Name: Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprenda testes clínicos e remoção da medula espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica. Este método demonstra avaliação motora e preparação para análise imunohistológica.

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LT recebeu apoio concessão do Forschungsförderungsprogramm da Medicina da Universidade de Göttingen. PL e MB foram apoiados pelo Centro de Pesquisas DFG para Fisiologia Molecular do Cérebro (CMPB), Göttingen. Os autores agradecem ao Dr. Lars Tatenhorst de assistência com videografia e Liebau Birgit ajuda com áudio e edição de vídeo.

Os animais foram adquiridos a Jackson Laboratory (# 002,726) 1. Eles são clinicamente marcados e submetidos a um teste de função motora (rotarod teste) e da força muscular (pendurado teste do fio). Todos estes ensaios ea morte dos animais mais tarde, a fim de preparar a medula espinal foram realizados em conformidade muito perto das orientações locais para a conduta apropriada de experiências com animais. 1. Pontuação clínica Para além da avaliação para os ratos de peso corporal são examinados para sinais de déficit motor com o seguinte sistema de pontuação de 4 pontos 2: 4 pontos: normal (sem sinal de disfunção motora) 3 pontos: tremores nos membros posteriores são evidentes quando suspenso pela cauda 2 pontos: anormalidades da marcha estão presentes 1 ponto: arrastando de pelo menos um membro posterior 0 ponto: simétricoincapacidade paralisia, para a direita em si ou a perda de 20% do peso corporal máximo; neste caso, os animais são sacrificados imediatamente ea experiência é terminada 2. Testes da função motora e força muscular Pendurado fio Este teste é utilizado para avaliar a força muscular 3, 4. Todos os animais realizar este teste, pelo menos, um ou dois dias após o teste de rotarod. Cada rato é colocado em uma tampa de arame sob medida com intervalos de 0,8 cm e cautelosamente virou de cabeça para baixo, 60 cm acima de um fundo de palha coberto. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 s a latência para cair é medido. Cada rato é dada até três tentativas para segurar a tampa invertida para um máximo de 180 S e no período mais longo é gravado. Rotarod Teste 3, 4. Um bom desempenho requer um elevado grau de coordenação sensório. A máquina deve ser colocado em um ambiente calmo e não-perturbador para evitar estímulos de interferências para o animal testado. É constituída por uma controlado por computador do fuso motorizado rotativo e cinco pistas durante cinco ratinhos. Quedas dos ratinhos são detectados automaticamente pela pressão sobre uma placa de plástico na parte inferior. Após a formação por três vezes consecutivas de pelo menos 180 S a uma velocidade constante de 15 rpm, o tempo para o qual um animal pode permanecer sobre a haste rotativa é medido. Cada animal passa por três provas e mais longa latência, sem cair é gravado. O tempo de 180 s é escolhido como cut-off tempo, porque a maioria das diferenças significativas na coordenação motora são detectados neste espaço de tempo. 3. Preparação da Medula Espinhal <ol class="lalpha"><li> Os animais são mortos por insuflação de CO 2, de acordo com as orientações locais e são imediatamente perfundido transcardially com solução de PBS, seguido por uma solução de paraformaldeído a 4%. </li><li> A fim de preparar a medula espinal do rato sacrificados, o animal é colocado sobre uma mesa de operação e os quatro membros são fixados no lado, a fim de expor o lado de trás do rato. </li><li> Um curto da lavagem com uma solução de etanol a 70% limpa o local de dissecção e achata a pêlo. </li><li> Em seguida, a pele é incisão com um bisturi afiado na linha mediana. A fim de facilitar o corte da pele é esticada para ambos os lados. Se os músculos das pernas devem ser preparadas, sua pele também tem de ser feita uma incisão. </li><li> Após a incisão na pele é completado, é puxado para o lado com um par de pinças para expor a fáscia superficial do corpo. </li><li> A musculatura do pescoço e do ligamento nucal tem que ser removido e são carefully preparado. Tenha cuidado para não incisar a profundamente e lesão na medula espinhal. Os músculos do ombro também pode ser removido de modo a melhor expor a coluna vertebral. </li><li> Em seguida, os músculos paravertebrais são removidos a partir de toda a coluna vertebral. </li><li> A fim de abrir os laminectomias da coluna vertebral vários têm de ser realizados. Deve-se começar a partir da parte superior do crânio no local da articulação atlanto-occipital. </li><li> É mais fácil remover a fixação dos dois membros superiores e esticar o pescoço para ser mais capazes de realizar a laminectomia das vértebras primeiro. Estes são afastou sem tocar o exposto medula espinhal cervical. </li><li> Mais vértebras são removidos por primeiro rasguem a arcos vertebrais em ambos os lados com uma tesoura em ângulo e, em seguida, puxando os processos dorsal. Restantes partes laterais das vértebras devem ser removidos para facilitar a posterior remoção completa da medula espinhal. </li><li> Um marco anatômico da espinha lombarl é o cabo de intumescência que também está presente na medula cervical. </li><li> Tendo terminado a laminectomia de toda a medula espinhal, certifique-se que você também transect todas as raízes ventrais e liberar a medula espinhal a partir da dura-máter das meninges. </li><li> Em seguida, a medula espinhal cervical cranial é cortado e você começa a remover a medula espinhal. </li><li> Finalmente, a medula espinhal é também cortado na cauda distal-eqüina para ser completamente liberado. </li><li> Em última análise, a medula espinal é colocado dentro de uma solução postfixating (por exemplo, paraformaldeído a 4%) durante a noite e podem ser posteriormente tratados. Nós geralmente cryosection da medula espinhal para prepará-lo para análise imuno. </li></ol> 4. Os resultados representativos A técnica de preparação da medula espinal representa o foco deste artigo de vídeo. É um pré-requisito essencial para o seccionamento de tecidos mais tarde e, finalmente, para análise imuno de espinhaCabo seções l. Como um exemplo de um resultado final, um workup imuno-histoquímica da região corno anterior do rato medula espinal lombar de um tipo selvagem (wt) e de um SOD G93A transgene (TG) do rato é demonstrada. Neurónios motores pode ser identificado com um anticorpo anti-ChAT primária e subsequente marcação fluorescente com um anticorpo secundário Cy3. Além disso, um nuclear contra-mancha com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) foi realizada (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/3936/3936fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Fotomicrografias fluorescentes visualizando a imunodetecção de motoneurónios com anticorpo anti-ChAT (vermelho) e núcleos celulares contra-mancha por DAPI (azul) no corno cabo de rato vertebral lombar anterior de um tipo selvagem (wt) (à esquerda) e do um SOD G93A transgênicos (TG) (à direita) do mouse com a idade de 130 dias. Barra de escala: 40 mM. Como a análise imuno-histoquímica deos ratinhos de SOD G93A não é o âmbito primário deste artigo consultar a publicação original em que estes ratinhos transgénicos foram caracterizados e os mais recentes que estudam abordagens terapêuticas para referência futura 1, 5, 6. Se os efeitos terapêuticos deve ser diferenciado do nível imuno claramente definida algoritmos de avaliação quantitativa deve ser aplicada suportado por um software estereológica (por exemplo ver 7).

