Name: Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a monitorar espécies reativas de oxigênio derivadas da NADPH oxidase em modelos inflamatórios de camundongos usando imagem de bioluminescência. Este método minimamente invasivo permite quantificação em tempo real in vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH RO1 AI079253 e do Departamento de Assuntos de Veteranos.

1. Modelos Animais <ol><li> Ratos: Use p47 phox-/ - ratos e camundongos idade e sexo pareados C57BL6/DBA. Obter aprovação para as experiências de Animal Care Institucional e Comitê de uso. </li><li> Anestesia: Use um sistema de administração contínua isoflurano para induzir a anestesia. O sistema de vaporizador (VetEquip) é preenchido com isoflurano (2-3%). Confirmar que os ratos são totalmente anestesiado pela observação da respiração, movimento e reflexo da córnea em resposta a estímulos externos. </li><li> Procedimentos cirúrgicos: Esfregue a área cirúrgica (bancada) com etanol 70%. Usar luvas estéreis e um vestido cirúrgico limpo e máscara. Preparar os ratos por recorte do cabelo e aplicação de betadine alternando com etanol a 70% para a área onde a incisão será feita. Realizar uma cirurgia em uma superfície estéril e usar instrumentos esterilizados. Monitor de ratos pós-operatório até acordado e se movendo livremente. </li><li> Zymosan administração intratraqueal <ol><li> Administrar anestesiacomo descrito na secção 1.2. </li><li> Desinfectar área cirúrgica (pescoço) com betadine e 70% de etanol e expor a traqueia por dissecção cirúrgica. </li><li> Pierce traqueia com uma agulha de calibre 27 e injectar zimosan (St. Louis, MO) a uma dose de 1 ug / g utilizando uma 0,5 mg / uL solução (volume total de 50 ul de um ratinho de 25 g) dissolvida em PBS estéril. </li><li> Pescoço ratinhos perto enrolada com fio de seda 5-0 estéreis sob condições assépticas. </li><li> Imagem após 4 horas e 24 horas. </li></ol></li><li> Ligadura e perfuração cecal <ol><li> Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2. </li><li> Grampo de cabelo na área cirúrgica (abdómen) e desinfectar com betadine e etanol 70%. </li><li> Executar uma laparotomia mediana e identificar o ceco. </li><li> Ligar o 50% distal do ceco exposta com fio de seda 4-0 e ceco punção distal à ligadura com uma passagem de uma agulha de calibre 21. </li><li> Fechar a incisão com suturas de seda 4-0 estéreis. </li><li> Imagem depois de 4 horas e24 hr. </li></ol></li><li> Oral tetracloreto de carbono (CCl 4) administração <ol><li> Administrar anestesia, como descrito na secção 1.2. </li><li> Administrar CCl 4 (2 ng / g, St. Louis, MO), dissolvido em óleo de milho por meio de gavagem oral. O procedimento de CCl4 administração deve ser realizada em uma área designada de acordo com o IBC / EHS políticas. </li><li> Imagem após 4 horas e 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. Adquirir uma imagem Bioluminescent <ol><li> Inicializar o IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, configurado para o modo de luminescência, e esperar que o dispositivo de carga acoplada (CCD) de temperatura para bloquear. </li><li> Selecione o tempo de exposição, binning (médio) e F / Stop (8) definições. </li><li> Ratinhos coloque em posição supina na câmara de imagem em uma fase aquecida para manter a temperatura corporal normal. Administrar anestesia como descrito em 1.2 através de cone do nariz enquanto os ratos estão na câmara de imagem IVIS. </li><li> Administrar L-012<html> (20 ug / g), dissolvido em PBS estéril (10 ug / uL) por via intravenosa retro-orbital de injecção em cada ponto de tempo seleccionado para a imagem latente. </li><li> Captar imagens a partir de 2 min após injecção de L-012. Normalmente usamos uma exposição 40 seg. </li></ol> 3. Análise de Dados utilizando Região de Interesse <ol><li> Analisar os dados utilizando software imagem viva v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). </li><li> Abra uma imagem e selecionar a medição da Região de ferramentas de juros. </li><li> Selecione a Região de forma e tamanho interesse sobre o peito e / ou abdome após sobreposição de uma imagem pseudo-colorido digital (representando a detecção de fótons) sobre uma imagem fotográfica do mouse. </li><li> Quantificar a intensidade do sinal (fóton fluxo) da região de interesse. </li></ol> 4. Estatística <ol><li> Usar pacote de software de análise estatística para executar two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni em momentos individuais. