Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)
17 de março de 2012
Um modelo do rato para a esclerose lateral amiotrófica (ELA) é examinado clinicamente e comportamentalmente. Como um pré-requisito para uma análise imuno acompanha a preparação da medula espinal é descrito em detalhe.
Olá, meu nome é Lar Turner. Sou pós-doutoranda no Departamento de Neurologia da Universidade de Ingham, Alemanha. Olá, meu nome é Lin Gunda.
Sou estudante de medicina e estou realizando meu trabalho de conclusão de curso neste laboratório. Hoje vamos mostrar a vocês o teste clínico do SODG 93, um modelo murino de esclerose lateral amiotrófica. Além disso, demonstraremos o teste de função motora com um chamado teste de rotor e, adicionalmente, outro teste de função motora com a grelha suspensa para realizar uma análise imunológica.
Após a realização dos testes funcionais nos camundongos a s, um procedimento necessário consiste na remoção da medula espinhal, do nervo STIC e do músculo gastrocnêmio. Desejamos mostrar esse procedimento cirúrgico em detalhes e apresentar alguns achados imunológicos exemplares ao final. Ok, mas agora vamos começar primeiramente pelos testes clínicos.
Este é um MOE do tipo selvagem de movimento livre que não apresenta quaisquer sintomas clínicos, como tremor muscular ou Parsis, em nosso sistema de classificação clínica. Isso corresponderia à pontuação quatro. Este é um MOE transgênico A LS.
Em um estágio inicial da doença, o animal apresenta um tremor severo da pata traseira direita, o que o classifica como escore três E. As anormalidades graves na marcha classificam este animal como escore dois. O arrastamento de pelo menos uma pata traseira é classificado como escore clínico um no teste do fio suspenso, no qual a força muscular bruta é avaliada. Cada camundongo é colocado sobre um fio especialmente confeccionado e cuidadosamente virado de cabeça para baixo acima de um botão coberto com palha.
Após o treinamento por três vezes consecutivas de pelo menos 180 segundos, a latência para quedas é medida. Cada camundongo recebe até três tentativas para se segurar na tampa invertida por um máximo de 180 segundos, e o período mais longo é registrado em comparação com o camundongo branco do tipo selvagem no lado direito. O camundongo transgênico com placas no lado esquerdo é muito fraco e cai da tampa antes de atingir o máximo.
O aparelho de haste rotatória é usado para medir a coordenação motora, o equilíbrio e a capacidade de aprendizado motor. Um bom desempenho exige um alto grau de coordenação sensoriomotora. Ele consiste em um eixo giratório controlado por computador e movido a motor, com cinco pistas para cinco m.
As falhas dos camundongos são detectadas automaticamente pela pressão exercida na placa plástica inferior. Após o treinamento por três vezes consecutivas de pelo menos 180 segundos a uma velocidade constante de 15 rotações por minuto, mede-se o tempo durante o qual um animal consegue permanecer sobre o rotarod em rotação. Cada animal realiza três tentativas e a maior latência sem cair é registrada.
O mos selvagem saudável do lado esquerdo está correndo sem dificuldade sobre a haste rotatória. Em contraste, o mos transgênico a s do lado direito apresenta sérios problemas para permanecer na haste rotatória e escorrega após algum tempo, observado de trás. Você vê as graves dificuldades de locomoção do camundongo retre esquerdo.
Em comparação com o camundongo saudável no teste do fio rotativo, ele não consegue acompanhar a velocidade da barra rotatória e não consegue empurrar para cima com as patas dianteiras. Para realizar uma análise imunoquímica da medula espinhal, os animais precisam ser sacrificados. É muito importante seguir rigorosamente as diretrizes locais quanto à condução adequada de experimentos com animais.
Neste contexto, nesta visão geral muito simplificada da coluna vertebral e dos tecidos circundantes, as principais estruturas anatômicas são representadas. Colocaremos o animal em posição ventral e iniciaremos o preparo dos músculos a partir da bolsa dorsal. Após a remoção do tecido muscular, acessaremos a coluna vertebral que envolve a medula espinhal.