<ol><li>Gurney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2C+Zn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Weydt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+disease+onset+and+progression+in+the+SOD1+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS.</a> Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+strategies+for+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping strategies for mutant mice.</a> Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).</li>
<li>Miana-Mena, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+methods+to+characterize+the+G93A+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph.+Lateral+Scler.+Other+Motor+Neuron+Disord%22%5BJournal%5D)">Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS.</a> Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).</li>
<li>Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+therapy+slows+ALS-like+disease+in+mice+by+transcriptionally+inhibiting+SOD1+in+motor+neurons+and+microglia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells.</a> J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).</li>
<li>Pitzer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-colony+stimulating+factor+improves+outcome+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).</li>
<li>Gowing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+proliferating+microglia+does+not+affect+motor+neuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+caused+by+mutant+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase.</a> J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).</li>
<li>Scott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interpretation+of+studies+in+the+standard+murine+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">interpretation of studies in the standard murine model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).</li>
<li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenics%2C+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li>
<li>Corse, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+testing+of+neuroprotective+neurotrophic+factors+in+a+model+of+chronic+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration.</a> Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).</li>
<li>Knippenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+behavioural+tests+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).</li>
<li>Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+disease+models+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular disease models and analysis.</a> Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).</li>
<li>Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-symptomatic+detection+of+chronic+motor+deficits+and+genotype+prediction+in+congenic+B6.SOD1%28G93A%29+ALS+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model.</a> Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).</li>
<li>Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+preclinical+animal+research+in+ALS%2FMND%3A+A+consensus+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting.</a> Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).</li>
<li>Boillee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A SOD1 (G93A) modelo do rato genético é um valioso modelo animal para estudar o curso da doença de perda progressiva dos motoneurônios comparável à esclerose amiotrófica lateral, humano 8. Uma variedade de paradigmas de tratamento diferentes foram avaliados neste modelo e representam uma base para posterior teste em humanos 8-10 estudos clínicos. A fim de ser capaz de detectar diferenças significativas em um estudo de tratamento experimental nestes ratinhos, é de importância primordial para incluir...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Fabricante </td><td> Informações para pedidos </td></tr><tr><td> Testes comportamentais </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rota-Rod para Ratos </td><td> Ugo Basile, Comerio, Itália </td><td> # 47600 </td></tr><tr><td> Pendurado dispositivo fio </td><td> Feito sob encomenda </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Preparação da Medula Espinhal </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tabela Operação A luz de funcionamento Luvas de protecção </td><td></td><td></td></tr><tr><td> &quot;Iris&quot; Tesoura, angulado a lado </td><td> Belas Ferramentas ciência, Heidelberg, Alemanha </td><td> 14063-09 </td></tr><tr><td> Cohan-Vannas Tesoura Primavera, em linha reta </td><td> Belas Ferramentas ciência, Heidelberg, Alemanha </td><td> 15000-10 </td&gt; </tr><tr><td> Micro pinça </td><td> Hammacher, Solingen, Alemanha </td><td> HWC 111-10 </td></tr><tr><td> Bisturi &quot;präzisa plus&quot; </td><td> Dahlhausen, Köln, Alemanha </td><td> 11.000.00.510, a FIG 10 </td></tr></tbody></table>

