Afinidade Precipitação do Active Rho-GEFs Usando um GST-marcado Mutant proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados de células epiteliais
31 de março de 2012
O método aqui apresentado descreve um ensaio para seguir a activação de factores específicos RhoA GDP / GTP Câmbio (GEFs) em células de cultura, fazendo uso de uma proteína de fusão GST mutante RhoA que tem elevada afinidade para GEFs activados. GEFs são precipitados a partir de lisados celulares, detectadas por Western blotting e quantificada por densitometria.
O objetivo geral deste procedimento é acompanhar a ativação de RO por fatores específicos de troca de G-D-P-G-T-P, ou GAFs, em células cultivadas, fazendo uso de uma proteína de fusão mutante RO A GST que possui alta afinidade por GS ativada. Isso é realizado primeiramente produzindo a proteína mutante RO marcada com GST em bactérias. Em seguida, a proteína RO A GST ligada a microesferas é purificada.
Em seguida, a pureza e a concentração da proteína GST RO A são avaliadas utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. Por fim, lisados celulares são preparados e um ensaio de precipitação GEF é realizado com a proteína GST RO A. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram aumento da precipitação de GS ativada em células tratadas, por meio de análise por western blot das proteínas precipitadas com um anticorpo específico anti GF e quantificação por citometria de densidade.
Este método pode ajudar a responder diversas questões empolgantes na área de GTPases brutas, como por exemplo como os diversos fatores de troca G-D-P-G-T-P são regulados de maneira específica ao sinal e como sua atividade é coordenada. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades inicialmente porque a proteína GST RO G 17 A é relativamente instável e pode se degradar durante o preparo. Também é importante lembrar de realizar o ensaio de precipitação de GF rapidamente e de forma consistente. Demonstrará este procedimento Pfizer Vahid, um aluno de mestrado do meu laboratório, para transformar a e coli.
Coloque rapidamente um tubo de células competentes DH5α em banho de gelo e adicione um microlitro de DNA PX row A G 17 A na concentração de 25 a 50 nanogramas por microlitro. Agite levemente o tubo para misturar e incube em gelo por 30 minutos. Submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 45 segundos e retorne-as ao gelo por dois minutos.
Adicione 900 microlitros de meio de meias e cultive por uma hora a 37 graus Celsius com agitação. Usando uma pipeta estéril de pasta curvada, espalhe de 50 a 100 microlitros das bactérias transformadas em uma placa de ágar LB e persina previamente preparada. Incube a placa com a face para cima em uma estufa a 37 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, inverta e cultive durante a noite.
Escolha uma colônia bem isolada de bactérias transformadas e utilize-a para inocular 50 mililitros de LB com ampicilina. Incube durante a noite a 37 graus SIUs com agitação. Quando o cultivo atingir densidade máxima, dilua-o com 450 mililitros de LB com ampicilina e cultive por mais 30 minutos. A 37 graus Celsius, induza as bactérias a produzirem a proteína recombinante pela adição de 500 microlitros de IPTG 100 milimolar a um cultivo de 500 mililitros.
Reduza a temperatura para 22 a 24 graus Celsius e cultive por cerca de 16 horas. Centrifugue a cultura a 3.600 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Congele os pellets por pelo menos uma hora ou, preferencialmente, durante a noite a menos 80 graus Celsius.
Após preparar 200 mililitros de tampão de lise conforme descrito no protocolo escrito, prepare o tampão de lise mais suplementando 10 mililitros com DTT 1 milimolar, PMSF 1 milimolar e um comprimido de inibidor de protease, trabalhando no gelo. Adicione 10 mililitros do tampão de lise mais aos pellets de Thor e homogeneíze completamente por pipetagem e vortex. Sonique a suspensão no gelo por um minuto no nível quatro com pulso de 50%.
Centrifugue o lisado sonicado a 15.000 a 20.000 ×g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e transfira o sobrenadante clarificado para um tubo estéril com tampa de 15 mililitros. Prepare as esferas de glutationa misturando suavemente a suspensão a 75% e utilizando uma ponteira de grande orifício para transferir 335 microlitros para um tubo de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de PBS frio e centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o agente sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão de lise mais aos grânulos e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante novamente e adicione tampão de lise.
