Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando 'Genomics vírus simples'

O objetivo geral deste procedimento é isolar um único variano de um consórcio misto e sequenciar o material genômico obtido para identificar vírus de uma variedade de ambientes sem a necessidade de cultivo. Isso é feito isolando primeiro os varians únicos usando a classificação citométrica do fluxo em esferas aro. A captura de íons únicos é então validada por microscopia confocal.

Em seguida, o material genômico é isolado do íon e amplificado usando amplificação de deslocamento múltiplo ou MDA para gerar a quantidade de DNA necessária para o sequenciamento. Finalmente, o DNA viral é sequenciado usando tecnologias de alto rendimento para gerar cobertura excessiva do genoma do vírion, auxiliando substancialmente na montagem e anotação do genoma. Em última análise, as técnicas de bioinformática destinadas a usar abordagens de subamostragem de sequência para aumentar o tamanho do con permitem a análise de vons isolados.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia viral, dando contexto genômico ao vasto conjunto de genes de plâncton OC anotados, bem como permitir a descoberta de novos genomas de ecossistemas variados. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método podem ter dificuldades porque a amplificação e o isolamento de íons únicos estão ultrapassando os limites da tecnologia atual. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando estávamos avaliando o uso de MDA em comunidades de plâncton Vero e percebemos que era possível classificar uma única partícula viral e sequência e, portanto, montar um genoma viral completo a partir dessas comunidades complexas Para classificar vírus usando um citômetro de fluxo equipado com tubos fotomultiplicadores de dispersão direta personalizados ou FSCPMT, comece diluindo as partículas virais em tris filtrados de 0,1 mícron, O EDTA para um conjunto misto contendo partículas de fago T quatro e lambda define o FSPCT para 1000 e o SSC para 200 para maximizar a relação sinal-ruído.

Depois de executar amostras de controle, execute cerca de 100 microlitros da suspensão viral sustentada para um total de 5.000 eventos. Em seguida, use o verde cibernético e os gráficos F-S-C-P-M-T para colocar um portão apertado no centro das partículas virais. Agora adicione cinco microlitros de aros de baixo ponto de fusão a 1% em tampão TBE resfriado a 37 graus Celsius a cada poço na lâmina do microscópio APTFE e, em seguida, carregue a lâmina no citômetro de fluxo para capturar as partículas virais classificadas.

Comece a classificar, capturando 10 ou mais eventos de partículas virais em alguns dos poços para auxiliar na detecção da profundidade dos vírus durante a microscopia confocal de varredura a laser. Quando a classificação estiver concluída, remova a lâmina do citômetro de fluxo e adicione mais cinco microlitros de aros de baixo ponto de fusão resfriados a 37 graus Celsius a cada poço. Incorporando as partículas virais para uma única varion.

Defina o microscópio confocal de varredura a laser para 488 nanômetros. A excitação então cria imagens das partículas incorporadas usando uma objetiva de distância de trabalho de 63 x mais longa para verificar se apenas uma única partícula está presente e se vários vírus não estão empilhados uns sobre os outros. Então, uma vez que os poços com vírus únicos tenham sido identificados, use uma lâmina de barbear para remover os grânulos de agros desejados da lâmina e coloque-os em um tubo de PCR estéril.

Coloque o tubo no bloco de calor de um termociclador ajustado para 94 graus Celsius por três minutos para cortar a partícula viral in situ. Em seguida, depois de realizar um MDA modificado, transfira o DNA genômico para tubos de 1,7 mililitro einor e adicione um décimo décimo volume de acetato de sódio de três molares em tampão TBE Para purificar o material genômico amplificado, coloque as amostras a 55 graus Celsius por 10 minutos para dissolver o aros e, em seguida, mova os tubos para 42 graus Celsius para reduzir a temperatura antes de adicionar a enzima. Agora adicione duas unidades de beta aase a cada tubo e incube os tubos por duas horas.

Em seguida, adicione um volume de uma solução de fenol saturado tampão a cada tubo. Misture vigorosamente e centrifugue os tubos por 15 minutos a 3.500 vezes G.At temperatura ambiente, transfira o DNA contendo SOBRENADANTES para um novo tubo einor de 1,7 mililitro. Em seguida, adicione um volume de isopropanol 100% e um microlitro de azul de glico aos tubos e inverta os tubos para misturar depois de centrifugar os tubos novamente.

Desta vez, por 60 minutos a 28.000 vezes G e quatro graus Celsius. Transvase o isopropanol, certificando-se de não perturbar o pellet e adicione 150 microlitros de etanol a 70% a cada tubo. Gire os tubos por 10 minutos a 28.000 vezes.

G à temperatura ambiente. Decantar o etanol ao ar seco, o sedimento de ADN e ressuspender o ADN num volume adequado de tampão tris EDTA. Esta reconstrução tridimensional de uma partícula viral verde cibernética, uma manchada dentro de uma velocidade agrícola demonstra como a microscopia a laser confocal pode ser usada para visualizar e confirmar que um único vírion é obtido em cada poço após ser capturado e incorporado em aros, a inserção mostra uma ampliação maior da partícula viral isolada.

Aqui é mostrado um gráfico de perfil da fluorescência relativa da partícula viral única corada dentro de um cordão de aros. Esta série final de figuras mostra como quase todo o genoma Lambda, com exceção dos cinco primeiros pares de bases, foi recuperado para este vírus representativo. Aqui está o gráfico GC para o vírus único.

O genoma identificado é mostrado. Esta figura mostra o mapa do genoma de lambda. Finalmente, o mapeamento de um único genoma de vírus é mostrado para a bactéria representativa isolada e amplificada phage lambda.

O eixo X mostra a posição do genoma. O eixo Y mostra a porcentagem de cobertura. Ao tentar este procedimento, é importante usar uma técnica estéril e reservar um tempo para garantir que a contaminação seja evitada.

Após este procedimento, outros métodos podem ser usados para avaliar a taxonomia dos varianos isolados antes do sequenciamento do genoma completo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar varians únicos usando classificação de células ativadas por fluorescência, microscopia confocal e amplificação do genoma inteiro.