Name: Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados de células epiteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a precipitar GEFs ativos de RhoA usando GST-RhoA(G17A) em lisados de células epiteliais. Este ensaio permite monitorar ativação de fatores de troca via Western blot e densitometria.

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Este trabalho foi financiado pelo Canadian Institute for Health Research (CIHR) (MOP-97774) e Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC, concessão nr: 480619). KS é um receptor de um Investigator Award KRESCENT Novo (um prêmio de conjunto da Kidney Foundation of Canada, Canadian Society Nephrology e Canadian Institute of Health Research) e um Prêmio Pesquisador precoce do Ministério de Ontário de Investigação e Inovação. FW é suportado por uma bolsa de Li Ka Shing.

1. Transformação de E. coli com o pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Preparar LB-Agar por dissolução de 2,5 g LB e 1,5 g Ágar em 100 ml dH 2 O. Autoclave e fresco para uma estimativa de 50-55 ° C, que, como regra geral, é quando o balão pode ser realizada confortavelmente. </li><li> Preparar Ampicilina stock (Amp) por dissolução de 50 mg / ml em dH 2 O. Filtro de seringa e congelar alíquotas não utilizadas. Adicionar 100 ul de estoque Amp (concentração final 50 ug / ml) à LB-Agar a partir de 1,1. Agite para misturar e despeje em pratos de 10 cm bacterianas (15-20 ml / prato). Permitir que a solidificar (15-30 min.) E armazenar as placas não utilizados invertida a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li><li> Para transformar E. Coli, rapidamente descongelar uma aliquota de DH5a competentes em um banho de gelo. Adicionar 1 ul de DNA pGEXRhoA (G17A) diluída a 25-50 ng / uL. Flick o tubo para misturar e incubar em gelo durante 30 minutos. Choque térmico a 42 ° C durante 45 segundos e volte a colocar em gelo durante 2 minutos. Adicionar 900 e mu; L meio SOC e crescer durante uma hora a 37 ° C com agitação. </li><li> Espalhe 50-100 uL das bactérias transformadas numa placa de LB-Agar-Amp usando uma pipeta de Pasteur estéril dobrada. Incubar a placa lado direito para cima numa incubadora a 37 ° C durante 5 minutos e, em seguida, inverter e crescer durante a noite. </li><li> Uma única colónia irá ser escolhido a partir da placa para a preparação da proteína GST-tag (passo 2.1). Para uso futuro, as placas do envoltório e armazenar invertido a 4 ° C durante cerca de 3 semanas. Além disso, as unidades de bactérias podem ser preparadas para armazenamento mais prolongado por crescentes colónias individuais em 2 ml estéril LB Amp-durante a noite a 37 ° C com agitação. Misturar uma aliquota com glicerol a 80% estéril numa proporção de 1:1 e congelamento a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de contas (G17A) GST-RhoA <ol><li> Preparar LB pela adição de 25 g LB a 1 L dH 2 0 e da autoclavagem. Quando esfriar, adicione 50 Amp ul do estoque para 50 LB ml (50 mcg / ml concentração final). Inocular com uma col bem isoladoony de bactérias transformadas e crescer durante a noite a 37 ° C com agitação. Quando a densidade total (OD 600&gt; 1,0) diluir com 450 ml LB Amp e crescer durante mais 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Preparar uma solução-mãe 100 mM de isopropil BD-tiogalactopiranósido (IPTG) por dissolução de 0,238 g em 10 ml dH 2 O. Armazenar em alíquotas a -20 ° C. Induzir bactérias para produzir proteína Rho por adição de 500 ul de 100 mM IPTG a 500 cultura ml (uma concentração final de 100 uM). Reduzir a temperatura para 22-24 ° C e crescer durante ~ 16 horas h. </li><li> Girar cultura a 3600 g durante 10 minutos a 4 ° C. Se necessário, a 500 ml de cultura pode ser dividida em tubos de 50 ml de centrifugação. Congelar pelete (s) durante pelo menos 1 hora (ou, de preferência durante a noite) a -80 ° C. </li><li> Preparar tampão de lise 200 ml contendo 20 mM de HEPES (0,95 g) / pH 7,5; 150 mM de NaCl (1,75 g); 5 mM de MgCl2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Prepare soluções estoque de 1M DTT (1,542 g em 10 ml de dH2O) E 100 mM de PMSF (0,174 g/10 ml de EtOH). Para preparar + tampão de lise, suplemento de 10 ml com 1 mM de DTT (10 ul de estoque) e 1 mM de PMSF (100 uL de stock) e uma completa Mini comprimido inibidor da protease. </li><li> Trabalhando em gelo, adicionar 10 ml de tampão de lise + para os peletes a partir do passo 2.3. Ressuspender bem em vórtice suave e pipetagem. Evite a formação de espuma. Sonicar em gelo durante 1 minuto a configuração 