Além disso, para fazer uma suspensão a 50%, combine duas alíquotas de 50 microlitros de suspensão de perlas equilibrada com o sobrenadante preparado. Incube em rotação a quatro graus Celsius por 45 minutos. Prepare o HBS mais suplementando 100 mililitros de tampão HBS com cloreto de magnésio 5 milimolar e DTT 1 milimolar. Centrifugue o sobrenadante e as perlas a 500 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e lave as esferas duas vezes com 10 mililitros de tampão de lise mais e duas vezes com 10 mililitros de HBS mais. Após a última lavagem, prepare uma suspensão a 50% ressuspendendo as esferas em HBS mais suplementado com inibidor de protease. Dilua 10 microlitros da preparação final de esferas em tampão amostral lam ly duas vezes contendo beamr cap dois etanol.
Em seguida, prepare três amostras padrão de BSA misturando 10 microlitros, cinco microlitros e então 2,5 microlitros de uma solução estoque de BSA a dois miligramas por mililitro com 10 microlitros de tampão lammy.
Ferva as amostras por cinco minutos, depois centrifugue brevemente e eletroforese todas juntamente com um marcador de peso molecular em um gel de poliacrilamida SDS a 10%. Após a coloração e a dessensibilização do gel, estime a GST row A G 17 A utilizando os padrões de BSA como referência. Aliquote volumes iguais de esferas contendo cerca de 10 a 15 microgramas de proteína em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Para preparar o ensaio de precipitação por GF, cultive as células a serem usadas até a confluência em placas de 10 centímetros e prive-as de soro por pelo menos três horas antes do ensaio.
Imediatamente antes do início do ensaio, prepare o tampão de lise com inibidores de protease em gelo. Remova o meio de cultura dos recipientes e lave com HBS frio.
Remova todo o HBS e adicione 700 microlitros de lisamento. Adicione o tampão mais a cada placa. Incube as placas para cobrir todas as áreas.
Em seguida, raspe e colete os lisados em tubos numerados de 1,5 mililitro. Centrifugue a 15.000 ×g por um minuto a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante para o ensaio; se o número de células foi equivalente em cada placa, retire 30 microlitros de cada sobrenadante e misture com 30 microlitros de tampão amostral redutor duas vezes concentrado.
Em seguida, ferva e reserve em gelo. Adicione os sobrenatantes restantes a alíquotas das microesferas GST row a G 17 A e incube sob rotação por 45 minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue as microesferas a 6.800 ×g por 10 segundos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante e lave as perlas três vezes com tampão de lise. Utilizando uma seringa de um CC equipada com uma agulha de 30 graus, remova completamente a última lavagem e adicione 20 microlitros de tampão amostral redutor 2X. Ferva as amostras por cinco minutos, centrifugue para sedimentar as perlas e aplique os lisados celulares totais e as amostras de proteína precipitada em um gel de SDS-PAGE com a porcentagem apropriada para o tamanho da GF em estudo.
Por fim, realize um western blot para detectar o fator de troca GFA bem-sucedido no ensaio de GF. Aqui é mostrada a detecção da ativação do fator de troca GFH um. A proteína A G 17 da linha capta parte do GFH um dos lisados de células controle, sugerindo que o GFH um possui atividade basal.
A quantidade precipitada, no entanto, aumentou em células tratadas com a citocina inflamatória fator de necrose tumoral alfa, consistente com a noção de que o TNF alfa ativa a G FH um. Importante, o lisado celular total mostra quantidades semelhantes de gfh um na amostra controle e na tratada, sugerindo que o tratamento não alterou os níveis de G FH um e que a quantidade utilizada no ensaio foi igual. Ao adaptar este procedimento, é importante manter a proteína GSE RO G 17 A e os CELLIS oitos em gelo.
Realize o ensaio GF rapidamente e de forma consistente, e utilize controles positivos adequados que permitam a invalidação e a resolução de problemas.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para acompanhar a ativação de fatores de troca GDP/GTP específicos para RhoA (GEFs) em células cultivadas, utilizando uma proteína de fusão GST com mutante de RhoA. O ensaio envolve a precipitação de GEFs a partir de lisados celulares, seguida pela detecção por meio de Western blot e quantificação por densitometria.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Transdução de Sinal
- Bioquímica de Proteínas
Antecedentes
- RhoA é uma pequena GTPase envolvida em diversos processos celulares.
