Name: Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Aprenda a realizar microscopia intravital digital para estudar interações leucócito-endoteliais durante lesão de isquemia-reperfusão no músculo cremaster de ratos. Este protocolo detalhado permite visualização em tempo real da inflamação.

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Este trabalho foi suportado por uma concessão do &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; para SU Eisenhardt (EI 866/1-1).

1. Anestesia e Monitorização <ol><li> Apropriadas ética nacionais e institucionais devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Após a aprovação do Comitê de Ética anestesiam ratos machos Sprague Dawley com peso de 120-180 g. Entregar 2 - 3% vol isoflurano a uma caixa de acrílico através de vaporizador de isoflurano e coloque dentro de rato. </li><li> Logo que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de reacção ao dedo do pé ou pitada cauda) no rato é pesado e raspada na área ventral cervical. </li><li> Colocar o rato em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C e aplicar isoflurano em 2% vol usando uma máscara de silicone. </li></ol> As etapas de preparação que se seguem são melhor realizada usando um microscópio cirúrgico. <ol start="4"><li> Para a preparação da traqueia, a artéria carótida ea veia jugular, executar uma incisão na pele 2 centímetros horizontal na área of fúrcula e mobilizar as glândulas salivares lateralmente. </li><li> Você agora enfrentam os músculos do pescoço ventral. Com cuidado, separe-os na linha média e encontrar a traquéia. Exponha 1 - 2 cm da traquéia e coloca uma pinça micro sob ele, de modo a levantá-lo. </li><li> Agora cortar a meio do lado ventral da traquéia. Tenha cuidado para não cortar todo o caminho, se você fizer isso, o corte final da traquéia vai escorregar de volta para o peito e ser muito difícil de trabalhar. </li><li> Inserir um tubo Abbocath (14G), utilizado como tubo traqueal para a parte inferior da traqueia, a qual tenha sido previamente ligado a um ventilador animal. Dica: fixação firme em grampos magnéticos, bem como a sutura da traquéia ao redor do tubo é essencial para manter o tubo traqueal no local. Geralmente usamos Terylene 5/0 de sutura, o material da sutura no entanto semelhante pode ser usada. </li><li> A respiração pode ser controlada a volume (freqüência, 35 - 45 respirações por minuto, volume corrente, 4,5 - 5 ml; FiO 2 </sub&gt;, 0,35-0,50;. isoflurano 1,5-2% vol) 14 Atelectasia pode ser evitada através da manutenção de um expiratória final positiva pressão de 5 a 10 mm de H2O 15 </li><li> Para a canulação da carótida, o músculo esterno-direito é separado por dissecção romba para localizar a artéria carótida. </li><li> Separe cuidadosamente o nervo vago a partir da artéria carótida e da artéria em montar uma pinça angulada micro para parar o sangue que flui do coração. </li><li> Passar duas peças de comprimento igual de sutura sob a artéria carótida. Em referência ao coração, a sutura mais distai está ligada firmemente para ocluir sangue que flui a partir da região da cabeça enquanto que a sutura proximal está ligado frouxamente em torno da artéria carótida. </li><li> Utilizando uma tesoura micro um pequeno corte é feito na artéria carótida entre as duas ligaduras. </li><li> Inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) cheio com solução salina normal, que está ligado a um transdutor de pressão. </li><li> Remove a pinça micro e fios o cateter ainda mais para dentro da artéria. Em seguida, aperte a ligadura proximal ao redor da artéria e cateter. Dica: A aplicação de uma segunda sutura proximal impede o sangramento após a retirada da pinça micro. </li><li> Amarre a ligadura distal ao redor da carótida eo cateter para ancoragem adicional. </li><li> Monitorar a anestesia continuamente pela taxa de monitorização cardíaca e da pressão arterial. Realizar intermitentes análises de sangue arterial de gás utilizando um analisador de gás do sangue. 16 Uma taxa cardíaca inferior a 300 batimentos por minuto ou superior a 360 batimentos por minuto, bem como uma queda de pressão arterial média inferior a 80 mmHg durante mais de 5 minutos são critérios para exclusão. 