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. Resultados representativos Zymosan é um pró-inflamatória levedura produto da parede celular e um potente activador de NADPH-oxidase 3. Que anteriormente mostraram que zymosan intratraqueal induz uma inflamação pulmonar neutrofílica mais robusto e pró-inflamatória da produção de citocinas em p47 phox-/ - em comparação com a estirpe selvagem ratos 1. Aqui, nosso objetivo foi o de comparar a geração de ROS nos pulmões de tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos após desafio zymosan. Às 4 horas após a administração de zymosan intratraqueal, observou-se um aumento significativo da emissão de fotões sobre o peito em ratinhos de tipo selvagem em relação à linha de base, bem como um aumento na emissão de fotões, em comparação com o tipo selvagem p47 phox-/ - murganhos em 4 h e 24 h. Em contraste, os sinais de bioluminescência em p47 phox-/ - ratinhos mantiveram-se em níveis de linha de base em 4 h após o tratamento por zimosan (Fig.1 AB). Assim, parece NADPH oxidase be a principal fonte de geração de ROS nos pulmões a seguir à administração zymosan. Em seguida, foi avaliada a produção de ROS no modelo de sepse por CLP induzido. A sepse é uma síndrome com risco de vida associado com lesões de órgãos-, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) 4, 5. ROS mediada por lesão foi considerado um factor importante dirigir-sepsia induzida por disfunção de múltiplos órgãos. Descobrimos que ROS foram significativamente aumentados sobre o peito (4 horas) e sobre o abdômen (24 horas) após CLP em camundongos de tipo selvagem em comparação à linha de base. No entanto, os níveis de ROS em p47 phox-/ - ratos foram semelhantes aos níveis de base em ambos os pontos de tempo (Fig.2 AC). Estes resultados mostram que a geração de ROS no modelo do rato induzida por CLP sepse é dependente da NADPH-oxidase. Finalmente, utilizou-se imagiologia bioluminescente para detectar a produção de ROS em um modo de lesão induzida por CCl 4 fígadol. CCl 4 provoca a necrose hepatocelular, e tem sido utilizado para modelar ambos lesão hepática aguda e fibrose hepática 6. Em contraste com os modelos anteriormente descritos de inflamação e lesão, verificou-se que a produção de ROS no abdómen foi modestamente (cerca de 35%) aumentado em relação ao valor basal phox p47-/ - ratos a 4 h após a administração de CCl 4. No entanto, a magnitude de CCl 4 induzida por geração de ROS foi significativamente maior nos ratos do tipo selvagem do que nas p47 phox-/ - camundongos (Fig. 3-B). Estes dados sugerem que tanto a p47 phox contendo NADPH oxidase-dependente e independente de geração de ROS ocorrer em CCl 4 aguda induzida por dano hepático. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Figura 1. Produção de ROS em pulmões após tratamento zymosan. A) Representante bioluminescence de imagem de produção de ROS. Note-se que, em adição ao peito, a luminescência é detectável sobre o abdómen, tanto de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos e luminescência abdominal é inalterado por tratamento zymosan. B) a contagem de fotões a partir da caixa de tipo selvagem e p47 phox-/ - murganhos depois de uma única injecção intratraqueal (IT) de zimosan. Imagem de bioluminescência foi realizada na linha de base, 4 h, e 24 h. A emissão de luz a partir da região de interesse sobre o tórax foi identificada utilizando a escala de pseudo cor-indicada. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 6-9 por grupo, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar a figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de ROS após CLP. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS, BFótons) conta a partir do peito, e conta C) de fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a CLP. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar a figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> Figura 3. Produção de ROS no abdômen após CCl 4 induzida por lesão hepática. A) imagem de bioluminescência Representante da produção de ROS e conta B) fótons do abdômen do tipo selvagem e p47 phox-/ - ratos na linha de base, 4 horas, e 24 horas após a administração oral CCl 4 tratamento. Os resultados são apresentados como média ± EP, n = 4-5 por grupo, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">figura clique aqui para ampliar</a> </a&gt;.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
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<li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease%2C+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li>
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<li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

