Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

O objetivo deste experimento é demonstrar como um sistema de cultura celular de neurônios primários pode ser utilizado para estudar a latência e a reativação do vírus do herpes simples. Isso é realizado primeiramente isolando neurônios dos gânglios cervicais superiores de embriões RA e cultivando os neurônios isolados de gânglios dissociados após a eliminação das células não neuronais. Uma infecção latente por HSV é estabelecida utilizando um vírus EGFP para infectar os neurônios na presença de um inibidor da replicação lítica.

O próximo passo é induzir a reativação das culturas infectadas latentes. Por fim, a eficiência da reativação é avaliada por meio do monitoramento da expressão de EGFP ao longo do tempo. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram como diferentes vias de sinalização neuronal regulam a latência e a reativação do vírus do herpes simples por meio do uso de inibidores químicos, interferência de RNA e entrega gênica.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite estudos detalhados das interações que regulam a latência do herpes simples florestal no neurônio hospedeiro ao nível molecular. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da latência do herpes simples florestal, como quais são os sinais que atuam na repressão do genoma latente e como a reativação é desencadeada ao nível molecular? Em neurônios, embora este método possa fornecer insights sobre a latência do HSV-1.

Também pode ser aplicado a outros alfa-herpesvírus neurotróficos. Demonstrarão o procedimento Marigo, Kochi e Julian Kim, todos estudantes de pós-graduação em nossos laboratórios. Os gânglios cervicais superiores ou neurônios SCG, para este protocolo, são isolados de filhotes de rato E21 removidos do útero de uma rata prenhe. Trabalhando em uma câmara de dissecação, sacrifique cada filhote direcionando a tesoura para a base do pescoço logo acima dos ombros e seccionando a cabeça do tronco. Para expor os gânglios, utilize agulhas de calibre 23 para fixar a cabeça, com o pescoço voltado para cima, em três locais.

Primeiro, fixe a medula espinhal. Segundo, puxe a pele anterior sobre o nariz e fixe-a com um alfinete, e terceiro, fixe o esôfago e a traqueia afastando-os da parte posterior do pescoço. Procure o GCS localizando a bifurcação da artéria carótida.

A artéria carótida é uma estrutura pareada. Existem duas bifurcações em cada lado do pescoço, portanto dois CGS s por pop. O CGS está localizado logo abaixo do ramo.

Se pare o GCS das artérias puxando a bifurcação apartir pelas duas extremidades. O GCS é translúcido e incolor em comparação com o tecido adiposo opaco e amarelado que envolve a bifurcação. Coloque os gânglios em 12 mililitros de L 15.

Meio suplementado com glicose em um tubo cônico de 15 mililitros sobre gelo. Após todos os gânglios cocleares superiores serem coletados dos embriões e puxados suavemente, centrifugue os gânglios por um minuto. A 600 RPM, remova o meio em excesso Reese.

Suspenda os gânglios em um mililitro de L 15. Meio contendo tripsina e colagenase. Incube por 24 minutos a 37 graus Celsius.

Agite a cada oito minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio marinho para inativar a centrifugação com tripsina por um minuto. A 600 RPM, remova o máximo possível do meio de colagenase com tripsina e lave os gânglios com 10 mililitros de meio C, centrifugando por um minuto a 600 RPM.

Repita esta lavagem uma vez. Remova o meio de lavagem e ressuspenda os gânglios em um mililitro de meio C para dissociar, triturando com uma agulha de 21 gauge acoplada a uma seringa de cinco mililitros por no máximo 15 ciclos de aspiração e expulsão. Conclua a trituração usando uma agulha de 23 gauge até que a maioria dos agregados tenha se dissociado.

Remova quaisquer aglomerados remanescentes de células filtrando os neurônios dissociados através de um filtro de náilon de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros. Retire uma alíquota de 10 microlitros da suspensão celular filtrada, misture com triam azul para determinar o número de células vivas. Conte o número de células que excluem ativamente o corante utilizando um hemocitômetro.

Em seguida, distribua de 5.000 a 6.000 células vivas totais em 100 microlitros de meio C em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços previamente revestida com colágeno e laminina, incluindo 50 nanogramas por mililitro de fator de crescimento nervoso no meio C. Incube durante a noite a 37 graus Celsius e, no dia seguinte, no primeiro dia in vitro (DIV um), verifique a correta adesão dos neurônios e o crescimento de algumas projeções axonais.

Substitua o meio C nos poços por 50 microlitros de meio neurobasal ou NBM contendo NGF Acho e cinco fluoro dois doxi uridina. Substitua o meio uma fileira por vez para garantir que as células não sequem. Incube as culturas a 37 graus Celsius por cinco dias.

Monitore a cultura diariamente para confirmar a morte das células não neuronais e o crescimento dos neurônios. Para iniciar esta parte do procedimento no sexto dia in vitro, verifique se a maioria das células de suporte não neuronais foi eliminada. É extremamente importante minimizar ao máximo a manipulação física desnecessária do neurônio em todos os momentos.