4 com o pulso de 50%. Girar o lisado sonicada a 15.000-20.000 g durante 15 minutos a 4 ° C, e remover o sonicado clarificado (sobrenadante) a um tubo ml estéril tapado 15. </li><li> Preparar a Sepharose Glutationa suavemente a mistura do tubo original contendo uma lama de 75% e 335 uL de transferência para um tubo de 15 ml. Use uma ponta larga furo para pipetar contas. Adicionar 10 ml PBS frio, e gira a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de tampão de lise + às pérolas e girar como para lavagem anterior. Descartar o sobrenadante e + tampão de lise suplemento para fazer uma suspensão de 50%. </li><li> Adicionar 250 ul de equilibrated suspensão do grânulo para o sobrenadante do passo 2.5. Rodar a 4 ° C durante 45 minutos. </li><li> Preparar 500 ml HBS contendo 20 mM de HEPES (2,38 g) / pH 7,5 e NaCl 150 mM (4,38 g) em dH 2 O. Prepare soluções de reserva de MgCl 1M 2 (0,952 g em 10 ml de dH2O) e DTT 1 M (1,542 g em 10 ml de dH2O). Para preparar HBS +, complementar 100 ml imediatamente antes da utilização com 5 mM de MgCl2 (50 ul de estoque) e 1 mM de DTT (100 uL de stock). </li><li> Girar os grânulos a partir do passo 2,7 a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e grânulos de lavagem 2x com 10 ml de tampão de lise +, e 2x com 10 ml HBS +. Após a lavagem final, fazer uma suspensão de 50% por ressuspensão das pérolas em HBs + suplementadas com BD BaculoGold inibidor de protease (20 uL de 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluir 10 ul da preparação final com pérolas de 2x tampão de amostra Laemmli contendo β-mercaptoetanol. Faça albumina bovina (BSA) padrões. Use de 2 mg / ml de caldo de (0,02 g de BSA em 10 ml de dH2O). Misturar 10 ul de estoque com 10 uL Laemmli (20 ug final); 5 ul de estoque com 5 uL de dH2O e 10 uL Laemmli (10 ug final); e 2,5 ul estoque com 7,5 uL de dH2O e 10 uL Laemmli (5 ug final). Ferver as amostras (5 min). Girar a amostra do grânulo e executar o sobrenadante com padrões de BSA e marcadores de peso molecular em um 10% de gel de SDS-poliacrilamida. </li><li> Preparar o Comassie mancha azul (0,1 g em 10 ml de ácido acético, 40 ml de metanol e 50 ml de dH2O) ea solução destain (500 ml de dH2O, 400 ml de metanol e 100 ml de ácido acético). Armazene à temperatura ambiente. Manchar o gel por 20-30 minutos, retire o corante (pode ser reutilizada várias vezes) e lavagem com solução destain duas vezes. Continuar a destain com agitação suave durante várias horas até que as bandas são claramente visíveis. </li><li> Estimar a concentração de GST-RhoA (G17A), acoplado às esferas utilizando os padrões de BSA como referência (Fig. 2). Aliquot por um volume igual de esferas contendo ~ proteína ug 10-15 em 1,5 ml de tubos de centrifugação de micro. Loja contas a 4 ° C para uso dentro de um dia. Congelar a -80 ° C em HBS + glicerol / na proporção de 3:1 para utilizar dentro de poucos dias. </li></ol> 3. GEF Ensaio Pulldown com nucleotídeos livres RhoA (G17A) Beads <ol><li> Crescer as células em 10 pratos cm a confluência. Soro privar durante pelo menos 3 horas e tratar como requerido. </li><li> Preparar tampão de lise + como no passo 2.4. Preparar tampão de lise suficiente para 700 ul / prato mais alguma quantidade extra para permitir pipetagem erros. Adicionar os inibidores de protease imediatamente antes da utilização. </li><li> Trabalhando em gelo, remover o meio de cultura a partir dos pratos e lava-se com gelada HBS. Remova todo o HBS e adicionar 700 + tampão ul lise para cada prato. Redemoinho placas para cobrir todas as áreas, raspar e coletar lisados ​​em numeradas tubos de 1,5 ml. Girar a 15.000 g durante 1 min a 4 ° C. O sobrenadante será utilizado para o ensaio. </li><li> Se o seu número de celular é equivalente em todos ospratos a serem testados, você pode omitir a fazer um ensaio de proteína, e passar para o passo 3.5. Caso contrário medir a concentração de proteína de cada sobrenadante utilizando o Bio-Rad ensaio de proteína rápida e equalizar o sobrenadante para o volume e concentração. A quantidade de proteína total depende dos tipos de células utilizados (tipicamente 1-1,5 mg de proteína para as células LLC-PK1). </li><li> Remover 30 ul de cada sobrenadante e misture com 30 2x ul redução amostra Laemmli tampão ferver e reserve para o passo 3.7. Adicionar sobrenadantes restantes para as alíquotas de GST-RhoA (G17A) grânulos a partir do passo 2,12. Girar durante 45 minutos a 4 ° C. </li><li> Girar grânulos em 6800 g durante 10 segundos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se os