Name: Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a modelar a metástase do câncer de ovário usando esferoides multicelulares e monocamadas de células mesoteliais com microscopia de fluorescência. Este ensaio in vitro permite quantificar a invasão celular em tempo real.

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Gostaríamos de agradecer a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School, Waters especificamente Jennifer, Lara Petrak e Salmon Wendy, à formação e à utilização de microscópios seus timelapse. Gostaríamos também de agradecer a Rosa Nunes e Achim Besser pelas valiosas discussões. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant 5695837 (para M. Iwanicki) e GM064346 a JSB; por uma concessão do Dr. Miriam e G. Sheldon Adelson Medical Research Foundation (para ICC).

1. Ovarian Cancer Formação Spheroid celular <ol><li> RFP-expressando células cancerosas do ovário são cultivadas em meio de base de 10% (um meio de cultura de célula personalizado contendo uma mistura 50:50 de 199 e MCDB105, 10% de soro bovino fetal inactivado e 1% pen-strep). Para expressar RFP em células cancerosas do ovário não marcados, transfectar as células com um plasmídeo contendo RFP e seleccionar para células que expressam RFP. Alternativamente, os vectores virais podem ser usados ​​para expressar as proteínas fluorescentes transitoriamente, ou as células podem ser pré-incubar com um vermelho fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen). </li><li> Antes da formação de esferóides de cancro do ovário, é necessário preparar-adesão baixa 96 pratos de cultura de fundo redondo bem. Para produzir as placas de aderência baixa de cultura, 30μl poli-HEMA (6mg polyhydroxyethylmethacrylate em 1 ml de 95% EtOH) solução é adicionada a cada poço de uma bem Corning 96 prato de cultura de células. As placas de 96 poços são incubadas em um 37 ° C não-umidificado incubadora para evaporar o etanol, leaving uma película de poli-HEMA em cada poço. Esta película de poli-HEMA impede que as células se liguem ao fundo do poço, forçando as células a crescer em suspensão 18. [Alternativamente, Ultra-Low placas de fixação de cultura (Corning) pode ser usado em vez de poli-HEMA pratos revestidos.] </li><li> Após os de baixa aderência placas de cultura são preparados, trypsinize uma placa de células de ovário, cancro, sedimentar as células em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900 RCF durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e re-suspender em meio de base de 10%. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Ajustar a concentração de tais células que existem 100 células por 50 l de meio de base de 10%. </li><li> Adicionar 50 l da suspensão de células em suspensão uniformemente diluído a cada poço da placa de cultura de 96 poços de poli-HEMA revestido. </li><li> Incubar a placa de 96 poços em um 37 ° C incubador de cultura de células durante 16 horas (esta quantidade de tempo deve ser aumentada ou diminuída dependendo da quantidade de tempo que leva parauma linha de células particular para formar esferóides multicelulares ou desejado condições experimentais) para permitir que as células de cancro do ovário a agrupar em conjunto, formando um único esferóide multicelular em cada poço. Algumas células tumorais podem sofrer apoptose durante este período, por isso, é importante escolher um tempo anterior à indução de apoptose. </li></ol> 2. Formação de monocamada celular mesotelial <ol><li> Em um capuz de cultura de células, de pré-revestimento dos poços de uma 6 bem prato MatTek com fundo de vidro com fibronectina por adição de 2 mL de uma fibronectina 5μg / ml de solução PBS a cada poço do prato e incubando à temperatura ambiente durante 30 minutos. A qualidade óptica do vidro de fundo em pratos MatTek permitir a