&quot;Em tempo real&quot; de medição de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em animais vivos pode ser conseguido através da utilização de sondas fluorescentes e quimioluminescentes. Enquanto sondas fluorescentes com fracos sofrem de sinal-para-ruído 12, a técnica de imagem descrito é mais sensível para a detecção de emissão de luz na sequência de uma reacção química de ROS com o substrato luminol baseada em L-012. Como todas as técnicas de imagiologia bioluminescentes, esta metodologia é limitada pelo compri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals EUA, Inc. </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> tetracloreto de carbono </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de bioluminescência de nadph oxidase em diferentes modelos animais

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase é uma enzima importante que medeia a defesa do hospedeiro antibacteriana e antifúngica. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro antimicrobiana, NADPH oxidase tem funções críticas de sinalização que modulam a resposta inflamatória 1. Assim, o desenvolvimento de um método para medir, em &quot;tempo real&quot;, a cinética da NADPH-oxidase geração de ROS derivado deve ser uma ferramenta de investigação valiosa para compreender os mecanismos de defesa do hospedeiro em causa, inflamação e lesão. A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do NADPH oxidase caracterizada por infecções graves e inflamação excessiva. A activação da NADPH oxidase de fagócitos requer translocação das suas subunidades citosólicas (phox p47, p67 phox, e p40 phox) e Rac a um flavocytochrome ligada à membrana (composto de um phox gp91 e p22 phox heterodímero). Perdafunção de mutações em qualquer um destes componentes resultado NADPH oxidase na CGD. Semelhante ao dos pacientes com CGD, gp91 phox camundongos deficientes e P47 phox camundongos deficientes têm defeito oxidase de fagócitos NADPH e de acolhimento prejudicada defesa 13, 14. Além de fagócitos, que contêm os componentes da NADPH oxidase descritos acima, uma variedade de outros tipos de células expressam diferentes isoformas da NADPH-oxidase. Aqui, descrevemos um método para quantificar a produção de ROS em camundongos vivos e delinear a contribuição da NADPH oxidase para a geração de ROS em modelos de inflamação e lesão. Este método baseia-se ROS reagir com L-012 (um análogo do luminol) para emitir luminescência que é gravada por um dispositivo de carga acoplada (CCD). Na descrição original da sonda L-012, L-012-dependente de quimioluminescência foi completamente abolido pela superóxido-dismutase, o que indica que o principal ROS detectado nesta reacção foi superanião óxido 15. Estudos subsequentes têm mostrado que o L-012 pode detectar outros radicais livres, incluindo as espécies reactivas de azoto 16, 17. Kielland et al. 17 mostrou que a aplicação tópica de acetato de miristato de forbol, um activador potente da NADPH-oxidase, levou a NADPH oxidase-dependente de geração de ROS, que pode ser detectada em ratos usando o teste luminescente L-012. Neste modelo, eles mostraram que a luminescência L-012-dependente foi abolida em p47 phox camundongos deficientes. Nós comparamos geração de ROS em ratinhos de tipo selvagem e da NADPH-oxidase deficiente phox p47-/ - 2 ratos nos três seguintes modelos: administração 1) intratraqueal de zimosan, uma célula pro-inflamatório fúngico parede derivado do produto que podem activar a NADPH oxidase, 2) ligadura e perfuração cecal (CLP), um modelo de sepse intra-abdominal com inflamação pulmonar aguda e lesão secundária e 3) tetracloreto de carbono por via oral(CCl 4), um modelo de ROS-dependente lesão hepática. Estes modelos foram seleccionados para avaliar especificamente NADPH oxidase-dependente de geração de ROS no contexto de inflamação não infecciosa, sepse polimicrobiana e toxina induzida por lesão de órgãos, respectivamente. Comparando bioluminescência em camundongos de tipo selvagem de p47 phox-/ - ratos nos permite delinear a contribuição específica de ROS gerado pelo p47 oxidase phox contendo NADPH para o sinal bioluminescente nesses modelos. Resultados de imagem de bioluminescência que demonstraram níveis elevados de ROS em ratinhos de tipo selvagem em comparação com p47 phox-/ - ratos indicaram que a NADPH oxidase é a principal fonte de produção de ROS em resposta a estímulos inflamatórios. Este método oferece uma abordagem minimamente invasiva para &quot;real-time&quot; monitoramento da geração de ROS durante a inflamação in vivo.

NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

A NADPH oxidase é uma enzima crítica que medeia a defesa do hospedeiro contra bactérias e fungos. Além do seu papel na defesa antimicrobiana do hospedeiro, a NADPH...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma abordagem minimamente invasiva para o monitoramento em tempo real da geração de espécies reativas de oxigênio, ou ROS, derivadas da N-A-D-P-H oxidase em três modelos murinos inflamatórios diferentes. O primeiro modelo é a administração intra-traqueal de Xan, no qual a molécula pró-inflamatória Xan é injetada na traqueia de camundongos anestesiados. Xan é um produto derivado da parede celular fúngica que pode ativar a N-A-D-P-H oxidase.O segundo modelo é a ligadura e punção, ou CLP. Nesse caso, o abdômen do camundongo é aberto e o ceco é ligado com sutura de seda e, em seguida, perfurado com uma agulha para induzir sepse intra-abdominal e inflamação pulmonar aguda secundária com lesão. O terceiro modelo é a administração de tetracloreto de carbono por gavagem oral.O tetracloreto de carbono causa necrose hepatocelular e pode ser usado para modelar tanto lesão hepática aguda quanto fibrose hepática. A imagem bioluminescente é realizada em camundongos modelo para avaliar a produção de ERO. Os dados resultantes indicam que a NADPH oxidase é a principal fonte de geração de ERO em resposta a estímulos inflamatórios.A principal vantagem de

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

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Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

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Fonte: Weber, R. Z., et al., Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o método para imagens de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas geneticamente modificadas injetadas em um cérebro de camundongo. O processo envolve injeção de luciferina, preparação de imagens e detecção de sinais bioluminescentes das células transplantadas no local...

Imagem de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas em um cérebro de camundongo

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Um protocolo é descrito para detecção in vivo de efeitos de inibidores mitocondriais no organismo modelo Caenorhabditis elegans e para identificação de potenciais compostos potenciadores. Este protocolo pode ser usado para rastrear bibliotecas de medicamentos em busca de compostos que modulam a função mitocondrial.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.

Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo

Aprenda a monitorar espécies reativas de oxigênio derivadas da NADPH oxidase em modelos inflamatórios de camundongos usando imagem de bioluminescência. Este método minimamente invasivo permite quantificação em tempo real in vivo.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

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