17, 18 Manter sangue pH dentro dos limites fisiológicos (7,35 - 7,45). No caso do experimento deve ser finalizado devido a taxas anormais de monitoramento, escarificar o animal por deslocamento cervical ou exanguation. </li></ol> Para a aplicação intravenosa de corantes fluorescentes ou outros fármacos óf interesse, faça o seguinte: <ol start="17"><li> Concentre a área da veia jugular esquerda com o microscópio cirúrgico. </li><li> Com uma pinça em cada mão, rasgar a fáscia fina para revelar a veia jugular. Monte a veia em uma pinça de ângulo micro. O fluxo de sangue, então, parar. </li><li> Usando uma pinça, duas peças de comprimento igual de sutura são passados ​​sob a veia jugular concordante com a canulação da carótida. Amarre a sutura distal bem como a sutura proximal frouxamente em torno da veia jugular. </li><li> Fazer um pequeno corte na veia jugular e inserir um cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) que foi lavada com solução salina. Marcar que incisão e canulação pode ser mais exigente e demorado do que a da carótida. </li><li> Passe o cateter para o coração e apertar a ligadura mais próximo do coração em torno da veia e do cateter. </li><li> Depois de permeabilidade conforme, amarre ligadura distal ao redor do cateter. Dica: fixação adicional de boª cateteres com fita pode impedir o deslocamento. </li><li> Lavar cateteres com freqüência para evitar a coagulação intraluminal. </li></ol> 2. Preparação do músculo cremaster <ol><li> Nós usamos um estágio de alumínio de 1,5 - 2 cm de espessura para imagens cremastérico. A fase rapidamente adopta a temperatura desejada da almofada de aquecimento assim aliviando controlo térmico do tecido cremastérico. Isso é fundamental para estudos de inflamação. Alternativamente, uma plataforma de Plexiglas podem ser utilizados embora a regulação da temperatura cremastérico é mais difícil. Coloque o escroto no centro da fase. </li><li> A incisão inicial é feita na pele e fáscia espermática externa acima do escroto no final distal seguido de dilatação cuidado com o espaço subcutâneo com uma tesoura fina. Evite tocar o tecido subjacente com os instrumentos. </li><li> Logo que o tecido é exposto é humedecido com pré-aquecido (37 ° C) solução salina tamponada com fosfato wicálcio e magnésio th. Aplicar a solução regularmente para qualquer tecido exposto. </li><li> O tecido conjuntivo entre a fáscia espermática externa eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante. </li><li> A superfície exterior do músculo cremaster é, então, cautelosamente limpo de tecido conectivo. Superfusão contínua durante hidratos de dissecação do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção. </li><li> Suturar a extremidade distai do saco cremaster para segurar para baixo e ligeiramente estender a extremidade do saco. </li><li> Faça uma incisão na extremidade distal do saco na face ventral e alongar a incisão proximalmente com uma tesoura micro. Cuidadosamente cauterizar vasos sangrantes ao longo das linhas de incisão utilizando um termo-cautério. Evite a cauterização desnecessária para limitar adicionais estímulos inflamatórios. Dica:. Dinâmica do fluxo sanguíneo perto da periferia da preparação são alterados por este dano tecidual 19 Portanto, para minimizar oSE afecta a recolha de dados, os vasos sanguíneos, perto do centro da preparação deve ser usado para geração de imagens. </li><li> O cremaster aberto fica encostado ao pedestal de alumínio embora ainda ligados por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, incluindo uma pequena artéria e veia que liga ao epidídimo. Use o cautério para selar os vasos e empregar as tesouras micro para cortar o ligamento conectivo entre testículo e tecido cremastérico. </li><li> Com cuidado, empurre de volta ao testículo isolado dentro do canal inguinal. Outros autores ressecção do testículo após a ligadura proximal (orquiectomia), juntamente com a almofada de moda associada inguinal 20. Em um modelo sensível como IRI ativação induzida leucócitos tentamos evitar todos os estímulos adicionais cirúrgicos, portanto, abster-se de ressecção do testículo, que normalmente não é necessária para obter uma exposição suficiente do músculo cremaster. </li><li> Além da primeirasutura de fixação quatro arestas de tecido (duas de cada lado) e unem os segmentos para fitas a cautelosamente espalhar o tecido cremastérico radialmente sobre a fase de alumínio. Deixando uma lacuna entre o estágio de alumínio e entrada externa do canal inguinal simplifica recorte cremastérico subseqüente para isquemia. </li><li> Coloque duas extremidades do cateter de polietileno (0,28 mm de diâmetro interno) próximo ao tecido cremastérico para a configuração superfusão. Assegure-se que o lúmen é livre de ar para evitar bolhas de ar na câmara de fluido eventual. </li><li> Desenhar uma linha de vaselina (vaselina) em torno do músculo cremaster usando uma seringa. A linha deve estender-se o tamanho da lâmina de cobertura que é usado para a cobertura. </li><li> Para criar uma câmara de fluido, colocar uma lamela quadrado (32 × 32 mm) sobre o tecido cremastérico e firmemente ligar as pontas para a linha de vaselina. </li><li> No