Após o animal ter sido sacrificado e perfundido com uma solução contendo paraformaldeído, a medula espinhal pode ser removida. O animal é posicionado sobre uma mesa cirúrgica e as patas completas são fixadas nas laterais para expor a região dorsal do camundongo. O animal é umedecido para achatamento da pelagem e facilitar a incisão cutânea subsequente.
Para isso, utiliza-se um bisturi afiado. Tenha cuidado para esticar a pele para ambos os lados. Para facilitar o corte, o músculo da perna deve ser preparado.
A pele deles também deve ser incisionada. Após a conclusão da incisão na pele, ela é suavemente puxada para o lado. Com um par de pinças, removidos os músculos da pata e o nervo ciático, continuamos a nos aproximar da medula espinhal e colocamos o animal em uma nova mesa cirúrgica.
Agora é fácil identificar o crânio, o pescoço, os músculos e a coluna vertebral. Após identificar todas essas estruturas, é simples prosseguir para a próxima etapa. Os músculos do pescoço e o ligamento nu devem ser removidos.
Tenha cuidado para não fazer incisões muito profundas e atingir a coluna vertebral. No próximo passo, os músculos paravertebrais são removidos completamente para expor a coluna vertebral. Para acessar a coluna vertebral, várias osteotomias precisam ser realizadas.
Iniciamos pela parte cervical da coluna vertebral, incluindo a articulação átlanto-occipital. Para realizar a laminectomia, precisamos cortar o arco vertebral para poder remover todos os processos vertebrais do corpo vertebral. Conforme explicado anteriormente, a laminectomia começa com o corte dos arcos vertebrais.
Em seguida, a lâmina pode ser puxada para longe. Novamente, tenha cuidado para não lesar a medula espinhal, pois muitas mais ral precisam ser removidas. É bastante útil usar tesouras anguladas e fazer incisões em vários arcos vertebrais de ambos os lados ao mesmo tempo.
Em seguida, puxe os processos dorsais para remover completamente as lâminas vertebrais e o closeup. Observe que o par de tesouras deve ser cuidadosamente inserido o mais lateralmente possível ao lado do canal espinhal. As partes laterais remanescentes da coluna vertebral devem ser removidas para facilitar a posterior remoção completa da medula espinhal.
Um marco anatômico da medula espinhal são as chamadas intumescências cervical e lombar. Após concluir as ectomias de toda a medula espinhal, certifique-se de também seccionar todas as raízes ventrais da medula espinhal e liberá-la da dura-máter das meninges. Em seguida, a medula espinhal cervical é cortada.
Cranialmente, e a remoção é iniciada novamente. Toque a medula espinhal com muita cautela para não danificar esse tecido, pois isso poderia causar sérias limitações para análises imunoimunoquímicas posteriores. A remoção da medula espinhal prossegue então no nível torácico e continua até a parte lombar.
Finalmente, faz-se outro corte agora ao lado da cauda equina. Agora somos capazes de liberá-la completamente. Aqui você vê a medula espinhal posicionada bem ao lado de sua localização original na coluna vertebral.
Por fim, é colocado em uma solução fixadora de Paraformaldeído. Como exemplo clássico de análise imuno-histoquímica da medula espinhal, pode-se aplicar um anticorpo que reconhece a colina acetiltransferase para identificar os neurônios motores no corno anterior da medula espinhal. Aqui você observa um grande número de neurônios motores em um animal saudável do tipo selvagem.
Em contraste, o animal transgênico com ELA em estágio final realmente apresenta um número muito menor de neurônios motores no corno anterior. Após assistir a este artigo em vídeo, você deverá ter aprendido o exame clínico básico do camundongo SODG93.A, um modelo da esclerose lateral amiotrófica.
Dois testes comportamentais motores foram demonstrados: o teste de rotação e o teste do fio suspenso. Eles oferecem uma boa possibilidade de avaliar a função motora básica. São fáceis de realizar, sensíveis na detecção de déficits motores e eficientes em termos de tempo.
A parte principal deste vídeo consiste em uma demonstração da técnica de preparação da medula espinhal. Esta pode, é claro, ser aplicada a qualquer outro modelo de doença em camundongo e é uma etapa essencial para a posterior análise imunocitoquímica da patologia da doença na medula espinhal. Obrigado por assistir.
Esperamos que este artigo em vídeo seja útil para seus futuros experimentos.
