Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando 'Genomics vírus simples'

O objetivo geral deste procedimento é isolar vírions individuais de uma comunidade mista e sequenciar o material genômico obtido para identificar vírus de diversos ambientes, sem a necessidade de cultivo. Isso é realizado primeiramente isolando os vírions individuais por meio de separação citométrica de fluxo em microesferas de agarose. A captura de um único vírion é então validada por microscopia confocal.

Em seguida, o material genômico é isolado dos viriões e amplificado utilizando a amplificação por deslocamento múltiplo ou MDA para gerar a quantidade de DNA necessária para o sequenciamento. Por fim, o DNA viral é sequenciado usando tecnologias de alto rendimento para gerar uma cobertura excessiva do genoma do virião, o que auxilia significativamente na montagem e anotação do genoma. Em última instância, técnicas bioinformáticas voltadas para o uso de abordagens de subamostragem de sequências permitem o aumento do tamanho dos contigs, possibilitando a análise de viriões isolados.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da ecologia viral ao fornecer contexto genômico ao vasto conjunto de genes de virioplâncton não anotados, além de permitir a descoberta de novos genomas provenientes de ecossistemas variados. Geralmente, indivíduos novos neste método podem enfrentar dificuldades, pois a amplificação e o isolamento de vírions individuais estão no limite da tecnologia atual. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao avaliar o uso da MDA em comunidades de virioplâncton e perceber que era possível separar uma única partícula viral e sequenciar, e assim montar um genoma viral completo a partir dessas comunidades complexas. Para separar vírus utilizando um citômetro de fluxo equipado com tubos fotomultiplicadores de dispersão para frente personalizados ou FSCPMT, comece diluindo as partículas virais em tampão tris-EDTA filtrado com 0,1 mícron. Para um conjunto misto contendo partículas de fagos T4 e lambda, ajuste o FSCPMT para 1000 e o SSC para 200 para maximizar a relação sinal-ruído.

Após executar as amostras controle, processe cerca de 100 microlitros da suspensão viral corada até um total de 5.000 eventos. Em seguida, utilize os gráficos de sybr green um e FSCPMT para posicionar um gate estreito no centro das partículas virais. Agora, adicione cinco microlitros de agarose de ponto de fusão baixo a 1% em tampão TBE resfriado a 37 graus Celsius em cada poço da lâmina de microscópio de P-T-F-E e, então, carregue a lâmina no citômetro de fluxo para capturar as partículas virais classificadas.

Inicie a separação, capturando 10 ou mais eventos de partículas virais em algumas das cavidades para auxiliar na detecção da profundidade dos vírus durante a microscopia confocal a laser. Quando a separação estiver concluída, remova a lâmina do citômetro de fluxo e adicione mais cinco microlitros de agarose de ponto de fusão baixo resfriada a 37 graus Celsius em cada cavidade, incorporando as partículas virais. Para vírions individuais, configure o microscópio confocal a laser para excitação em 488 nanômetros. Em seguida, visualize as partículas incorporadas usando uma objetiva de longa distância de trabalho de 63 x para verificar se apenas uma partícula está presente e se múltiplos vírus não estão empilhados uns sobre os outros. Após identificar as cavidades com vírus individuais, use uma lâmina de barbear para remover as esferas de agarose desejadas da lâmina e colocá-las em um tubo estéril de PCR.

Coloque o tubo no bloco de aquecimento de um termociclador ajustado a 94 graus Celsius por três minutos para lisar a partícula viral in loco. Em seguida, após realizar uma MDA modificada, transfira o DNA genômico para tubos Eppendorf de 1,7 mililitro e adicione um décimo do volume de acetato de sódio 3 molar em tampão TBE para purificar o material genômico amplificado. Incube as amostras a 55 graus Celsius por 10 minutos para dissolver a agarose e, em seguida, transfira os tubos para 42 graus Celsius para reduzir a temperatura antes da adição da enzima. Agora, adicione duas unidades de beta-agarase a cada tubo e incube os tubos por duas horas.

Em seguida, adicione um volume de uma solução tampão de fenol saturado a cada tubo. Agite vigorosamente e centrifugue os tubos por 15 minutos a 3.500 ×g em temperatura ambiente. Transfira os sobrenadantes contendo DNA para um novo tubo Eppendorf de 1,7 mililitro. A seguir, adicione um volume de isopropanol a 100% e um microlitro de azul de glicose aos tubos e inverta-os para misturar. Após centrifugar os tubos novamente, desta vez por 60 minutos a 28.000 ×g e quatro graus Celsius, despreze o isopropanol, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e adicione 150 microlitros de etanol a 70% a cada tubo. Centrifugue os tubos por 10 minutos a 28.000 ×g em temperatura ambiente. Remova o etanol, seque o pellet de DNA ao ar e reconstitua o DNA em um volume apropriado de tampão tris-EDTA. Esta reconstrução tridimensional de uma partícula viral corada com SYBR Green I dentro de uma esfera de agarose demonstra como a microscopia confocal a laser pode ser utilizada para visualizar e confirmar que um único virion é obtido em cada poço após ser capturado e embutido em agarose; o inseto mostra uma ampliação maior da partícula viral isolada.

Aqui é apresentado um gráfico de perfil da fluorescência relativa da partícula viral individual corada dentro de um grânulo de agarose. Esta série final de figuras mostra como quase todo o genoma Lambda, com exceção dos primeiros cinco pares de bases, foi recuperado para este vírus representativo. Aqui está o gráfico de GC para o genoma viral individual identificado. Esta figura mostra o mapa genômico do lambda. Finalmente, é apresentado o mapeamento de um genoma viral individual para o bacteriófago lambda isolado e amplificado representativo. O eixo X mostra a posição no genoma. O eixo Y mostra a porcentagem de cobertura.

Ao realizar este procedimento, é importante utilizar técnica estéril e dedicar tempo para garantir que a contaminação seja evitada. Após este procedimento, outros métodos podem ser utilizados para avaliar a taxonomia dos vírions isolados antes do sequenciamento completo do genoma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como isolar vírions individuais utilizando citometria de fluxo ativada por fluorescência, microscopia confocal e amplificação do genoma completo.