Name: Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando 18 O-enriquecido Água (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda fluxos de trabalho de marcação isotópica com água enriquecida em 18O para estudos proteômicos quantitativos e qualitativos. Este método emprega proteases e catalisadores ácidos para incorporação de átomos de oxigênio.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.

Os apresentados Leo-workflows permitem a rotulagem de isótopos estáveis ​​de proteína digere e peptídeos sintéticos. Estas experiências de cursos de tempo (Figura 1) são aplicáveis ​​a estudos comparativos e quantitativa do proteoma, bem como pesquisas protease. Cada fluxo de trabalho é constituído por duas etapas experimentais (figura 2): A) O tempo de amostragem do respectivo resolvido 18O-stable isotope reacção codificado (protease catalisada clivagem do péptido; protease catalisada reacção de permuta de oxigénio carboxilo; catalisada por ácido a troca de oxigénio carboxil reacção) e B), análise por espectrometria de massa e a representação gráfica de 18 S-cinética de incorporação. TimeCourse Experimentos A. I. paleo-TimeCourse: rotulagem Protease catalisada de clivagens proteolíticas <ol><li> (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM)em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recentemente preparada) por incubação durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Dependendo protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam ser limpos-se para remover o tampão residual e agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 (Thermo rotação) para a limpeza do peptídeo e concentradores Vivaspin centrífuga (Sartorius) para troca de tampões para as amostras de proteína. </li><li> Redissolver / peptídeos / proteínas de câmbio em 20 ul de tampão de reacção da protease (ECE-1: 50 mM de MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da protease: Misturar 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa ciano-4-hidroxicinâmicoácido matriz (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa de Opti-TOF MALDI alvo 384 (AB SCIEX) e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min). </li><li> Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com a protease de interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e servirá como amostra de controlo. A primeira alíquota da amostra representa um padrão para a protease catalisada 18 O-rotulagem e podem ser usados ​​para identificação de péptidos e proteínas, a detecção de actividades proteolíticas e monitorização das reacções de clivagem proteolitica. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é induzida pela protease e, portanto, nem a rotulagem nem clivagem é esperado para esta amostra. </li><li> Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los como described no passo 5 em intervalos de tempo como parece em forma. As condições de reacção descritas acima são utilizados para monitorizar a reacção proteolítica por até quatro dias (aproximadamente 24 pontos). Iniciar a amostragem a cada 5 min até 30 min, em seguida, detectar a cada 30 minutos até 2 horas, depois a cada hora até 8 horas e a cada 8 horas até 4 dias. Produtos de clivagem deve aparecer dentro do primeiro 12 hr e do substrato deve ser completamente hidrolisada após 24 hr. Tempos de incubação prolongados de reacção permitem definir os produtos de reacção que são estáveis ​​discretos a partir de intermediários da reacção, os quais são posteriormente processados. Dependendo questão de pesquisa e dados enzima-substrato pares, manchar vezes e temperatura de incubação tem que ser modulada para assegurar amostragem reação ideal. </li><li> Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar, a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B). </li></ol> II. Paleo-TimeCourse: Postdigrotulagem estion de terminais proteolíticas <ol><li> (Opcional) ligações de dissulfureto de proteínas (10 ^ M) e os péptidos (250 nM) são reduzidas com DTT (concentração final 2,5 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos preparados na hora) por incubação durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas livres são alquiladas com iodoacetamida (concentração final 10 mM) em 25 mM NH 4 HCO 3 por incubação durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Dependendo da protease de interesse, proteína / peptídeo soluções precisam de ser limpas-se para remover o tampão residual e do agente de alquilação. Use colunas PepClean C-18 de spin para limpeza de peptídeo e Vivaspin concentradores centrífugos para troca de tampão proteína. </li><li> Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídeos / proteínas em 20 ul de tampão de reacção (por exemplo, protease tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digestão