grânulos 3x com tampão de lise, a fiação da mesma maneira entre as lavagens. Remover completamente a lavagem final utilizando uma seringa cc 1 equipada com uma agulha 30 G e adicionar 20 uL 2x reduzindo tampão de amostra Laemmli. Ferver durante 5 min. Rodar para contas de pelotização e quer executar o sobrenadante imediatamente (preferível) ou armazená-lo umt -80 ° C para posterior análise. </li><li> Executar 20 uL lisados ​​de células totais e de todas as amostras de proteína precipitados sobre o apropriado percentagem de gel de SDS-poliacrilamida para o tamanho de GEF está a estudar. Detectar a sua GEF da escolha por Western blotting utilizando um anticorpo específico. </li></ol> 4. Os resultados representativos Parte 1 e 2 do protocolo descreve a preparação de GST-RhoA (G17A) acoplado a GSH-sepharose grânulos e seus testes por SDS-PAGE (ver descrição do protocolo na Fig. 1). Um gel corado com Coomassie típico é mostrado na Fig. 2. A amostra com a proteína eluída deve conter uma única banda a aproximadamente 50 kDa (Fig. 2, pista 6). A concentração da proteína pode ser estimada utilizando as amostras de referência de BSA. No exemplo na Fig. 2, a concentração de RhoA (G17A) é estimada em 15 uL μg/10. Assim, alíquotas de 10 uL / ​​tubo foram preparados. O rendimento típico<html> na nossa mão é 15-20 mg de proteína de 10 ml de lise bacteriana. Parte 3 do protocolo descreve o ensaio de precipitação afinidade (ver sinopse na Figura 1). Um ensaio de GEF bem sucedida detectar a activação do factor de troca GEF-H1 é mostrado na Fig. 3. O RhoA proteína (G17A) capturado alguns GEF-H1 a partir do controle (não tratado) lisados ​​celulares, sugerindo que o GEF-H1 tem actividade basal. A quantidade precipitado no entanto o aumento nas células tratadas com a necrose inflamatória citocina tumoral-α (TNF-α), consistentes com a noção de que o TNF-α activa GEF-H1 5,7. Importante, os lisados ​​de células totais mostram quantidades similares de GEF-H1 no controlo e da amostra tratada, sugerindo que o tratamento não alterou GEF-H1 níveis ea entrada usada no ensaio é de igual. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral do protocolo. ove_content &quot;&gt; <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figura 2. Resultado representativo do protocolo de preparação do grânulo. Um gel corado com Coomassie com sucesso GST-RhoA preparação do grânulo (G17A) é mostrado. Amostra do grânulo e padrões proteicos de BSA foram separadas por SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 10%. Para testar os grânulos, 10 uL da suspensão final talão contendo GST-RhoA (G17A) é diluída 1:01 com tampão de amostra Laemmli redução e fervida durante 5 minutos. As pérolas foram centrifugadas eo sobrenadante brevemente carregado no gel. As seguintes amostras foram carregadas: Pista 1: marcador de peso molecular (MW) (FroggaBio BLUeye prestained escada de proteína); Lanes 2-4: 5, 10 e 20 ug de albumina sérica bovina (BSA); Pista 5 está vazia; pista 6: 10 ul dos preparados na hora RhoA (G17A) contas. Após a separação é completada, o gel é corado usando azul de Coomassie e, subsequentemente, descorados para revelar as proteínas. O peso molecular do GST-RhoA proteína (G17A) é aproximadamente 50<html> kDa e corre em volta do nível do marcador kDa 48. A concentração da proteína GST-Rho nesta amostra particular é estimado em cerca de 15 lama μg/10 uL. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figura 3. Representativas ensaio de activação GEF mostrando TNF-α induzida por activação de GEF-H1. Confluentes LLC-PK1 células foram tratadas com 10 ng / ml de TNF-α durante 5 minutos. Após o tratamento, as células foram lisadas e GEFs activas foram capturadas utilizando GST-RhoA (G17A) grânulos ligados. A presença de GEF-H1 nas proteínas precipitadas (blot topo) e amostras de células totais Lysate (blot inferior) foi detectada utilizando Western blotting com um anticorpo anti-GEF-H1 (sinalização celular). Note que o aumento da quantidade de precipitado GEF-H1 em TNF-α-tratados versus não-tratados com células relativos às entradas equivalentes, indicando um bom resultado. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Um &quot;mau resultado&quot;. Embora o ensaio de pulldown GEF mostrado aqui resultou em alguns GEF-H1 capturado pelos grânulos, os montantes precipitado a partir de controlo e TNF-α células tratadas são os mesmos. TNF-α Assim, um ativador de know GEF-H1, neste caso, não induziu a ativação. Neste solução de problemas experiência particular subsequente sugerido que o TNF-α utilizado não era fresco suficiente e, provavelmente, degradada.