alta resolução de imagem microscópica. </li><li> GFP-expressando células mesoteliais são cultivadas em meio de base de 10%. Trypsinize uma placa de células mesoteliais, girar em uma centrífuga de mesa (Heraeus) a 900RPM por 3 minutos, aspirar o sobrenadante, e re-suspensão em meio base de 10%. Océlulas mesoteliais aqui utilizados foram já expressando GFP quando eles foram obtidos, mas não marcados células mesoteliais podem ser produzidos por transfecção com um plasmídeo contendo ADNc de GFP, ou pré-incubação das células em um verde fluorescente de células rastreador corante (Invitrogen). </li><li> Após a incubação a fibronectina de 30 minutos (no passo 2.1), lavar os poços do prato MatTek com 2mL de PBS. </li><li> Aspirar o PBS e placa de 6 x10 5 de células mesoteliais por poço em cada poço do prato MatTek 6 bem. Incubar o prato MatTek em um 37 ° C incubador de cultura de células durante a noite para permitir que as células mesoteliais para anexar o prato e formam uma monocamada. </li></ol> 3. Ensaio Apuramento mesotelial celular <ol><li> Use uma pipeta para coletar os esferóides de câncer de ovário a partir da placa de 96 poli-HEMA bem revestido. </li><li> Aspirar o meio a partir de um poço do prato MatTek 6 poços contendo uma monocamada de células mesoteliais. Lavar uma vez com 2 ml de PBS. Adicionar todos os esferóides a partir do 96 bem ptarde para um poço de o prato MatTek (~ o ​​número 3x de esferóides que vão a ser trabalhada a conta para a aterragem esferóides por parte do prato que não pode ser trabalhada). </li><li> Coloque o prato MatTek com a fase de um microscópio de fluorescência invertido Widefield capaz de realizar lapso de tempo de imagem para a duração de pelo menos 8 horas. Use um palco motorizado para posições de imagens múltiplas no prato, com múltiplos eventos de intercalação esferóides, em um único experimento. Usamos uma Nikon Ti-E Invertido Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse com Sistema de Foco integrado perfeita e baixo [abertura 20x 0,75-numérica (NA)] ampliação / diferencial NA interferência de contraste (DIC) óptica, um transiluminador de halogênio Nikon com 0,52 NA distância de trabalho longa condensador (DPM), Nikon rápido (&lt;100 milissegundos de comutação tempo) de excitação e emissão filtros (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter rápido transmissíveis Desligar e caminho de epifluorescência luz inteligenteters, uma Nikon fase linear codificado motorizado, um Hamamatsu ORCA-AG resfriado charge-coupled device câmera (CCD), uma custom-built câmara de incubação microscópio com a temperatura e CO controle 2, Nikon NIS Elements AR software versão 3, e um TMC mesa de isolamento de vibração. </li><li> As células de câncer de ovário esferóides vai assentar no fundo do prato e coloque a monocamada de células mesoteliais. Colete GFP, RFP e imagens de fase de 20 + esferóides / monocamada interações, a cada 10 minutos, por 8 horas. </li><li> Os RFP-expressam ovarianos esferóides de células cancerosas em invadir a monocamada de células GFP-expressando mesotelial criação de um buraco na monocamada. Após 8 horas, medir os tamanhos dos furos traçando os buracos negros nas imagens GFP utilizando elementos de software (ou outro software adequado, tal como J imagem). Normalizar o tamanho do furo para o tamanho inicial esferóide dividindo o tamanho do orifício de 8 horas com o tamanho do esferóide na imagem RFP correspondente no tempo zero. Neste examplo, o tamanho do buraco só foi medida uma vez, mas pode ser medido várias vezes ao longo da experiência de oito horas para entender melhor a dinâmica da intercalação. </li></ol> 4. Os resultados representativos Neste exemplo, comparou a capacidade de apuramento de mesotelial OVCA433 ovarianos esferóides de células cancerosas que têm expressão