com protease de interesse para finalização (por exemplo, tripsina: 0,04 nM, 37 ° C, 12 hr). </li><li> Limpeza produtos de clivagem com colunas PepClean C-18 spin. Esta etapa irá eliminar atividades de protease residuais. </li><li> Redissolver / trocar os produtos limpa-up peptídicas em 20 ul de tampão de reacção da protease (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contendo 1:1 (v / v) final H 2 O. 18 </li><li> Retirar uma amostra de ponto de tempo zero, antes da adição da enzima: mistura de 0,5 ul da mistura de reacção e 0,5 ul alfa matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Ponto de amostra numa placa alvo de MALDI e deixar as gotas de solvente à temperatura ambiente até estar seco (cerca de 5 min). </li><li> Dividir a solução de reacção em duas aliquotas. A primeira alíquota será incubado com protease de interesse (por exemplo, tripsina: 0,04 nM), à temperatura ambiente ou a temperatura recomendada para a enzima em particular. A segunda alíquota serão incubadas sem protease e vai servir como um controlo. O primeiroalíquota representa uma amostra padrão de etiquetagem 18 protease catalisada postdigestion O-e pode ser utilizado para a quantificação de peptídeos e proteínas. A segunda alíquota é utilizada para demonstrar que 18 O-incorporação é catalisada pela protease e, portanto, não é esperado de rotulagem para esta amostra. </li><li> Seguir a reacção por remoção de aliquotas da reacção e localizá-los, tal como descrito no passo 7.) Em intervalos de tempo como parece adequada. Por exemplo, nós descoberto inicialmente a cada 5 min durante um período máximo de 30 minutos e a cada 15 minutos depois disso para monitorizar a reacção de permuta de oxigénio carboxil catalisada pela tripsina. </li><li> Após o ponto de tempo final de reacção é manchado ou em intervalos longos entre manchar a placa alvo de MALDI é submetido a análise MALDI-TOF/TOF MS / MS como descrito a seguir (Secção B). </li></ol> III. Aleo TimeCourse-: catalisada por ácido de rotulagem de grupos carboxilo <ol><li> Incubar péptidos individuais (50 nM) com 1:1 (v / v) de água 18 O-enriquecido em tele presença ou ausência (controlo) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético final (volume total 30 ul). </li><li> Os produtos de reacção de amostra diários durante 48 dias, por co-spotting uma alíquota de 0,5 ul da mistura de alfa 0.5μl com matriz de ácido ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg / ml em 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA), directamente para um alvo MALDI placa. </li><li> Entre os intervalos de manchas e após avistar, do ponto final do tempo de reação apresentar MALDI placa-alvo para MALDI-TOF/TOF análise MS / MS, conforme descrito abaixo na Secção B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de Aquisição de Dados e Análise <ol><li> Espectros de massa são adquiridos em um 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Antes da análise, o instrumento é calibrado com uma mistura de padrões de peptídeos (Kit de calibração para Padrões de Massa de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) com um máximo de tolerância do erro de medição de massa de ± 50 ppm e um número mínimo de seis picos para corresponder. </li><li> Os espectros de MS (intervalo de massas400 - 4000 m / z) são adquiridos em triplicado usando o modo de ião positivo com uma intensidade do laser ajustável (3400 - 3800; tamanho do passo 50), com uma gama aceitável a intensidade de base do pico de 2.000 - 45.000. Fotos individuais são adquiridos para espectros sub-, com 400 tiros total / espectro, parar condições entram em vigor depois de 800 sub-espectros são adquiridos (aprovação ou reprovação) ou 400 sub-espectros critérios de aceitação da passagem. No caso de amostras de baixa abundância ou na presença de complexos origens biológicas da extremidade inferior da gama de detecção MS deve ser aumentada para 800 m / z. Além disso, pode ser necessário para remover o sal e outros compostos que interferem com a etapa de limpeza de amostra, como descrito anteriormente, ou por separação por LC. </li><li> Arquivos de dados (MS. T2D arquivos) são exportados da Série Explorador 4000 software de aquisição de dados e importados para o nosso sistema de informações interno de laboratório, que utiliza software MASCOTE Distiller (Matrix Science) para processamento espectral e detecção de pico. Envelopes isotópicassão deconvoluted e 18 ó incorporação rácios automaticamente determinadas usando um algoritmo semelhante ao descrito por Mason et al. 12 e adaptado pelo nosso grupo de 9. Em alternativa, as ferramentas de software, tais como 13 e ZoomQuant Viper 14, bem como os pacotes de software comercial tais como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Distiller Mascot Quantitation Toolbox (Matrix Science) pode deconvolute 18 O tipo de dados 15,16. 