Protease e catalisada por ácido Workflows Labeling Empregando

Esta apresentação demonstra fluxos de trabalho para a marcação com isótopos estáveis de digestos proteicos e peptídeos sintéticos utilizando água enriquecida com oxigênio 18, primeiramente no experimento de curso temporal paleo catalisado por protease, incubando substrato e protease na presença de água enriquecida com 50% de oxigênio 18 para incorporar átomos de oxigênio 18. Em seguida, quando a protease é capaz de dupla marcação, repita a incubação dos produtos da clivagem pós-digestão com a protease de interesse na presença de água enriquecida com 50% de oxigênio 18.

O fluxo de trabalho EO realiza a incorporação catalisada por ácido de átomos de oxigênio 18 em grupos funcionais em intervalos programados. Aliquotas retiradas das misturas reacionais são aplicadas com matriz em placas-alvo contaminadas e, durante a aquisição de dados por espectrometria de massas, geram gráficos espectrais ao longo do tempo das reações de clivagem de peptídeos, bem como gráficos de incorporação de oxigênio 18. Produtos de clivagem marcados, correspondentes a espécies peptídicas individuais, são selecionados para identificação da sequência com base em MS/MS. Em última análise, esses fluxos de trabalho oferecem ferramentas versáteis para estudos proteômicos qualitativos e quantitativos.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de pesquisa de proteases, como identificar a taxa, as etapas limitantes e os intermediários da reação em vias proteolíticas complexas. As assinaturas proteolíticas identificadas pelo curso temporal paleo fornecem informações importantes sobre a especificidade do substrato. Além disso, os temporizadores dos dados também utilizam informações cinéticas.

Um pós-doutorando do meu laboratório demonstrará agora o procedimento. O fluxo de trabalho da série temporal paleo monitora a dinâmica de reações de clivagem proteolítica com base na incorporação de oxigênio 18 catalisada por protease; para a reação de 20 microlitros, adicione os peptídeos da amostra ao tampão de reação da protease contendo água enriquecida com oxigênio 18, misture 0,5 microlitros da mistura de reação com 0,5 microlitros de matriz em um ponto da placa alvo maldi opti to 3 de 84 poços e deixe as gotas de solvente em temperatura ambiente até secar. Enquanto isso, divida a mistura de reação em dois tubos.

Controle e amostra para o tubo de amostra. Adicione a protease de interesse e incube na temperatura recomendada para a reação enzimática. Adicione os pontos de tempo especificados.

Retire uma alíquota de 0,5 microlitro para misturar com 0,5 microlitros de matriz e aplique na placa com múltiplos alvos. Prossiga para analisar a dinâmica da reação por análise de MS MALDI-TOF conforme descrito posteriormente neste fluxo de trabalho de marcação pós-digestão paleoproteômica. SN produz enzimas como tripsina, que catalisam a reação de troca de oxigênio carboxílico para incorporar oxigênio-18. Após realizar uma digestão proteica sem marcação com oxigênio-18, passe os produtos de clivagem por uma coluna giratória C18 pep clean para eliminar atividades proteásicas residuais.

Em seguida, reconstitua as amostras em 20 microlitros de tampão de reação da tripsina contendo água enriquecida com oxigênio 18. Retire uma alíquota de 0,5 microlitro e misture com volume igual de matriz. Em seguida, aplique em uma placa alvo MALDI Opti-Off 3 84 e deixe secar ao ar.

Em seguida, divida a solução da reação em tubos controle e tubos de amostra para o tubo de amostra. Adicione tripsina e incube a 37 graus Celsius. Para monitorar a reação, retire uma alíquota de 0,5 microlitro.

Misture com 0,5 microlitros de matriz e aplique em uma placa de maltar. Analise a dinâmica desta reação de troca de oxigênio carboxílico por análise Maldi Toof MSM S. O fluxo de trabalho de curso temporal IEO baseia-se nas reações de troca de oxigênio carboxílico catalisadas por ácido em grupos laterais e terminais ácidos de peptídeos.

Primeiro, incube 50 nanomolares de peptídeos individuais com água enriquecida com oxigênio 18 em proporção um para um, na presença ou ausência de ácido tricloroacético 0,1% final. Coletar alíquotas de 0,5 microlitros da reação diariamente durante 48 dias, coprecipitando diretamente com matriz sobre uma placa alvo MALDI. Submeta regularmente a placa alvo MALDI para análise de produtos por MALDI TOF MS. Esta seção está detalhada no manuscrito suplementar.

Primeiro, adquira espectros de MS em modo de íons positivos em triplicata. Após calibrar o múltiplo e configurar a aquisição de MS, adquira disparos únicos para subespectros. Em seguida, exporte os arquivos de dados de MS do software de aquisição de dados Explorer da série 4.000.