atenuada do talina-1 para controlar OVCA433 esferóides. OVCA433 esferóides de cada grupo foram adicionados a um prato MatTek contendo monocamadas de células mesoteliais ZT. Seis esferóides de cada grupo foram fotografadas a cada 10 minutos durante oito horas (Figura 4, Filme 3, Filme 4). Os furos produzidos na monocamada pelos esferóides de espalhamento foram medidos e seis posições de cada grupo foram em média. A Figura 4 mostra que a área média de apuramento criado por talina 1 esferóides knockdown era significativamente menor do que a área média criado por esferóides controle, sugerindo que é necessária para talina depuração por O mesotelialVCA433 câncer de ovário esferóides. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" /> Figura 1. Metástase do câncer de ovário. Tumores ovarianos desenvolver a partir do epitélio de superfície do ovário ou trompas de falópio. As células tumorais / clusters romper com o tumor primário e recolher na cavidade peritoneal. As células tumorais podem então agregam para formar esferóides multicelulares. Esferóides, em seguida, anexar as monocamadas de células mesoteliais que revestem a cavidade peritoneal. As células mesoteliais são excluídos por baixo do esferóide anexa do cancro do ovário, permitindo que os esferóides para obter acesso à membrana basal subjacente. Filme 1. Metástase do câncer de ovário. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Clique aqui para ver filme</a> . <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" /> Figura 2. </strOng&gt; linha células mesoteliais a superfície do tecido peritoneal humana e são excluídos por baixo implantes de células de cancro do ovário. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" /> Figura 3. Ensaio Apuramento mesoteliais. Esferóides de cancro do ovário são formadas por incubação 100 RFP-expressando células do ovário do cancro por poço em um poli-HEMA revestido prato de cultura de 96 poços de fundo redondo, a 37 ° C durante 16 horas. Poli-HEMA impede que as células se liguem ao prato de cultura, permitindo que as células permaneçam em suspensão e aderirem umas às outras para formar um único agrupamento por poço. Monocamadas de células mesoteliais são preparados por plaqueamento 6x10 5 células mesoteliais por poço em um fibronectina revestido 6 prato MatTek bem e incubando a placa a 37 ° C durante 16 horas. Os esferóides são então transferidos para o prato MatTek com a monocamada mesotelial e as duas populações de células são gravadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E Inverted Motorizado Widefield Microscópio de fluorescência time-lapse e software Elements. Filme 2. Ensaio Apuramento mesoteliais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Clique aqui para ver filme</a> . <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" /> Figura 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides diminui a capacidade de apuramento mesotelial. OVCA433 esferóides (vermelho) com e sem expressão atenuada do talina 1 foram autorizados a juntar-se e invadir em uma monocamada ZT mesotelial (verde). As duas populações de células foram fotografadas a cada 10 minutos durante 8 horas, utilizando um Nikon Ti-E invertido motorizado Widefield Fluorescência lapso de tempo microscópio e software elementos. O gráfico mostra que talina 1 atenuaçãodiminui significativamente a depuração célula mesotelial (parcela Quantile com barras verdes no meio). Filme 3. Controle OVCA433 esferóides (vermelho) invasores em uma monocamada mesotelial (verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Clique aqui para ver filme</a> . Movie 4. Atenuação de talina expressão 1 em OVCA433 esferóides (vermelho) diminui mesotelial (verde) a capacidade de apuramento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Clique aqui para ver filme</a> .