18 ó incorporação rácios são expressos como as contribuições relativas dos isótopos individuais espécies de péptidos (isto é, péptidos contendo 16 ó, 18 ou 18 O 1 O 2) a todo o envelope isotópica. </li><li> Para cada experiência TimeCourse, as massas moleculares ([M + H] +) para todas as espécies de péptidos detectados são extraídos a partir dos ficheiros de dados associados MS e os valores binned a uma largura de 100 ppm em massa. </li><li> AAo menos três [M + H] estão definidos para ser obrigado a preencher um escaninho. No caso de substratos conhecidos, a lista bin filtrado é comparado com uma lista de produtos de clivagem proteolítica previsto a partir da sequência de péptido de substrato utilizando a ferramenta FindPept ExPASy 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) e um 200 ppm em massa de tolerância de erro aceitação. </li><li> Espectros MS / MS são adquiridos para todos os valores de massa dos produtos de clivagem previstos pela ferramenta FindPept e para valores de bin que têm 18 O-incorporações que lhes estão associados. MS / MS de dados são adquiridos em 4800 MALDI Analyzer TOF / TOF em 1kV modo íon positivo refletor, com uma intensidade do laser fixa de 4200 e de gás-CID em modo desligado. 50 disparos são adquiridos num padrão aleatório por espectros de sub--se a um total de 40 sub-espectros por local (produzindo um total de 2.000 disparos / local). </li><li> MS / MS arquivos de dados (. T2D arquivos) são exportados a partir da série 4000 Explorer software de aquisição de dados e importados para o sistema de informação laboratorial em casa, os picos são detectados e listas de MS / MS dos picos estão associados com os dados correspondentes binned MS. </li><li> Para identificação peptídeo, listas de MS / MS de pico são pesquisados ​​no banco de dados SwissProt usando o motor de busca MASCOTE com os parâmetros de pesquisa a seguir: não especificidade enzima, 150 ppm e íon precursor 0,2 fragmento Da tolerâncias de massa de íons. </li><li> Identificações peptídeos podem adicionalmente ser validado com o Data Explorer software (AB SCIEX), confirmando as características 18 O incorporação padrões de íons através y série de fragmentos, como descrito por Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparação do Tempo espectral e 18 Ó incorporação de parcelas Parcelas de tempo espectrais: arquivos de dados (MS. T2D arquivos) para cada ponto de tempo de reação são exportados do software Data Explorer como ASCII-arquivos usando ummacro e importados para um programa de análise de dados e software gráfico (por exemplo de origem por OriginLab) e exibido como parcelas de cascata (Figura 3). 18 O-incorporação parcelas: Para cada um dos produtos de clivagem do péptido binned, as contribuições relativas das espécies de isótopos de péptidos individuais (16 O, 18 O 18 O 1 ou 2) são extraídos através de todos os pontos de tempo de reacção e representada graficamente em função do tempo (Figura 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
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<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
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<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
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<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
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<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
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<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Através da combinação de rotulagem isótopo estável e de elevada resolução em espectrometria de massa de uma forma resolvida no tempo, o método Paleo TimeCourse-permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar péptidos marcados isotopicamente estáveis ​​para estudos quantitativos e qualitativos proteómica e avaliar a cinética através da qual os péptidos proteotypic são gerados. Além disso, Paleo TimeCourse foi concebido para avaliar as vias proteolíticas sob específic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Colunas PepClean C-18 de Spin </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 placa-alvo MALDI </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Materials <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Iodoacetamida (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Enzima conversora de endotelina-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Ouro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Água-18 O, 97% átomo de 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Kit Padrões de massa para Calibração de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes