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método aqui apresentado é o ensaio de ativação só está disponível para não-radioativo GEFs que pode seguir a piscina activa de GEFs nas células. O ensaio é semelhante para os ensaios de precipitação utilizados para a activação seguinte de GTPases pequenas, bem como contra GEFs Rac e Cdc42. Esses ensaios de usar diferentes proteínas GST-etiquetados e têm ligeiras diferenças de a descrita aqui, no entanto os passos básicos são os mesmos. Assim, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros GTPase pequeno e ensaios de activação do GEF. O ensaio apresentado GEF foi recentemente modificado para pedido de frações nucleares 9,10. Com alterações posteriores, os testes de ativação GEF em outros compartimentos celulares também poderia ser possível. Nós utilizamos o método apresentado para estudar a activação de GEFs em linhas de células epiteliais 5,6,7. Com algum optimização, neste ensaio devem ser adequados para detectar GEFs a partir de qualquer linha de células. Quando adapting a um tipo específico de célula, localizar o número de células óptima, o volume de tampão de lise, e método de detecção para o GEF a ser testado (um anticorpo bom para Western blotting é importante). Para a configuração inicial do ensaio, é aconselhável utilizar um estímulo que é conhecido para activar o GEF de interesse. Ao usar um estímulo desconhecido, sempre usar um controle positivo para verificar se o ensaio está funcionando. Este ensaio pode ser usado para detectar a activação de GEFs conhecidos por Western blotting. No entanto, também é adequado para identificar GEFs desconhecidos. Para isso, GEFs capturados de controlo e as amostras estimuladas devem ser analisados ​​num gel de Coomassie-coradas. Bandas que aparecem apenas em amostras estimuladas pode conter GEFs ativados e podem ser enviados para identificação por espectrometria de massa (por exemplo, 5). Finalmente, uma nota de advertência. O ensaio é baseado na suposição de que as modificações pós-tradução que tornam GEFs activas são preservadas após lise celular. Na verdade, este é claramente o caSE para um número de GEFs, e desde que os seus estabelecimentos, este ensaio foi utilizada por vários grupos para detectar a activação de GEFs diferentes, incluindo GEF-H1, p115RhoGEF e XPLN (por exemplo, 5,11,12,13). Preservação do estado ativo, contudo, não pode acontecer no caso de todos os GEFs e, portanto, é concebível que este teste não vai funcionar para todos os GEFs. Tem também a ser observado, que muitos GEFs exercer atividade para mais de um GTPases pequenas. Assim, quando um GEF específica é estudada, é recomendado para complementar este ensaio com os ensaios de precipitação GEF para outros GTPases pequenas, bem como estudos funcionais examinando RhoA, Rac1 e Cdc42. Etapas críticas do protocolo: Colônias de bactérias transformadas devem ser colhidos a partir frescas, pratos preparados adequadamente para garantir a adequada seleção de Amp, crescimento bom e produção. Condições de transformação de células competentes obtidos de outras fontes pode variar e deve ser consultado. </p&gt; Todos os passos do protocolo de preparação de proteína (a partir do passo 2.3) eo ensaio (a partir do passo 3.2) deve ser realizado a 4 ° C com soluções arrefecidas e centrífugas. A lise bacteriana (passo 2,5) deve ser minuciosa e completa, a fim de obter uma suspensão homogénea. Quando a lise bactérias vórtice, e pipetar o lisado alternadamente, mantendo ao mesmo tempo que a 4 ° C e assegurar sonicação é feito em gelo para evitar a desnaturação da proteína. Se estiver usando um modelo diferente de sonicador, as condições podem ter de ser ajustada. A incubação de sonicado com as esferas devem sempre ser feito a 4 ° C num rotor de ligação para assegurar suficiente, e deve ser tomado cuidado para manter a temporização consistente. GST-Rho mutantes são um pouco instável quando expresso em bactérias, por isso o melhor é usar contas preparadas imediatamente ou dentro de poucos dias. O ensaio de precipitação (Parte 3) é o tempo e sensível a temperatura, umaGEFs s activas podem ser facilmente perdido a partir do lisado celular, de modo que os passos deve ser realizado tão rapidamente quanto possível. A seção seguinte contém algumas dicas de resolução de problemas. Não ou quantidade muito baixa de proteína mutante Rho na preparação final do grânulo: Isto pode ser causado por indução ineficiente, a lise das bactérias insuficiente, ou