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Não temos nada a divulgar.

O &quot;Ensaio Apuramento mesotelial&quot; aqui apresentado usa de lapso de tempo de microscopia para monitorar as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais, em detalhe espacial e temporal. Anteriormente, vários grupos 8-14 tinha usado ensaios de ponto de extremidade para mostrar que as células de câncer de ovário juntar-se e invadir em monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio é único na medida em que utiliza células marcadas por fluorescência para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> OVCA433 células cancerígenas de ovário </td><td></td><td></td><td> Presente do Dr. Dennis Slamon </td></tr><tr><td> Zt células mesoteliais </td><td></td><td></td><td> Presente do Dr. Tan Ince </td></tr><tr><td> Meio 199 </td><td> Gibco </td><td> 19950 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Célula Applications Inc. </td><td> 117-500 </td><td></td></tr><tr><td> FBS, inativado pelo calor </td><td> Gibco </td><td> 10082 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 96 poços </td><td> Corning Costar </td><td> 3799 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Polyhydroxyethylmethacrylate (poli-HEMA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 192.066-25G </td><td> Para poli-HEMA solução dissolver o pó poli-HEMA 6mg em 1 ml de EtOH a 95% </td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111ACS200 </td><td> Diluir a 95% em 2 0 dH </td></tr><tr><td> Capuz de cultura de células </td><td> Nuaire </td><td> NU-425-300 </td><td></td></tr><tr><td> De cultura de tecidos incubadora </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> incubadora para poli-HEMA placas </td><td> Instrumentos Labline </td><td> Imperial III 305 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> Heraeus </td><td> 75003429/01 </td><td></td></tr><tr><td> 6 prato fundo de vidro bem </td><td> MatTek corp. </td><td> P06G-1.5-20-F </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F1141-1mg </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Timelapse: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Ti-E Invertido Motorizado microscópio lapso de tempo de fluorescência com sistema integrado Foco Perfeito </td></tr><tr><td> Lente </td><td> Nikon </td><td></td><td> 20X-0,75 apeture numérica </td></tr><tr><td> Transiluminador de halogéneo </td><td> Nikon </td><td></td><td> 0,52 NA condensador de longa distância de trabalho </td></tr><tr><td> Os filtros de excitação e emissão </td><td> Chroma simples filtros passa em Nikon habitação </td><td></td><td> GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 </td></tr><tr><td> Transmissíveis e Epifluoresce caminho da luz </td><td> Sutter </td&gt; <td></td><td> Persianas inteligentes </td></tr><tr><td> Linear-codificado estágio motorizado </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Câmera do dispositivo resfriado Charged-Coupled </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA-AG </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de incubação com microscópio de temperatura e de CO 2 controlo </td><td> custom-built </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mesa de isolamento de vibração </td><td> TMC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements software </td><td> Nikon </td><td></td><td> Versão 3 </td></tr></tbody></table>

ensaio in vitro de apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

O câncer de ovário é a quinta causa principal de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos 1. Apesar de uma resposta positiva inicial para terapias, 70 a 90 por cento das mulheres com câncer de ovário desenvolver com novas metástases, ea recorrência é muitas vezes fatal 2. É, portanto, necessário compreender como metástases secundárias surgir, a fim de desenvolver melhores tratamentos para o cancro intermediária e fase tardia do ovário. Metástase do cancro do ovário ocorre quando as células malignas destacar a partir do local do tumor primário e disseminar por toda a cavidade peritoneal. As células disseminadas pode formar aglomerados multicelulares, ou esferóides, que irá permanecer quer acopladas, ou implantes para órgãos dentro da cavidade peritoneal 3 (Figura 1, Filme 1). Todos os órgãos dentro da cavidade peritoneal são revestidas com um único, a camada contínua de células mesoteliais 4-6 (Figura 2). No entanto, as células mesoteliais estão ausentes da parte de baixoperitoneais massas tumorais, como revelado por estudos de micrografia electrónica excisadas humanos secções de tecido de tumor 3,5-7 (Figura 2). Isto sugere que as células mesoteliais são excluídos por baixo da massa do tumor por um processo desconhecido. Anterior, em experiências in vitro demonstraram que as células cancerosas do ovário primárias anexar mais eficientemente para a matriz extracelular do que para células mesoteliais 8, e os estudos mais recentes mostraram que os primários peritoneais células mesoteliais realmente proporcionar uma barreira para a adesão celular de ovário cancro e invasão (em comparação com adesão e invasão em substratos que não foram cobertos com células mesoteliais) 9,10. Isto sugere que as células mesoteliais actuar como uma barreira contra a metástase do cancro do ovário. Os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as células de câncer de ovário violam esta barreira, e excluir o mesotélio, até recentemente, permaneceu desconhecido. Aqui descrevemos ªmetodologia e para um ensaio in vitro que os modelos de interacção entre esferóides de células cancerosas do ovário e células mesoteliais in vivo (Figura 3, Filme 2). O protocolo foi adaptado de métodos descritos anteriormente para analisar as interações ovarianos de células tumorais com monocamadas mesoteliais 8-16, e foi descrita pela primeira vez em um relatório mostrando que as células tumorais de ovário utilizar uma ativação dependente de integrinas de miosina e força de tração para promover a exclusão do células mesoteliais de 17 sob um tumor esferóide. Este modelo leva vantagem de lapso de tempo a microscopia de fluorescência para monitorar as populações de células de dois em tempo real, fornecendo informação espacial e temporal na interação. As células de cancro do ovário expressar vermelho proteína fluorescente (SDP), enquanto as células mesoteliais expressar a proteína verde fluorescente (GFP). RFP expressando esferóides de células cancerígenas de ovário anexar à monocamada expressando GFP-mesotelial. A propagação esferóides, invadir, eforçar as células mesoteliais de lado a criação de um buraco na monocamada. Este buraco é visualizado como o espaço negativo (preto) na imagem GFP. A área do orifício pode ser então medido quantitativamente analisar as diferenças na actividade folga entre o controlo e as populações experimentais de cancro do ovário e / ou células mesoteliais. Este ensaio requer apenas um pequeno número de células de ovário cancerosas (100 células por esferóides X 20-30 esferóides por condição), de modo que é possível realizar este ensaio usando preciosos primárias amostras de células tumorais. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para rastreio de alto rendimento.