protease e catalisada por ácido workflows labeling empregando<sup&gt; 18</sup&gt; o-enriquecido Água

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Isótopos estáveis ​​são ferramentas essenciais em espectrometria de massa biológica. Historicamente, 18 O-isótopos estáveis ​​têm sido extensivamente utilizadas para estudar os mecanismos catalíticos das enzimas proteolíticas 1-3. Com o advento da espectrometria de massa à base de proteomics, a incorporação catalisada enzimaticamente, de 18 átomos de O-água isotopicamente enriquecido estável tornou-se um método popular para comparar quantitativamente os níveis de proteína de expressão (revisto por Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-rotulagem constitui uma alternativa simples e de baixo custo para produtos químicos (por exemplo iTRAQ, ICAT) e metabólicas (por exemplo, técnicas de SILAC) rotulagem 7. Dependendo da protease utilizada, 18 O-rotulagem podem resultar na incorporação de até dois átomos de O-18 no grupo carboxilo C-terminal do produto de clivagem 3 </sup&gt;. A reacção de marcação pode ser subdividido em dois processos independentes, a clivagem da ligação peptídica e a reacção de permuta de oxigénio carboxil 8. Em nossa Paleo (p rotease-a e Abeling ssisted l mploying 18 O enriquecido água) adaptação de enzimática 18 O rotulagem, utilizamos 50% de água 18 O enriquecido para produzir assinaturas isotópicas distintas. Em combinação com a alta resolução de laser assistida por matriz de ionização de dessorção de tempo-de-voo espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), os envelopes isotópicos característicos podem ser usados ​​para identificar os produtos de clivagem com um elevado grau de especificidade. Nós já ter usado o Paleo metodologia para detectar e caracterizar proteases endógenas 9 e monitorar reações proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica a própria essência da reação de clivagem proteolítica, a instalação experimental é Enri simples e bioquímicoschment passos de produtos de clivagem podem ser contornados. A paleo-método pode ser facilmente estendido para (i) o curso experiências que monitoram a dinâmica de reações de clivagem proteolítica e (ii) a análise da proteólise em amostras biológicas complexas que representam condições fisiológicas. Paleo-TimeCourse experimentos ajudar a identificar passos limitação de taxa de processamento e intermediários de reação em complexas reações via proteolíticas. Além disso, a reacção de Paleo permite-nos identificar as enzimas proteolíticas como a tripsina serina-protease que é capaz de associar novamente os seus produtos de clivagem e de catalisar a incorporação de um 18 segundo O-átomo. Tais &quot;etiquetagem dupla&quot; enzimas podem ser utilizados para postdigestion 18 O-rotulagem, em que os péptidos marcados são exclusivamente através da reacção de oxigénio carboxil troca. A nossa estratégia terceira estende rotulagem empregando água 18 ó enriquecido além enzimas e utiliza condições de pH ácido para introduzir 18 sinal isótopo estável O-Atures em peptídeos.

Utilizou-se o fluxo de trabalho Paleo TimeCourse para monitorar dinamicamente a incorporação de 18 O-isótopos estáveis ​​em produtos de clivagem de péptidos geradas por enzimas proteolíticas. A abordagem apresentada é uma ferramenta versátil para estudar comparativamente vias de processamento proteolíticas de diferentes substratos e combinações de protease. Por amostragem reacções proteolíticas repetidamente durante o curso da reacção, o experimento Paleo TimeCourse fornece instantâneos resolvida no tempo de ...

Fluxos de trabalho de isótopos estáveis ​​de rotulagem empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-água enriquecida (Leo-fluxos de trabalho) são ferramentas versáteis para estudos quantitativos e qualitativos proteômica. Nos fluxos de trabalho protease assistidas (Paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-átomos são introduzidos por clivagem proteolítica e reacções de permuta de oxigénio carboxilo mediada por proteases. No catalisada por ácido de fluxo de trabalho (Aleo),<sup&gt; 18</sup&gt; O-átomos são introduzidos por troca de oxigénio carboxilo a pH baixo.

Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando<sup&gt; 18</sup&gt; O-enriquecido Água

Isótopos estáveis são ferramentas essenciais na espectrometria de massas biológica. Historicamente, isótopos estáveis de 18O têm sido amplamente utilizados para estudar a catálise...