uma perda da proteína durante o processo de preparação ou de armazenamento. Para ajudar a resolver algumas dessas possibilidades, as amostras de bactérias podem ser analisada antes e após a indução. Se houver indução pobre da proteína repetir o processo usando uma colónia de uma placa de recém-listradas ou a partir de re-transformadas células competentes. As concentrações IPTG diferentes e tempos de indução também devem ser testados. Se a lise é insuficiente (isto é, a proteína permanece no pelete em vez do sobrenadante) variando de sal e de detergente concentrações no tampão de lise pode ser tentado. Alternados vezes sonicação econfigurações devem ser considerados, e as amostras antes e depois de sonicação pode ser verificada por microscopia para determinar a eficiência de lise. N precipitado GEF, mesmo que a proteína GST-, está presente nas pérolas: Isto pode ser devido a problemas técnicos durante o ensaio de precipitação, ou por uma ausência real de activação do GEF estudada utilizando o estímulo aplicado. Usar sempre um estímulo conhecido como um controlo positivo para verificar que o seu ensaio funciona. Use as esferas preparadas dentro de poucos dias. Se o ensaio de precipitação captura quantidades indetectáveis ​​de o GEF estudados em todas as condições, verificar que o seu GEF está presente e é bem detectável no sobrenadante após a centrifugação que está a ser utilizado para o ensaio (passo 3.3). Certifique-se de todos os tampões e os inibidores da protease são frescos, e realizar todos os passos sobre o gelo o mais rápido possível. Aumentar a quantidade de proteína de entrada (por exemplo, utilizando lisados ​​a partir de 2 placas / amostra). Se o ensaio de precipitação mostra precipitação basalção do seu GEF, mas nenhuma diferença é observada entre o controle e amostras estimuladas (fig. 4), começar a solucionar por meio da verificação de que o estímulo aplicado funcionou usando outros efeitos conhecidos (por exemplo, detectar a ativação de outras vias de sinalização). Considere alterar as condições de tratamento e / ou concentrações. Conte com os dados do relatório da literatura como o seu estímulo ativa Rho ou sinalização outras vezes para prever prováveis ​​e concentrações. Quando optimizar o tempo de tratamento, utilizar ambos os pontos de tempo curto e longo, tal como a activação GEF pode ser melhor detectável a um ponto de tempo antes da activação bem detectável Rho. Finalmente, o mesmo estímulo pode resultar em um grau variável de activação devido a uma mudança na capacidade de resposta de células causada por número de passagens, a célula de confluência, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Estará disponível em breve </td><td> Gerado no laboratório do Dr. Keith Burridge (University of North Carolina) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Loja -80 ° C </td></tr><tr><td> SOC médio </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Mantenha estéril </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Estoque armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropil BD-thiogalacto-piranósido) </td><td> Calbio bioquímica </td><td> 420322 </td><td> Solução estoque da loja a -20 ° C </td></tr><tr><td> Esferas de glutationa Sepharose </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Inibidor da protease 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr&gt; <td> Completa Mini, EDTA livre 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Amostra tampão Laemmli 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Adicionar pouco antes de usar </td></tr><tr><td> Azul Brilhante de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Caledon </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Caledon </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Escada BLUeye </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Reagentes Tabela 1. Utilizado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> RC-5B centrífuga </td><td> Sorvall </td><td> Rotor SS-34 </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrífuga de micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Use a 4 ° C </td></tr><tr><td> Shaker bacteriano </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Use a 37 ° C ou a 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicador </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Use à RT </td></tr><tr><td> Rotor </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Use a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Equipamentos específicos utilizados.