Em seguida, importe para um sistema de informação interno que utilize o software Mascot Distiller para processamento espectral e detecção de picos. Deconvolua os envelopes isotópicos e determine automaticamente as proporções de incorporação de oxigênio 18, observando essas proporções como as contribuições relativas de espécies isotópicas individuais do peptídeo para todo o envelope isotópico. Filtre a lista de bins e agrupe pelo menos três valores em uma largura de massa de 100 ppm para cada experimento de curso temporal.

Extraia as massas moleculares de todas as espécies de peptídeos detectadas a partir dos arquivos de dados de EM associados. Agora, utilizando o X pacey, defina um conjunto de peptídeos com uma tolerância de erro de massa de 200 PPM. Compare a lista de picos com os dados dos produtos de clivagem proteolítica previstos a partir da sequência do peptídeo substrato.

Prossiga para adquirir espectros msms para todos os valores de massa dos produtos de clivagem previstos pela ferramenta find pep e para valores de bin que tenham incorporações associadas de oxigênio 18. Colete dados MSM S de 50 disparos em um padrão randomizado por subespectro, com até 40 subespectros por ponto, e exporte os arquivos msms. Em seguida, exporte os arquivos de dados MSM S para o sistema de análise para detecção de picos e listas de picos MSM S associados aos dados de bend MS correspondentes para identificação de peptídeos.

Defina esses parâmetros de busca no motor de busca Mascot: nenhuma especificidade de enzima, tolerância de massa de íons precursor de 150 PPM e de íons fragmento de 0,2 Dalton. Realize a busca das listas M-S-M-S-P contra a base de dados Swiss-Prot. As identificações de peptídeos podem ainda ser validadas usando software explorador de dados, confirmando os padrões característicos de incorporação de oxigênio 18 nos íons fragmento ao longo dos gráficos temporais do espectro.

Exporte os arquivos de dados de EM para cada ponto de tempo da reação a partir do software explorador de dados, usando arquivos ASCI e uma macro. Em seguida, importe os arquivos para um programa de análise de dados e gráficos e exiba-os como gráficos em cascata para criar gráficos de incorporação de oxigênio 18 para cada dobra. A partir do produto da clivagem do peptídeo, extraia as contribuições relativas das espécies isotópicas individuais do peptídeo em todos os pontos de tempo da reação e, em seguida, plote em função do tempo.

Gráficos espectrais ao longo do tempo como este exibem a dinâmica de reações de clivagem proteolítica. Este experimento analisa a clivagem do peptídeo bioativo endo e C pela enzima conversora do endotélio um. Uma disposição em cascata plota os espectros de MS dos experimentos de curso temporal para monitorar simultaneamente a degradação do substrato e o surgimento de produtos intermediários e finais.

Os produtos de clivagem são identificados por espectrometria de massas em tandem (MSMS) e pelas assinaturas características da incorporação de oxigênio 18 nos seus envelopes isotópicos. Esse mecanismo de reação da tripsina indica que as proteases de corte promovem a incorporação de até dois átomos de oxigênio 18 nos produtos peptídicos de clivagem. No fluxo de trabalho de marcação baseado em proteases, a reação de clivagem da ligação peptídica resulta em uma razão de incorporação de 50% de oxigênio 18 simples para produtos de clivagem peptídica recém-gerados; proteases como a tripsina, que se ligam novamente aos produtos da reação, catalisam ainda mais a incorporação de um segundo átomo de oxigênio 18 por meio da reação de troca de oxigênio carboxílico.

No equilíbrio, o marcador oxigênio 18 é distribuído numa proporção de um para dois para um entre produtos não marcados, simplesmente marcados e duplamente marcados. No fluxo de trabalho de marcação com pré-digestão dos extremos proteolíticos, não ocorrem clivagens de ligações peptídicas. Em vez disso, a incorporação de até dois átomos de oxigênio 18 baseia-se exclusivamente na reação de troca de oxigênio carboxílico.

Portanto, a incorporação de oxigênio 18 ocorre apenas com proteases que reconectam seus produtos de clivagem peptídica. A marcação catalisada por ácido com oxigênio 18 leva à incorporação de dois átomos de oxigênio 18 por grupo carboxila. Ao longo deste experimento, os múltiplos deslocamentos de massa de dois Dalton no envelope isotópico da angiotensina um podem ser mapeados pela absorção de átomos de oxigênio 18.

Ao combinar a marcação com OPE e a espectrometria de massas de alta resolução de maneira cronometrada, o método de curso temporal paleo permite uma análise dinâmica da geração de produtos peptídicos. O ensaio pode ser utilizado para gerar peptídeos marcados topologicamente estabilizados para estudos proteômicos qualitativos e quantitativos, bem como para avaliar a cinética com que os peptídeos Protopic são gerados.

O curso temporal Paleo foi projetado para avaliar vias proteolíticas sob condições fisiologicamente relevantes. Esta técnica abriu caminho para nossa recente análise de processos líticos em microambientes de câncer humano.