Name: Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a estababelecer um sistema de cultura primária de neurônios para estudar a latência e reativação do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Este método permite investigar interações vírus-neurônio em nível molecular.

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Agradecemos aos revisores por suas sugestões inteligentes que ajudaram a melhorar este manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões para MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) do NIH. MK foi apoiado em parte por um treinamento NIH subvenção (5T32 AI007180).

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<li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li>
<li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).</li>
<li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation%3A+resistance+maps+to+the+UL6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li>
<li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138%3A+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li>
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<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
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<li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li>
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<li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li>
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<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta cultura neurônio primário e sistema de infecção fornece um método simples e eficaz para explorar os mecanismos moleculares subjacentes HSV-1 latência e reativação. O sistema fielmente recapitula as características aceitas de latência definidos em ambas as infecções humanas e em modelos de animais vivos. Quando o vírus é latente nas culturas SCG, partículas virais infecciosas e produtos de genes líticas não pode ser detectado. O produto do gene virai detectado apenas em neurónios latentemente infect...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 70μm nylon filtro (coador de celular) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Solução 1x Salina Equilibrada de Hank (HBSS - / -) </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> w / o CaCl 2 e MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1x mínimos Mídia Essenciais (MEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11095-080 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desoxiuridina </td><td> Sigma </td><td> F0503 </td><td> preparar 20 mM em 1x MEM; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 96-bem planas bem fundo placas TC </td><td> Corning </td><td> 3599 </td><td></td></tr><tr><td> Aciclovir </td><td> &lt;em&gt; Calbiochem </td><td> 114798 </td><td> preparar 31 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Afidicolina </td><td> Calbiochem </td><td> 178273 </td><td> preparar 10 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> B-27 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-44 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma </td><td> C2674 </td><td> preparar 10 mg / ml em HBSS estoque - / -; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> D-(+)-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> preparar estoque 40% em H 2 O; filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> A laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td><td> preparar 1 mg / ml em estoque H 2O; rápido a congelar 20 laliquats e armazenar a -80 ° C; diluído para 2 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O </td></tr><tr><td> Leibovit&#39;z meio L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Fator de Crescimento do Nervo </td><td> Harlan Laboratories </td><td> BT.5017 </td><td> preparar 50 ug / ml em HBSS estoque - / -; armazenam a -80 ° C </td></tr><tr><td> Médio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfonoacético ácido (PAA) </td><td> Sigma </td><td> P6909 </td><td> preparar 75 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina bromidrato </td><td> Sigma </td><td> P0899 </td><td> preparar 20 mg / ml estoque em H2O; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rat-tail de colágeno </td><td> Millipore </td><td> 08-115 </td><td>Concentração varia com o lote de abastecimento; Armazenar a 4 ° C e diluída para 0,66 mg / ml conc de trabalho. em estéril de H2O </td></tr><tr><td> Tricostatina A </td><td> Sigma </td><td> T8552 </td><td> preparar 1 mM em DMSO; armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Tripsina 2,5% </td><td> Invitrogen </td><td> 15090-04 </td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema de cultura primária neuron para o estudo da herpes simplex virus latência e reativação

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus tipo-1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida em neurónios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de eventos de reactivação recorrentes que assegurar a transmissão e contribuir para doença clínica. Antivirais atuais não impactar o reservatório latente e não existem vacinas. Embora os detalhes moleculares de replicação lítica são bem caracterizados, mecanismos de controle de latência nos neurônios permanecem ainda desconhecidos. A nossa compreensão actual de latência é derivado a partir de estudos in vivo utilizando modelos animais pequenos, que têm sido indispensáveis ​​para definir os requisitos de genes virais e do papel de respostas imunes. No entanto, é impossível distinguir efeitos específicos sobre a relação vírus neurónio-a partir de consequências mais gerais de infecção mediada por células de suporte imunes ou não-neuronais em animais vivos. Além disso, a experimentação animal é dispendiosa, morosa, e limitado em termos de opções disponíveis para a manipulação de acolhimentoprocessos. Para superar essas limitações, um sistema de neurônios-só é desesperadamente necessário que reproduz a características in vivo de latência e reativação, mas oferece os benefícios da cultura de tecidos em termos de homogeneidade e de acessibilidade. Apresentamos aqui mais um modelo in vitro utilizando culturas de neurónios simpáticos primárias a partir de gânglios rato cervical superior (SCG) (Figura 1) para estudar o HSV-1 latência e reactivação que se encaixa se não de todos os critérios desejados. Depois de eliminar células não-neuronais, perto homogéneos TrkA culturas + de neurónios são infectadas com HSV-1 na presença de aciclovir (ACV) para suprimir a replicação lítica. Remoção ACV seguinte, não produtivos HSV-1 infecções que exibem características fielmente aceites de latência são eficientemente estabelecida. Notavelmente, os mRNAs líticas, proteínas, e vírus infeccioso tornar-se indetectável, mesmo na ausência de selecção, mas a latência associada transcrição (LAT) expressaion persiste em núcleos neuronal. Genomas virais são mantidas a um número de cópias médio de 25 por neurónio e podem ser induzidas a produtivamente replicar por interferir com PI3-quinase / sinalização Akt ou a retirada simples do factor de crescimento do nervo 1. Um recombinante HSV-1 EGFP codificação fundido com a proteína viral lítica US11 fornece um funcional, marcador de tempo real para a replicação resultante da reactivação que é facilmente quantificado. Além disso a tratamentos químicos, as metodologias genéticas tais como a entrega de RNA-interferência ou gene através lentivirais pode ser aplicado com sucesso para o sistema que permite estudos mecanísticos que são muito difíceis, se não impossível, em animais. Em resumo, a SCG baseado HSV-1 sistema de latência / reativação fornece uma poderosa ferramenta necessária para desvendar os mecanismos moleculares que controlam HSV1 latência e reativação de neurônios, um enigma de longa data em virologia cuja solução pode oferecer novas perspectivas no desenvolvimento de novas terapias que alvo tele latente reservatório herpesvírus.