afinidade precipitação do active rho-gefs usando um gst-marcado mutant proteína rho (gst-rhoa (g17a)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

As proteínas da família Rho de GTPases pequenas são reguladores centrais do citoesqueleto, e controlar uma grande variedade de processos celulares, incluindo a migração de células, a expressão do gene, a progressão do ciclo celular e adesão celular 1. Proteínas Rho são interruptores moleculares que estão ativos no GTP-bound e inativos do PIB-bound estado. A sua activação é mediada por uma família de guanina-nucleotídicas de Câmbio Fator (GEF) proteínas. Rho-GEFs constituem uma grande família, com sobreposição de especificidades 2. Embora muito progresso tem sido feito na identificação dos GEFs ativados por sinais específicos, existem ainda muitas questões pendentes relativas ao regulação da via específica dessas proteínas. O número de Rho-GEFs excede 70, e cada célula expressa mais do que uma proteína GEF. Além disso, muitas destas proteínas activar não só Rho, mas outros membros da família, contribuindo ainda mais a complexidade das redes de regulação. Importante, explorandocomo GEFs são regulados requer um método de seguir a piscina activa de GEFs individuais em células activadas por estímulos diferentes. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo para um método utilizado para avaliar e quantificar as disponíveis activas Rho-específicos GEFs usando um ensaio de precipitação de afinidade. Este ensaio foi desenvolvido há alguns anos no laboratório Burridge 3,4 e nós tê-lo usado em linhas de células renais tubulares 5,6,7. O ensaio de tira proveito de um &quot;nucleótido livre&quot; mutante RhoA, com uma elevada afinidade para GEFs activas. A mutação (G17A) torna a proteína incapaz de se ligar PIB ou GTP e este estado imita o estado intermediário que é ligado ao GEF. Uma versão GST-etiquetados desta proteína mutante é expressa e purificada a partir de E. coli, ligada a esferas de glutationa Sepharose e usado para precipitar GEFs activas a partir de lisados ​​de células não tratadas e estimulada. Como a maioria dos GEFs são ativados através de modificações pós-tradução ou versão de ligações inibitórias, seu estado ativoé preservada em lisados ​​de células, e eles podem ser detectadas por este ensaio 8. Proteínas capturados podem ser sondado para GEFs conhecidos pela detecção de anticorpos específicos utilizando Western blot, ou analisados ​​por espectrometria de massa para identificar GEFs desconhecidos ativados por estímulos certos.

