN foi selecionado por meio da reflexão em células de hepatoma e então utilizado para produzir vetores recombinantes expressando luciferase, conforme mostrado em nossos camundongos representativos, três por grupo, uma semana após a infusão periférica de doses iguais desse vetor ou de um controle baseado no AAV selvagem oito, um dos isolados naturais mais potentes conhecidos no fígado de camundongo. Observe que, embora o clone de AAV DN apresente ligeiramente menos expressão geral no fígado, ele é mais específico para este órgão, pois exibe uma desvio de alvo substancialmente menor em tecidos não hepáticos, uma vez que os níveis de expressão no fígado foram ajustados por meio do software de imagem.

Essa técnica pode ser realizada em uma semana, começando com a amplificação dos genes do capsídeo de AV e terminando com a biblioteca viral, caso seja executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o protocolo fornecido aqui foi derivado de nossas experiências com a seleção de sorotipos naturais de AV e que é bem possível que algumas das condições precisem ser adaptadas e ajustadas quando outros usuários estiverem criando suas próprias bibliotecas personalizadas. Além deste procedimento, outros métodos, como a exibição de peptídeos com direcionamento por sítio usando AGENESIS ou randomização baseada em PCR, podem ser realizados para gerar também bibliotecas altamente diversas ou para tentar melhorar ainda mais as propriedades dos capsídeos que foram criados e enriquecidos utilizando a recombinação familiar de DNA após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de entrega gênica viral explorarem estratégias terapêuticas para doenças e células-alvo relacionadas, para as quais os tipos convencionais de A VC apresentaram resultados insatisfatórios, como infecção por HIV e células T, bem como para explorar a transferência gênica baseada em vetor em células-tronco humanas e outros tipos celulares para infectar células em cultura. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como projetar e evoluir bibliotecas altamente diversas de vetores virais adeno-associados sintéticos utilizando uma combinação de fragmentação gênica e rearregamento, bem como de como selecionar essas bibliotecas de forma criteriosa em células cultivadas ou em animais, a fim de enriquecer capídeos individuais com propriedades específicas desejadas para utilização como vetores de transferência gênica. Não se esqueça de que trabalhar com adenovírus pode ser perigoso e muitas precauções devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.