testes clínicos e remoção da medula espinhal em um modelo do rato para a esclerose lateral amiotrófica (ela)

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

Esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma desordem neurodegenerativa fatal resultando em degeneração progressiva dos motoneurónios. Pico de início é em torno de 60 anos para a doença esporádica e em torno de 50 anos para a doença familiar. Devido ao seu curso progressivo, 50% dos pacientes morrem dentro de 30 meses de início dos sintomas. A fim de avaliar as opções de novo tratamento para esta doença, os modelos murinos genéticos de ALS foram gerados com base em humanos mutações da família no gene SOD, tais como a mutação SOD1 (G93A). Aspectos mais importantes que têm de ser avaliados no modelo são em geral curso de sobrevivência, clínica e da função motora. Aqui, demonstramos a avaliação clínica, mostram a realização de dois testes motores comportamentais e fornecer sistemas de pontuação para todos os parâmetros quantitativos. Porque uma análise em profundidade do modelo de mouse ALS normalmente exige um exame imunohistoquímico da medula espinhal, que demonstram a sua preparação em detalhe a aplicação do fazermétodo laminectomia Rsal. Exemplares achados histológicos são demonstrados. A aplicação integral dos métodos de exame descritas em estudos sobre o modelo do rato de ALS permitirá ao pesquisador confiável testar futuras opções terapêuticas que podem fornecer uma base para mais tarde ensaios clínicos humanos.

Um modelo do rato para a esclerose lateral amiotrófica (ELA) é examinado clinicamente e comportamentalmente. Como um pré-requisito para uma análise imuno acompanha a preparação da medula espinal é descrito em detalhe.

Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é um distúrbio neurodegenerativo fatal que resulta na degeneração progressiva dos motoneurônios. O pico de incidência ocorre por volta dos 60...

Olá, meu nome é Lar Turner. Sou pós-doutoranda no Departamento de Neurologia da Universidade de Ingham, Alemanha. Olá, meu nome é Lin Gunda.Sou estudante de medicina e estou realizando meu trabalho de conclusão de curso neste laboratório. Hoje vamos mostrar a vocês o teste clínico do SODG 93, um modelo murino de esclerose lateral amiotrófica. Além disso, demonstraremos o teste de função motora com um chamado teste de rotor e, adicionalmente, outro teste de função motora com a grelha suspensa para realizar uma análise imunológica.Após a realização dos testes funcionais nos camundongos a s, um procedimento necessário consiste na remoção da medula espinhal, do nervo STIC e do músculo gastrocnêmio. Desejamos mostrar esse procedimento cirúrgico em detalhes e apresentar alguns achados imunológicos exemplares ao final. Ok, mas agora vamos começar primeiramente pelos testes clínicos.Este é um MOE do tipo selvagem de movimento livre que não apresenta quaisquer sintomas clínicos, como tremor muscular ou Parsis, em nosso sistema de classificação clínica. Isso corresponderia à pontuação quatro. Este é um MOE transgênico A LS.Em um estágio inicial da doença, o animal apresenta um tremor severo