O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados ​​celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.

Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

As proteínas da família Rho de pequenas GTPases são reguladores centrais do citoesqueleto e controlam uma grande variedade de processos celulares, incluindo a célula...

O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a ativação de RO por fatores específicos de troca de G-D-P-G-T-P, ou GAFs, em células cultivadas, fazendo uso de uma proteína de fusão mutante RO A GST que possui alta afinidade por GS ativada. Isso é realizado primeiramente produzindo a proteína mutante RO marcada com GST em bactérias. Em seguida, a proteína RO A GST ligada a microesferas é purificada.Em seguida, a pureza e a concentração da proteína GST RO A são avaliadas utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. Por fim, lisados celulares são preparados e um ensaio de precipitação GEF é realizado com a proteína GST RO A. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram aumento da precipitação de GS ativada em células tratadas, por meio de análise por western blot das proteínas precipitadas com um anticorpo específico anti GF e quantificação por citometria de densidade.Este método pode ajudar a responder diversas questões empolgantes na área de GTPases brutas, como por exemplo como os diversos fatores de troca G-D-P-G-T-P são regulados de maneira específica ao sinal e como sua atividade é coordenada. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades inicialmente porque a proteína GST RO G 17 A é relativamente instável e pode se degradar durante o preparo. Também é importante lembrar de realizar o ensaio de precipitação de GF rapidamente e de forma consistente. Demonstrará este procedimento Pfizer Vahid, um aluno de mestrado do meu laboratório, para transformar a e coli.Coloque rapidamente um tubo de células competentes DH5α em banho de gelo e adicione um microlitro de DNA PX row A G 17 A na concentração de 25 a 50 nanogramas por microlitro. Agite levemente o tubo para misturar e incube em gelo por 30 minutos. Submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 45 segundos e retorne-as ao gelo por dois minutos.Adicione 900 microlitros de meio de meias e cultive por uma hora a 37 graus Celsius com agitação. Usando uma pipeta estéril de pasta curvada, espalhe de 50 a 100 microlitros das bactérias transformadas em uma placa de ágar LB e persina previamente preparada. Incube a placa com a face para cima em uma estufa a 37 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, inverta e cultive durante a noite.Escolha uma colônia bem isolada de bactérias transformadas e utilize-a para inocular 50 mililitros de LB com ampicilina. Incube durante a noite a 37 graus SIUs com agitação. Quando o cultivo atingir densidade máxima, dilua-o com 450 mililitros de LB com ampicilina e cultive por mais 30 minutos. A 37 graus Celsius, induza as bactérias a produzirem a proteína recombinante pela adição de 500 microlitros de IPTG 100 milimolar a um cultivo de 500 mililitros.Reduza a temperatura para 22 a 24 graus Celsius e cultive por cerca de 16 horas. Centrifugue a cultura a 3.600 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Congele os pellets por pelo menos uma hora ou, preferencialmente, durante a noite a menos 80 graus Celsius.Após preparar 200 mililitros de tampão de lise conforme descrito no protocolo escrito, prepare o tampão de lise mais suplementando 10 mililitros com DTT 1 milimolar, PMSF 1 milimolar e um comprimido de inibidor de protease, trabalhando no gelo. Adicione 10 mililitros do tampão de lise mais aos pellets de Thor e homogeneíze completamente por pipetagem e vortex. Sonique a suspensão no gelo por um minuto no nível quatro com pulso de 50%.Centrifugue o lisado sonicado a 15.000 a 20.000 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e transfira o sobrenadante clarificado para um tubo estéril com tampa de 15 mililitros. Prepare as esferas de glutationa misturando suavemente a suspensão a 75% e utilizando uma ponteira de grande orifício para transferir 335 microlitros para um tubo de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de PBS frio e centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o agente sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão de lise mais aos grânulos e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante novamente e adicione tampão de lise.Além disso, para fazer uma suspensão a 50%, combine duas alíquotas de 50 microlitros de suspensão de perlas equilibrada com o sobrenadante preparado. Incube em rotação a quatro graus Celsius por 45 minutos. Prepare o HBS mais suplementando 100 mililitros de tampão HBS com cloreto de magnésio 5 milimolar e DTT 1 milimolar. Centrifugue o sobrenadante e as perlas a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante e lave as esferas duas vezes com 10 mililitros de tampão de lise mais e duas vezes com 10 mililitros de HBS mais. Após a última lavagem, prepare uma suspensão a 50% ressuspendendo as esferas em HBS mais suplementado com inibidor de protease. Dilua 10 microlitros da preparação final de esferas em tampão amostral lam ly duas vezes contendo beamr cap dois etanol.Em seguida, prepare três amostras padrão de BSA misturando 10 microlitros, cinco microlitros e então 2,5 microlitros de uma solução estoque de BSA a dois miligramas por mililitro com 10 microlitros de tampão lammy.Ferva as amostras por cinco minutos, depois centrifugue brevemente e eletroforese todas juntamente com um marcador de peso molecular em um gel de poliacrilamida SDS a 10%. Após a coloração e a dessensibilização do gel, estime a GST row A G 17 A utilizando os padrões de BSA como referência. Aliquote volumes iguais de esferas contendo cerca de 10 a 15 microgramas de proteína em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Para preparar o ensaio de precipitação por GF, cultive as células a serem usadas até a confluência em placas de 10 centímetros e prive-as de soro por pelo menos três horas antes do ensaio.Imediatamente antes do início do ensaio, prepare o tampão de lise com inibidores de protease em gelo. Remova o meio de cultura dos recipientes e lave com HBS frio.Remova todo o HBS e adicione 700 microlitros de lisamento. Adicione o tampão mais a cada placa. Incube as placas para cobrir todas as áreas.Em seguida, raspe e colete os lisados em tubos numerados de 1,5 mililitro. Centrifugue a 15.000 ×g por um minuto a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante para o ensaio; se o número de células foi equivalente em cada placa, retire 30 microlitros de cada sobrenadante e misture com 30 microlitros de tampão amostral redutor duas vezes concentrado.Em seguida, ferva e reserve em gelo. Adicione os sobrenatantes restantes a alíquotas das microesferas GST row a G 17 A e incube sob rotação por 45 minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue as microesferas a 6.800 ×g por 10 segundos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante e lave as perlas três vezes com tampão de lise. Utilizando uma seringa de um CC equipada com uma agulha de 30 graus, remova completamente a última lavagem e adicione 20 microlitros de tampão amostral redutor 2X. Ferva as amostras por cinco minutos, centrifugue para sedimentar as perlas e aplique os lisados celulares totais e as amostras de proteína precipitada em um gel de SDS-PAGE com a porcentagem apropriada para o tamanho da GF em estudo.Por fim, realize um western blot para detectar o fator de troca GFA bem-sucedido no ensaio de GF. Aqui é mostrada a detecção da ativação do fator de troca GFH um. A proteína A G 17 da linha capta parte do GFH um dos lisados de células controle, sugerindo que o GFH um possui atividade basal.A quantidade precipitada, no entanto, aumentou em células tratadas com a citocina inflamatória fator de necrose tumoral alfa, consistente com a noção de que o TNF alfa ativa a G FH um. Importante, o lisado celular total mostra quantidades semelhantes de gfh um na amostra controle e na tratada, sugerindo que o tratamento não alterou os níveis de G FH um e que a quantidade utilizada no ensaio foi igual. Ao adaptar este procedimento, é importante manter a proteína GSE RO G 17 A e os CELLIS oitos em gelo.Realize o ensaio GF rapidamente e de forma consistente, e utilize controles positivos adequados que permitam a invalidação e a resolução de problemas.