Esta apresentação demonstra fluxos de trabalho para a marcação com isótopos estáveis de digestos proteicos e peptídeos sintéticos utilizando água enriquecida com oxigênio 18, primeiramente no experimento de curso temporal paleo catalisado por protease, incubando substrato e protease na presença de água enriquecida com 50% de oxigênio 18 para incorporar átomos de oxigênio 18. Em seguida, quando a protease é capaz de dupla marcação, repita a incubação dos produtos da clivagem pós-digestão com a protease de interesse na presença de água enriquecida com 50% de oxigênio 18.O fluxo de trabalho EO realiza a incorporação catalisada por ácido de átomos de oxigênio 18 em grupos funcionais em intervalos programados. Aliquotas retiradas das misturas reacionais são aplicadas com matriz em placas-alvo contaminadas e, durante a aquisição de dados por espectrometria de massas, geram gráficos espectrais ao longo do tempo das reações de clivagem de peptídeos, bem como gráficos de incorporação de oxigênio 18. Produtos de clivagem marcados, correspondentes a espécies peptídicas individuais, são selecionados para identificação da sequência com base em MS/MS. Em última análise, esses fluxos de trabalho oferecem ferramentas versáteis para estudos proteômicos qualitativos e quantitativos.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de pesquisa de proteases, como identificar a taxa, as etapas limitantes e os intermediários da reação em vias proteolíticas complexas. As assinaturas proteolíticas identificadas pelo curso temporal paleo fornecem informações importantes sobre a especificidade do substrato. Além disso, os temporizadores dos dados também utilizam informações cinéticas.Um pós-doutorando do meu laboratório demonstrará agora o procedimento. O fluxo de trabalho da série temporal paleo monitora a dinâmica de reações de clivagem proteolítica com base na incorporação de oxigênio 18 catalisada por protease; para a reação de 20 microlitros, adicione os peptídeos da amostra ao tampão de reação da protease contendo água enriquecida com oxigênio 18, misture 0,5 microlitros da mistura de reação com 0,5 microlitros de matriz em um ponto da placa alvo maldi opti to 3 de 84 poços e deixe as gotas de solvente em temperatura ambiente até secar. Enquanto isso, divida a mistura de reação em dois tubos.Controle e amostra para o tubo de amostra. Adicione a protease de interesse e incube na temperatura recomendada para a reação enzimática. Adicione os pontos de tempo especificados.Retire uma alíquota de 0,5 microlitro para misturar com 0,5 microlitros de matriz e aplique na placa com múltiplos alvos. Prossiga para analisar a dinâmica da reação por análise de MS MALDI-TOF conforme descrito posteriormente neste fluxo de trabalho de marcação pós-digestão paleoproteômica. SN produz enzimas como tripsina, que catalisam a reação de troca de oxigênio carboxílico para incorporar oxigênio-18. Após realizar uma digestão proteica sem marcação com oxigênio-18, passe os produtos de clivagem por uma coluna giratória C18 pep clean para eliminar atividades proteásicas residuais.Em seguida, reconstitua as amostras em 20 microlitros de tampão de reação da tripsina contendo água enriquecida com oxigênio 18. Retire uma alíquota de 0,5 microlitro e misture com volume igual de matriz. Em seguida, aplique em uma placa alvo MALDI Opti-Off 3 84 e deixe secar ao ar.Em seguida, divida a solução da reação em tubos controle e tubos de amostra para o tubo de amostra. Adicione tripsina e incube a 37 graus Celsius. Para monitorar a reação, retire uma alíquota de 0,5 microlitro.Misture com 0,5 microlitros de matriz e aplique em uma placa de maltar. Analise a dinâmica desta reação de troca de oxigênio carboxílico por análise Maldi Toof MSM S. O fluxo de trabalho de curso temporal IEO baseia-se nas reações de troca de oxigênio carboxílico catalisadas por ácido em grupos laterais e terminais ácidos de peptídeos.Primeiro, incube 50 nanomolares de peptídeos individuais com água enriquecida com oxigênio 18 em proporção um para um, na presença ou ausência de ácido tricloroacético 0,1% final. Coletar alíquotas de 0,5 microlitros da reação diariamente durante 48 dias, coprecipitando diretamente com matriz sobre uma placa alvo MALDI. Submeta regularmente a placa alvo MALDI para análise de produtos por MALDI TOF MS. Esta seção está detalhada no manuscrito suplementar.Primeiro, adquira espectros de MS em modo de íons positivos em triplicata. Após calibrar o múltiplo e configurar a aquisição de MS, adquira disparos únicos para subespectros. Em seguida, exporte os arquivos de dados de MS do software de aquisição de dados Explorer da série 4.000.Em seguida, importe para um sistema de informação interno que utilize o software Mascot Distiller para processamento espectral e detecção de picos. Deconvolua os envelopes isotópicos e determine automaticamente as proporções de incorporação de oxigênio 18, observando essas proporções como as contribuições relativas de espécies isotópicas individuais do peptídeo para todo o envelope isotópico. Filtre a lista de bins e agrupe pelo menos três valores em uma largura de massa de 100 ppm para cada experimento de curso temporal.Extraia as massas moleculares de todas as espécies de peptídeos detectadas a partir dos arquivos de dados de EM associados. Agora, utilizando o X pacey, defina um conjunto de peptídeos com uma tolerância de erro de massa de 200 PPM. Compare a lista de picos com os dados