- As GEFs desempenham um papel crucial na ativação de RhoA, facilitando a troca de GDP por GTP.
- Compreender a regulação das GEFs é importante para elucidar as vias de sinalização.
- Métodos anteriores para estudar a atividade das GEFs apresentam limitações em especificidade e sensibilidade.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio confiável para monitorar a ativação de GEF em células vivas.
- Investigar os mecanismos regulatórios dos GEFs de RhoA.
- Fornecer uma estrutura para estudos futuros sobre as vias de sinalização de RhoA.
Métodos Utilizados
- Produção de uma proteína RhoA mutante com marcação GST em bactérias.
- Purificação e avaliação da proteína GST-RhoA utilizando SDS-PAGE.
- Preparação de lisados celulares para ensaios de precipitação de GEF.
- Análise por blotagem ocidental para detecção e quantificação de proteínas precipitadas.
Principais Resultados
- Foi observado aumento na precipitação de GEFs ativadas em células tratadas.
- O teste de Western blot confirmou a especificidade do ensaio.
- A densitometria forneceu dados quantitativos sobre os níveis de ativação de GEF.
- O método demonstrou potencial para responder perguntas fundamentais na sinalização de RhoA.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para o estudo da ativação de GEF.
- Os conhecimentos obtidos podem aprimorar a compreensão da regulação da sinalização de RhoA.
- Este método pode facilitar pesquisas adicionais sobre processos celulares relacionados a GEF.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação de Rho-GEFs ativos em lisados de células epiteliais aborda um desafio crítico na análise da regulação específica de sinais dentro de redes complexas de GTPases. Este ensaio de precipitação por afinidade permite a medição direta dos estados de ativação de GEFs, apoiando a confiança preditiva na investigação de vias e na validação de alvos. A capacidade do método de distinguir a ativação de GEFs dependente de estímulo orienta decisões iniciais de descoberta e triagem de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da ativação de Rho-GEF em resposta a estímulos celulares definidos.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer a regulação de GEF específica da via.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da detecção quantitativa de pools ativos de GEF.
- Fornece dados para priorizar alvos com base na resposta ao estímulo e no envolvimento da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um ensaio de precipitação validado para quantificar GEFs ativos em lisados celulares.
- Fornece resultados reprodutíveis e quantitativos adequados para análise comparativa entre diferentes condições.
- Permite a padronização das condições do ensaio para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos ou estímulos na ativação de GEFs.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à sinalização relevante para doenças ao medir a ativação de GEF em resposta a estímulos fisiopatológicos.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica da modulação da via.
- Informa o avanço ajustado ao risco ao vincular a ativação molecular a desfechos funcionais.
- Apoia o desenvolvimento de biomarcadores ao permitir a detecção de assinaturas de ativação específica de GEF por estímulo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio de precipitação por afinidade integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes baseados em hipóteses da ativação de GEF, apoiando tanto a validação de alvos quanto estudos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Quantifica GEFs ativos para esclarecer o envolvimento de vias e desriscamento biológico.
- Triagem: Fornece uma plataforma de ensaio reprodutível para avaliação de moduladores da atividade de GEFs.
- Análises: Fornece resultados quantitativos de Western blot e densitometria para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona eventos de sinalização celular a estímulos relevantes para doenças e potenciais biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma estrutura de ensaio reutilizável, adaptável a diversos tipos celulares e estímulos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e mapeamento de vias.
- Valor Operacional: Padroniza a medição da ativação de GEF para reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidências mecanicistas do engajamento do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em dados quantitativos de ativação de vias.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em purificação de proteínas, lise celular e técnicas de imunodetecção.
- Exige acesso à infraestrutura de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), Western blot e densitometria.
- Necessita padronização rigorosa do tempo e da temperatura do ensaio para preservar a atividade de GEF.
- Adaptável a diversas linhagens celulares e estímulos, com controles e validações apropriados.
- A instabilidade proteica e a velocidade do ensaio são limitações práticas que exigem otimização cuidadosa.