A remoção e substituição do meio devem ser feitas de maneira muito cuidadosa e lenta, pois o estresse mecânico resultante pode afetar a viabilidade dos neurônios. Adicione aciclovir ou um CV ao meio existente em cada poço até uma concentração final de 100 micromolar. Adicione o CV lentamente e com cuidado para garantir que a força mecânica não afete negativamente as células no dia seguinte.

No DIP sete, infecte as culturas de GCS com um HSV um recombinante que expressa um repórter de EGF fundido à proteína lítica viral US 11, com uma multiplicidade de infecção entre um e dois. Adicione o vírus diluído diretamente ao meio existente no poço. Inclua um controle mock infectado e uma infecção lítica.

Controle positivo em meio sem CV. Deixe a infecção prosseguir por duas a três horas a 37 graus Celsius. Em seguida, substitua o meio de infecção por NBM fresco contendo NGF e um CV. É fundamental ser extremamente cuidadoso ao trocar o meio de infecção. Incline a placa em sua direção e remova lentamente o meio do fundo do poço.

Em seguida, direcione a ponta da pipeta para a parede do poço, e não para o fundo do poço, e permita que o meio escorra suavemente sobre as células. Substitua uma fileira de meio de cada vez para evitar que as células sequem. Retorne as culturas ao incubador, manipulando-as com o máximo de cuidado possível para não comprometer a capacidade de manter a latência do HSV-1.

Mantenha as culturas por seis dias a 37 graus Celsius, período durante o qual o vírus estabelecerá latência. Durante este período, utilize um microscópio fluorescente para monitorar a expressão de us11 EGFP como indicador de replicação lítica.

Como esperado, não deve haver expressão de GFP no controle infectado com placebo. O S 11 EGFP deve ser detectado apenas na infecção. Poços do controle positivo sem tratamento com CV indicam infecção primária bem-sucedida e replicação lítica produtiva.

Para avaliar a reativação no D.I.V. 14, substitua cuidadosamente o meio contendo CV por meio fresco sem CV, como anteriormente. Direcione a ponta da pipeta para a parede do poço, e não para o fundo, e permita que o meio escorra suavemente sobre as células, se apropriado. Inclua variáveis farmacológicas ou biológicas, como LY 2 9 0 0 4 a 20 micromolar.

Nenhuma expressão de GFP deve ser detectada nas culturas infectadas latentes tratadas com A CV. Retorne as células a 37 graus Celsius durante um período de cinco a seis dias. Monitore as culturas vivas usando um microscópio fluorescente para detectar neurônios que estejam passando por reativação.

A frequência de reativação é calculada contando o número de poços contendo neurônios positivos para EGFP e expressando esse valor como uma proporção do número total de poços da amostra. Esta figura ilustra um exemplo em que a estatina gatilho, um indutor conhecido de reativação, é aplicada em culturas de GCS infectadas tardias. A reativação foi monitorada e pontuada usando microscopia de fluorescência a cada dia após o tratamento com o fármaco, durante um período de cinco dias.

Com a reativação por TSA, atinge-se 50% do máximo em dois dias; em cinco dias, a reativação atinge 60% da linha de base ou reativação espontânea representada pelo DMSO. Os cultivos-controle tratados são de aproximadamente 10% neste experimento e geralmente variam entre 5% e 20% utilizando este sistema in vitro. Posteriormente, os cultivos de GCS infectados também foram tratados com LY 2 9 0 0 4.

Culturas com reativação induzida por LY, um indutor conhecido, foram comparadas às tratadas com o inibidor da síntese de DNA viral, ácido fosfonacetico (PAA), e aos dois compostos juntos, conforme ilustrado aqui. A expressão de US 11 EGFP é prejudicada pelo PAA em culturas induzidas à reativação com LY 2 9 4 0 0 2, indicando que a expressão de US 11 EGFP depende da replicação do DNA viral. Ao tentar este procedimento, é importante prestar muita atenção à técnica estéril e manipular a cultura de GC com a maior delicadeza possível para evitar aumento da reativação espontânea induzida por estresse ou movimentos mecânicos. Após seguir este procedimento para estabelecer infecções latentes pelo HSV tipo 1 em neurônios cultivados, outros métodos, como o silenciamento por S-H-R-N-A e a expressão ectópica de genes selvagens e mutantes, podem ser realizados para caracterizar as funções neuronais que regulam a latência e a reativação do HSV tipo 1.

Não se esqueça de que o HSV tipo 1 é um patógeno humano que exige precauções de segurança de nível PSL dois. Você deve estar familiarizado com o trabalho em condições de PSL dois antes de realizar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer culturas de GCS para configurar infecções latentes pelo HSV tipo 1 e como induzir efetivamente a reativação nos neurônios.