dos produtos de clivagem proteolítica previstos a partir da sequência do peptídeo substrato.Prossiga para adquirir espectros msms para todos os valores de massa dos produtos de clivagem previstos pela ferramenta find pep e para valores de bin que tenham incorporações associadas de oxigênio 18. Colete dados MSM S de 50 disparos em um padrão randomizado por subespectro, com até 40 subespectros por ponto, e exporte os arquivos msms. Em seguida, exporte os arquivos de dados MSM S para o sistema de análise para detecção de picos e listas de picos MSM S associados aos dados de bend MS correspondentes para identificação de peptídeos.Defina esses parâmetros de busca no motor de busca Mascot: nenhuma especificidade de enzima, tolerância de massa de íons precursor de 150 PPM e de íons fragmento de 0,2 Dalton. Realize a busca das listas M-S-M-S-P contra a base de dados Swiss-Prot. As identificações de peptídeos podem ainda ser validadas usando software explorador de dados, confirmando os padrões característicos de incorporação de oxigênio 18 nos íons fragmento ao longo dos gráficos temporais do espectro.Exporte os arquivos de dados de EM para cada ponto de tempo da reação a partir do software explorador de dados, usando arquivos ASCI e uma macro. Em seguida, importe os arquivos para um programa de análise de dados e gráficos e exiba-os como gráficos em cascata para criar gráficos de incorporação de oxigênio 18 para cada dobra. A partir do produto da clivagem do peptídeo, extraia as contribuições relativas das espécies isotópicas individuais do peptídeo em todos os pontos de tempo da reação e, em seguida, plote em função do tempo.Gráficos espectrais ao longo do tempo como este exibem a dinâmica de reações de clivagem proteolítica. Este experimento analisa a clivagem do peptídeo bioativo endo e C pela enzima conversora do endotélio um. Uma disposição em cascata plota os espectros de MS dos experimentos de curso temporal para monitorar simultaneamente a degradação do substrato e o surgimento de produtos intermediários e finais.Os produtos de clivagem são identificados por espectrometria de massas em tandem (MSMS) e pelas assinaturas características da incorporação de oxigênio 18 nos seus envelopes isotópicos. Esse mecanismo de reação da tripsina indica que as proteases de corte promovem a incorporação de até dois átomos de oxigênio 18 nos produtos peptídicos de clivagem. No fluxo de trabalho de marcação baseado em proteases, a reação de clivagem da ligação peptídica resulta em uma razão de incorporação de 50% de oxigênio 18 simples para produtos de clivagem peptídica recém-gerados; proteases como a tripsina, que se ligam novamente aos produtos da reação, catalisam ainda mais a incorporação de um segundo átomo de oxigênio 18 por meio da reação de troca de oxigênio carboxílico.No equilíbrio, o marcador oxigênio 18 é distribuído numa proporção de um para dois para um entre produtos não marcados, simplesmente marcados e duplamente marcados. No fluxo de trabalho de marcação com pré-digestão dos extremos proteolíticos, não ocorrem clivagens de ligações peptídicas. Em vez disso, a incorporação de até dois átomos de oxigênio 18 baseia-se exclusivamente na reação de troca de oxigênio carboxílico.Portanto, a incorporação de oxigênio 18 ocorre apenas com proteases que reconectam seus produtos de clivagem peptídica. A marcação catalisada por ácido com oxigênio 18 leva à incorporação de dois átomos de oxigênio 18 por grupo carboxila. Ao longo deste experimento, os múltiplos deslocamentos de massa de dois Dalton no envelope isotópico da angiotensina um podem ser mapeados pela absorção de átomos de oxigênio 18.Ao combinar a marcação com OPE e a espectrometria de massas de alta resolução de maneira cronometrada, o método de curso temporal paleo permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar peptídeos marcados topologicamente estabilizados para estudos proteômicos qualitativos e quantitativos, bem como para avaliar a cinética com que os peptídeos Protopic são gerados.O curso temporal Paleo foi projetado para avaliar vias proteolíticas sob condições fisiologicamente relevantes. Esta técnica abriu caminho para nossa recente análise de processos líticos em microambientes de câncer humano.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

Aqui, apresentamos um protocolo para introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida e, subsequentemente, acoplando a azida a uma sonda química por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

A oxidação do tiol proteico tem implicações significativas em condições fisiológicas e fisiopatológicas normais. Descrevemos os detalhes de um método proteômico redox quantitativo, que utiliza captura assistida por resina, marcação isobárica e espectrometria de massa, permitindo a identificação e quantificação específicas do local de resíduos de cisteína oxidada reversivelmente de proteínas.

Captura assistida por resina juntamente com marcação de massa em tandem isobárica para quantificação multiplexada da oxidação de proteína tiol

A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

Aprenda fluxos de trabalho de marcação isotópica com água enriquecida em 18O para estudos proteômicos quantitativos e qualitativos. Este método emprega proteases e catalisadores ácidos para incorporação de átomos de oxigênio.

Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando

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