O ensaio de depuração mesotelial descrito aqui leva vantagem das células marcadas com fluorescência e de microscopia de lapso de tempo de vídeo para visualizar e medir quantitativamente as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio modela os passos iniciais da metástase do câncer de ovário.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

O câncer de ovário é a quinta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos1. Apesar de uma resposta inicial positiva às terapias, 70 a 90 ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a capacidade dos esteroides multicelulares de câncer de ovário de invadir uma monocamada mesotelial. Isso é realizado primeiramente incubando células de câncer de ovário que expressam proteína fluorescente vermelha em placas de cultura com baixa adesão para formar esteroides multicelulares. O próximo passo é semear células mesoteliais que expressam proteína fluorescente verde em placas de cultura com fundo de vidro revestido com fibronectina para formar monocamadas.O passo final consiste em transferir os esferoides de câncer de ovário das placas de baixa adesão para as placas contendo as monocamadas de mesotélio. Por fim, utiliza-se microscopia de vídeo com lapso de tempo em fluorescência para quantificar a capacidade relativa dos esferoides de câncer de ovário controle e experimentais de formar uma lacuna na monocamada mesotelial.A principal vantagem desta técnica em relação aos ensaios terminais existentes é que uma combinação de células marcadas com fluorescência e microscopia de vídeo com lapso de tempo é utilizada para monitorar a dinâmica da eliminação mesial ao longo do tempo. Antes da formação de phe de câncer ovariano, é necessário preparar placas de cultura de fundo redondo com baixa adesão de 96 poços. Para produzir essas placas de cultura, adicione 30 microlitros de solução de poli-hema a cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços.Incube as placas de 96 poços em um incubador não umidificado a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas para evaporar o etanol, deixando um filme de poli-hema em cada poço. Esse filme de poli-hema impede que as células se liguem ao fundo do poço, forçando-as a crescer em suspensão. As células de câncer de ovário que expressam a proteína fluorescente vermelha neste experimento são cultivadas em meio base 10%, um meio de cultura celular personalizado, quando as placas de cultura de baixa adesão estão prontas.A tripsina é usada para destacar as células de câncer de ovário da placa, primeiro lavando a placa com PBS, depois adicionando um mililitro de tripsina e incubando a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a adição do meio base com 10% de soro para inativar a tripsina, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros. Peline as células em uma centrífuga de bancada a 900 RCF por três minutos, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células no meio base com 10% de soro.Após contar as células utilizando um hemocitômetro, ajuste a concentração das células para 100 células por 50 microlitros de meio Base 10% e adicione 50 microlitros da suspensão celular diluída e uniformemente suspensa a cada poço de uma placa de cultura de 96 poços revestida com poli-hema. Incube a placa de 96 poços em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius por 16 horas para permitir que as células de câncer de ovário se agrupem, formando um único esteroide multicelular em cada poço. Para iniciar este procedimento, pré-revesta os poços de uma placa de vidro de fundo de seis poços da Mat-Tech com fibronectina. Adicione dois mililitros de solução de fibronectina em PBS a cada poço da placa e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Cultive as células mesoteliais expressando a proteína verde fluorescente em meio-base 10% para formar um monocamada de células mesoteliais. Desprenda as células mesoteliais com tripsina em meio-base 10% e centrifugue em centrífuga de bancada a 900 RPM durante três minutos. Aspire o sobrenadante e re-suspenda as células em meio-base 10%, ajustando à concentração desejada com meio-base 10%. Quando a incubação de 30 minutos com fibronectina na placa matrigel estiver completa, lave os poços com dois mililitros de