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Biology

Biologia

Este protocolo utiliza um pull down ensaio para determinar os níveis de GTPase RhoC ativa dentro das células.

RhoC Assay Activation GTPase

Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

Este vídeo demonstra um ensaio de competição para estudar parceiros de proteínas de ligação à GTPase. Utilizando a proteína GTPase ligada a nucleotídeos imobilizada em esferas magnéticas, a ligação competitiva entre dois parceiros de proteína que interagem para o mesmo local de ligação na GTPase pode ser estudada para avaliar as afinidades de ligação dos parceiros de proteína.

Ensaio de ligação de competição para estudar parceiros concorrentes de proteínas de ligação à GTPase

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Este protocolo compara as afinidades relativas dos parceiros de ligação para GTPases da família Rho, incluindo Rac1. In vivo, as proteínas de ligação a Rac1 competem por uma única interface de ligação, cuja conformação é ditada por um nucleotídeo ligado. O nucleotídeo é importante e difícil de controlar experimentalmente, devido à alta taxa de hidrólise.

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

G4 Resolvase1 liga-se a (G4) estruturas G-quadruplex com mais apertados afinidade reportada para uma proteína de ligação e G4 representa a maior parte da actividade de desenrolamento-G4 ADN em células HeLa. Nós descrevemos um protocolo romance que aproveita a afinidade e atividade desenrolamento dependente de ATP G4-Resolvase1 para purificar especificamente G4R1 recombinante cataliticamente ativo.

Uma Abordagem DNA afinidade G-quadruplex para a purificação de enzimaticamente activa G4 Resolvase1

O manuscrito, descreveremos o uso de um ensaio de repórter de fluorescência baseada em fermento para identificar componentes celulares envolvidos no tráfico e matar processos dos citotóxicos uma subunidade da ricina de toxina da planta (RTA).

Um ensaio simples repórter baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para toxina ricina uma cadeia (RTA) o tráfico de levedura

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

Este estudo apresenta métodos experimentais para caracterizar bioquimicamente o GFAP e suas mutações causadoras de doenças, com foco na montagem, agregação e modificação pós-translacional de filamentos. Proteínas GFAP de alta pureza foram analisadas, revelando insights sobre os mecanismos da doença de Alexander que podem fornecer uma estrutura para estudar potenciais alvos terapêuticos e compreender mutações GFAP e distúrbios relacionados.

Abordagens experimentais para análise bioquímica da proteína ácida fibrilar glial e suas variantes associadas a doenças

Aprenda a precipitar GEFs ativos de RhoA usando GST-RhoA(G17A) em lisados de células epiteliais. Este ensaio permite monitorar ativação de fatores de troca via Western blot e densitometria.

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Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliais

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