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

O vírus do herpes simples tipo 1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente vitalícia em neurônios periféricos. Este reservatório latente é a fonte de recorrências...

O objetivo deste experimento é demonstrar como um sistema de cultura celular de neurônios primários pode ser utilizado para estudar a latência e reativação do vírus herpes simples. Isso é conseguido primeiramente isolando neurônios de gânglios cervicais superiores de embriões RA e cultivando os neurônios isolados de gânglios dissociados após a eliminação das células não neuronais. Uma infecção latente por HSV é estabelecida usando um vírus EGFP para infectar os neurônios na presença de um inibidor da replicação lítica.O próximo passo é induzir a reativação das culturas infectadas latentes. Por fim, a eficiência da reativação é avaliada por meio do monitoramento da expressão de EGFP ao longo do tempo. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram como diferentes vias de sinalização neuronal regulam a latência e a reativação do vírus da herpes simples por meio do uso de inibidores químicos, interferência de RNA e entrega de genes.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite estudos detalhados das interações que regulam a latência do herpesvírus simplex florestal no neurônio hospedeiro ao nível molecular. Este método pode ajuda

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

A maioria dos estudos de doença herpética corneal utilizar um modelo de infecção primária. No entanto, a infecção primária por HSV-1 normalmente não conduzem à doença humana. Aqui nós descrevemos um modelo recorrente de doenças da córnea herpética, que mais imita a doença humana.

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Fonte: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purificação de DNA viral para a Identificação de Proteínas Virais e Celulares Associadas. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a infecção de células de mamíferos em fase estacionária com HSV-1 (Vírus do Herpes Simples-1), seguida pela replicação do genoma viral utilizando a maquinaria de replicação do hospedeiro e do próprio vírus. Um análogo sintético de nucleosídeo é incorporado ao DNA viral recém-sintetizado para rotular os genomas em replicação, os...

Marcação de Genomas de HSV-1 em Replicação com um Análogo de Nucleosídeo

Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.

De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

A pele é um tecido-alvo do patógeno humano vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Para explorar a rota de invasão do HSV-1 no tecido, estabelecemos um modelo de infecção ex vivo de lâminas epidérmicas murinas que representam a camada mais externa da pele.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

É fundamental em neurobiologia e neurovirologia ter um sistema in vitro confiável e replicável que sirva como um modelo translacional para o que ocorre in vivo em neurônios humanos. Este protocolo descreve como cultivar e diferenciar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios viáveis para uso em aplicações in vitro.

A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.

Rato adulto DRG explantes e dissociado de modelos de célula para investigar neuroplasticidade e respostas aos insultos ambientais incluindo infecção Viral

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Este protocolo descreve um sistema in vitro para modelar a infecção lítica de novo do herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi usando vírions derivados de BAC16. O método permite a investigação da replicação e disseminação viral precoce. A produção de vírus infecciosos é quantificada por ensaios de unidades infecciosas baseados em GFP e PCR em tempo real de genomas virais encapsulados.

Estabelecimento e quantificação da infecção lítica de novo pelo herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi livre de células

Aprenda a estababelecer um sistema de cultura primária de neurônios para estudar a latência e reativação do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Este método permite investigar interações vírus-neurônio em nível molecular.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

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