PBS, aspire o PBS e plaque seis vezes 10 à quinta células mesoteliais por poço em cada poço da placa de seis poços matrigel.Incube o prato MatTek em um incubador de cultura celular a 37 graus Celsius durante a noite para permitir que as células mesoteliais adiram ao prato e formem uma monocamada. Para iniciar este ensaio, utilize uma pipeta para coletar o PHE de câncer de ovário da placa de 96 poços revestida com poli-hema, aspire o meio de um poço do prato MatTek de seis poços contendo uma monocamada de células mesoteliais, lave uma vez com dois mililitros de PBS e adicione todo o PHE da placa de 96 poços a um poço do prato MatTek. Isso corresponde aproximadamente a três vezes o número de células que serão imageadas, para compensar o PHE que aderir à parte do prato que não pode ser imageada.Como queremos imaginar apenas um esteroide por campo de visão, é necessário evitar a agregação dos esteroides. Balançe suavemente o recipiente de um lado para o outro para distribuir os esteroides uniformemente sobre a monocamada antes que eles se fixem. Coloque o recipiente Mat Tech na platina de um microscópio de fluorescência invertido de campo amplo.Capaz de realizar imagens com lapso de tempo durante um período de pelo menos oito horas. Utilize uma platina motorizada para imaginar múltiplas posições na placa com múltiplos eventos de intercalação OID. Em um único experimento, a célula de câncer de ovário PHE se depositará no fundo da placa e se ligará à célula mesotelial.O monocamada coleta imagens de G-F-P-R-F-P e de fase de mais de 20 interações de esferoides com monocamada a cada 10 minutos durante oito horas. No ensaio de clareamento de células mesoteliais, a célula de câncer de ovário que expressa RFP invadirá o monocamada de células mesoteliais que expressam GFP, criando buracos no monocamada. Os tamanhos dos buracos são medidos traçando os buracos escuros nas imagens GFP utilizando o software Element ou outro software adequado, como o ImageJ. O tamanho do buraco é então normalizado em relação ao tamanho inicial do esferoide dividindo-se o tamanho do buraco após oito horas pelo tamanho do esferoide na imagem correspondente de RFP no tempo zero. O ensaio de clareamento de células mesoteliais pode ser usado para comparar a capacidade invasiva de esferoides de células de câncer de ovário que foram geneticamente modificados, a fim de elucidar os mecanismos moleculares pelos quais os esferoides de células de câncer de ovário promovem o clareamento.A monocamada mesotelial neste exemplo, a capacidade de clareamento MESOTELIAL de células de câncer de ovário O VCA 4 33. Fases que apresentavam expressão atenuada de Talon um foram comparadas à das OVCA 4 33 OIDs controle. Os orifícios produzidos na monocamada pelo alastramento das FASES foram medidos e seis posições de cada grupo foram médias.Como mostrado neste gráfico, a área média de clareamento criada pelos esteroides com silenciamento de Talon um foi significativamente menor do que a área média criada pelos esteroides controle, sugerindo que Talon é necessário para o clareamento mesotelial por células cancerígenas ovarianas OVCA 4 33. Este filme com lapso de tempo mostra um esteroide vermelho OVCA 4 33 controle invadindo uma monocamada mesotelial verde. Este próximo filme com lapso de tempo mostra um esteroide vermelho OVCA 4 33 com expressão atenuada de Talon um invadindo uma monocamada mesotelial verde.Quando comparado com o filme anterior, é evidente que a atenuação da expressão de Talon um nos esteroides diminui a capacidade de limpeza mesotelial. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar a interação entre câncer de ovário, esteroides multicelulares e monocamadas de células mesoteliais ao longo do tempo utilizando microscopia de vídeo com lapso de tempo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Heterotípica tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Neste vídeo, demonstramos o desenvolvimento de um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal. Essa cultura organotípica pode ajudar a investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelagem de metástase de câncer de ovário no revestimento da cavidade peritoneal: um método para estabelecer um modelo 3D in vitro do revestimento peritoneal