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Visão Geral
Este estudo examina um modelo murino para esclerose lateral amiotrófica (ALS) por meio de avaliações clínicas e comportamentais. O preparo da medula espinhal é detalhado como pré-requisito para análise imunohistoquímica.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise comportamental
- Imunohistoquímica
Contexto
- A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa.
- Modelos murinos são essenciais para o estudo dos mecanismos da ELA.
- Testes comportamentais ajudam a avaliar a função motora nesses modelos.
- A análise imunohistoquímica fornece informações sobre a patologia da medula espinhal.
Objetivo do Estudo
- Avaliar clinicamente e comportamentalmente um modelo murino de ELA.
- Preparar amostras da medula espinhal para análises adicionais.
- Demonstrar testes de função motora relevantes para a pesquisa de ELA.
Métodos Utilizados
- Teste clínico do modelo de camundongo SODG 93.
- Avaliação da função motora utilizando testes de rotor.
- Testes de preensão em fio suspenso para avaliar habilidades motoras.
- Preparação imunohistoquímica de amostras da medula espinhal.
Resultados Principais
- Demonstração bem-sucedida de testes de função motora no modelo de camundongo.
- Métodos detalhados de preparação para análise da medula espinhal.
- Conhecimentos sobre as características comportamentais do modelo.
- Alicerce para estudos imunohistoquímicos adicionais.
Conclusões
- O modelo de camundongo fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa da ELA.
- Avaliações comportamentais são fundamentais para compreender a progressão da doença.
- A análise imunohistoquímica aumentará o conhecimento sobre a patologia da ELA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Testes clínicos e comportamentais robustos no modelo de camundongo SOD1 (G93A) para ELA permitem avaliação quantitativa de déficits motores e progressão da doença, apoiando a validação precoce de alvos terapêuticos e a redução de riscos mecanicistas. A integração de pontuação padronizada e análise imunohistoquímica fornece confiança preditiva para pesquisas translacionais e triagem de portfólios. Essas capacidades sustentam o avanço ajustado ao risco de novos terapêuticos para ELA em pipelines pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Sistemas quantitativos de pontuação motora permitem a investigação objetiva de hipóteses terapêuticas em modelos de ELA.
- A fenotipagem comportamental esclarece os mecanismos da doença e apoia a validação funcional de alvos.
- Desfechos clínicos padronizados facilitam a confiança preditiva e o triagem de portfólios para programas de neurodegeneração.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Ensaios validados de função motora (rotarod, fio suspenso) fornecem leituras reprodutíveis e escalonáveis para triagem de compostos.
- Saídas quantitativas apoiam a padronização de ensaios e a comparabilidade entre estudos.
- Parâmetros comportamentais e histológicos permitem avaliação confiável de intervenções candidatas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- A análise imunohistoquímica do tecido da medula espinhal alinha achados pré-clínicos com biomarcadores relevantes para a doença.
- A continuidade do fenotipagem comportamental até a histopatologia sustenta o rigor translacional.
- A caracterização abrangente do modelo orienta decisões de avanço com ajuste de risco em portfólios de ELA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho integra descobertas iniciais, identificação de compostos promissores e validação pré-clínica na pesquisa da ELA ao combinar desfechos comportamentais, clínicos e histológicos.
- Biologia da Descoberta: Permite testes de hipóteses e desvio de riscos mecanicistas por meio de avaliações quantitativas motoras e histológicas.
- Triagem: Fornece pontos finais comportamentais prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medidas quantitativas e sistemas de pontuação para comparação estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Alinha resultados pré-clínicos com biomarcadores relevantes para a doença, garantindo continuidade clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para modelos de ELA e outras doenças neurodegenerativas relacionadas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos na ELA.
- Valor Operacional: Apoia a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e uma gestão eficiente de portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos para doenças neurodegenerativas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em fenotipagem comportamental e preparação cirúrgica de tecidos.
- Exige acesso a instrumentação especializada para testes motores e análise histológica.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes nos protocolos de pontuação e ensaios.
- Adaptável a outros modelos de doenças neurodegenerativas com validação apropriada.
- Depende do cumprimento das diretrizes de bem-estar animal e éticas para estudos pré-clínicos.