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Transplante precursoras neurais é uma estratégia promissora para a proteção e / ou substituição perdido / cervical disfuncional neurônios motores frênicos em lesão medular (SCI) e do neurônio motor doença, a esclerose amiotrófica laterais (ALS). Nós fornecemos um protocolo para entrega celular para chifre da medula espinhal cervical ventral em modelos de roedores da ALS e SCI.

Intra Transplante de Células de Segmentação Chifre Cervical Ventral em Esclerose Lateral Amiotrófica e lesão medular traumática

Fonte:Pourshafie, N., et al. Entrega sistêmica de microRNA usando vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores. J. Vis. Exp. (2018).Neste vídeo, uma atrofia muscular espinhal e bulbar ou camundongo afetado por SBMA é submetido à injeção na veia da cauda de vetores AAV (vetores adeno-associados) recombinantes que carregam um plasmídeo que codifica microRNA terapêutico. O vetor produz microRNA que se liga ao AR mutante (receptor de andrógeno)-mRNA...

Injetando vetores adeno-associados recombinantes em um modelo de camundongo com atrofia muscular espinhal e bulbar

Este protocolo de vídeo descreve um método sensível, confiável e rápido para avaliar os déficits neuromusculares em um modelo de camundongo transgênico de esclerose lateral amiotrófica.

Um sistema de pontuação neurológica rápida fenotípica para a Avaliação de progressão da doença na SOD1 G93A-Rato modelo de ALS

Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.

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Descreve-se aqui uma abordagem de rastreio comportamental escalonada que pode ser utilizada para pesquisar compostos que exibem eficácia in vivo sobre comportamentos motores cognitivos e funcionais em modelos de ratinho transgénicos de β-amiloidose e tauopatia. Esses métodos são otimizados para pesquisar compostos para atividades em tarefas de memória de curto prazo e de trabalho.

Avaliação de Alternância Espontânea, Reconhecimento de Objetos Novos e Clasping de Membros em Modelos de Rato Transgênico de Neuropatologia Amilóide-β e Tau

A medição da condução nervosa é uma ferramenta útil para avaliar modelos de rato de neurodegeneração, mas frequentemente é aplicado apenas para estimular o nervo ciático em membros traseiros. Aqui, descrevemos uma técnica para medir os compostos muscular potencial de ação (CMAP) na vivo dos músculos do membro anterior de rato inervados pelo plexo braquial.

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Este protocolo descreve como criar uma laminectomia precisa para indução de lesão medular do tipo transecção estável no modelo do camundongo, com danos colaterais mínimos para a pesquisa de lesão medular.

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Apresentamos aqui um novo dispositivo de contusão de lesão medular automatizada para camundongos, que pode produzir com precisão modelos de contusão de lesão medular com diferentes graus.

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O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino reprodutível de glioma medular por meio da injeção de células tumorais no espaço intervertebral, oferecendo uma abordagem mais eficaz e menos invasiva para pesquisa e desenvolvimento terapêutico.

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As ataxias spinocerebelares de poliglutamina são causadas por expansões CAG que produzem proteínas propensas à agregação. Este protocolo descreve a produção de vetores, entrega estereotáxica e análise de inclusões e perda de marcadores neuronais, fornecendo uma plataforma controlada para investigar mecanismos e avaliar terapias direcionadas para doenças neurodegenerativas.

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Este artigo detalha métodos de administração intratecal para terapias direcionadas ao SNC em camundongos adultos, focando na precisão do protocolo e na possibilitade de injeções repetidas. Inclui descobertas de um estudo de validação em que oligonucleotídeos antissenso reduziram a expressão mutante de SOD1 em camundongos modelo SOD1-ALS, apoiando a utilidade da abordagem em pesquisas pré-clínicas sobre doenças neurodegenerativas.

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