Este vídeo descreve uma técnica para medir quantitativamente a interação de esferoides de câncer de ovário com células mesoteliais, usando células marcadas com fluorescência e microscopia de vídeo com lapso de tempo. Este ensaio in vitro modela a interação entre esferóides de células de câncer de ovário em metástase e células mesoteliais que revestem a cavidade peritoneal in vivo.

Ensaio de depuração mesotelial: uma técnica in vitro para quantificar a capacidade de invasão de esferoides de câncer de ovário em monocamadas de células mesoteliais

Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Descrevemos um protocolo que implementa abordagens in vivo e ex vivo para estudar a colonização do câncer de ovário dos tecidos adiposos peritoneais, particularmente o omento. Além disso, apresentamos um protocolo para quantificar e analisar estruturas de células imunes no omento conhecidas como manchas leitosas, que promovem metástases de tecido adiposo peritoneal.

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

A metástase do câncer de ovário é caracterizada por numerosas lesões intraperitoneais difusas, de modo que a quantificação visual precisa da carga tumoral é um desafio.  Aqui, descrevemos um método para quantificação in situ e ex vivo da carga tumoral metastática usando células tumorais marcadas com proteína fluorescente vermelha (RFP) e imagens ópticas.

A quantificação da Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metástase

Aqui, apresentamos um protocolo para construir um modelo tridimensional in vitro do revestimento da cavidade peritoneal, composto por células mesoteliais humanas primárias e fibroblastos estratificados com matriz extracelular, como uma ferramenta para investigar a adesão, invasão e proliferação de células de câncer de ovário.

Modelando os passos iniciais do cancro do ovário Divulgação em uma cultura organotípicas do Peritoneal Cavity Humano

Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Para estudar a progressão do tumor do ovário num modelo fisiologicamente relevante, esferóides multicelulares foram cultivadas num microdispositivo sob fluxo de fluido simulado. Este modelo 3D dinâmica emula o ambiente intraperitoneal com os componentes celulares e mecânicas onde ocorre a metástase do cancro do ovário.

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo tridimensional (3D) ex vivo de interação célula-omento canceroso. O modelo fornece uma plataforma para elucidar mecanismos pró-tumorais dentro do nicho adiposo e para testar novas terapias.

Modelo Ex Vivo de Metástase Peritoneal de Câncer de Ovário Utilizando Omento Humano

Aprenda a modelar a metástase do câncer de ovário usando esferoides multicelulares e monocamadas de células mesoteliais com microscopia de fluorescência. Este ensaio in vitro permite quantificar a invasão celular em tempo real.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

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