caso de o tecido não está cremastérico superfused com uma droga específica, a substituição contínua da gripe circundanteID não é essencial. Uma única aplicação de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio para dentro da câmara criada pode então ser suficiente. Estimulação local com drogas no entanto deve ser realizada de forma contínua através de micro-perfusão bomba a uma taxa de 3 ml por hora. </li><li> O tecido cremastérico está agora pronto para a imagem latente microscópica. </li></ol> 3. Configuração intravital A configuração básica intravital pode variar. Para imagens de epifluorescência, os experimentos devem ser executados em um quarto escuro. <ol><li> O animal é transferida para o estágio de um microscópio de epifluorescência intravital equipado com um LED 470 nm fonte luminosa para epi-iluminação. Usar uma objectiva de imersão em água (20 × / 1,0) para atingir a ampliação de cerca de 800 ×. Registre as observações por meio de uma câmera de alta resolução digital e armazenar registros em um computador pessoal para avaliação off-line. </li><li> Para a rotulagem de leucócitos, injetar rodamina6G por via intravenosa através do cateter jugular em concentrações de 0,4 peso corporal mg / kg. </li><li> Escolha uma vênula postcapillary para observação. Tamanho do vaso deve variar entre 20-60 mM e fluxo de sangue deve ser suficiente. Para minimizar a influência da pré-activação do tecido, apenas os vasos em que rolamento de leucócitos é inferior a 20 cells/30 segundo e do número de células aderentes &lt;10 cells/200μm de endotélio venular podem ser utilizados para análise posterior. </li><li> Se possível, até três vénulas pós-capilares podem ser utilizados para observação, contudo eles devem estar localizado numa secção correspondente do tecido cremastérico para evitar confusão dos vasos em pontos de tempo diferentes. </li></ol> 4. Isquemia-reperfusão (IIR) <ol><li> Deixe tecido estabilizar durante 30 minutos. </li><li> Realizar uma gravação de 30 segundos para estabelecer os valores basais de rolamento de leucócitos e aderência. Idealmente, gerar um total de três gravações basais para verificar celularnúmeros e para obter desvios-padrão. </li><li> Suavemente colocar um clipe vaso Biemer em torno da extremidade proximal muito do tecido exposta cremastérico usando os fórceps de aplicação. Estase deve ocorrer imediatamente e pode ser visualizada por microscopia de epifluorescência na secção do vaso observada. </li><li> Uma variedade de cursos de tempo podem ser utilizados dependendo do nível de prejuízo requeridos. Nós aplicamos 30 minutos de tempo de isquemia, como descrito por outros autores. 21-23 Retire o grampo navio depois. Permitir fluxo de sangue para estabilizar durante mais 15 minutos. </li><li> Gravações subsequentes de 30 segundos de duração pode ser feita ao longo do período de reperfusão (por exemplo, 30 segundos cada 15 minutos). Guarde as gravações digitalmente para análise offline. </li><li> Para o fim da experiência, o rato é sacrificado por deslocamento cervical, sob anestesia suficiente premindo um instrumento rombo, tais como a borda monótona de uma lâmina de tesoura na base do crânio. Com a outramão, a base da cauda é rapidamente puxado, causando a separação das vértebras cervicais a partir do crânio. </li></ol> 5. Análise reprodução offline Vídeo <ol><li> Para análise offline reprodução de vídeo é útil para usar o software que permite a seleção de imagens distintas e observação da seqüência de vídeo em câmera lenta. Ajuste o contraste eo brilho de forma adequada. Usamos software fornecido pelo fabricante do microscópio que permite medições de comprimento e de ampliação digital. </li><li> Para a quantificação do rolamento de leucócitos, definem uma linha virtual que intersecta o vaso verticalmente que é consistente em todos os registos. Contar o número de leucócitos de rolamento que passam a linha dentro de 30 segundos manualmente. </li><li> Para a quantificação dos leucócitos aderentes, definem uma secção do vaso 200 iM que é consistente em todos os registos 23 Contar o número de leucócitos claramente visíveis que permanecem estática durante 30 segundos -. Assim definidoresed como aderentes 24. </li></ol> 6. Os resultados representativos IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), a frequência cardíaca eo pH do sangue Utilizando a configuração acima mencionada (Figura 1), foi investigada a microcirculação em IRI ao longo de um protocolo de duas horas, no entanto um tempo de observação muito mais tempo até 6 horas é possível. Como mostrado na Figura 2, o IRI do músculo cremaster não tem efeitos significativos sobre a circulação macrohemodynamic rato como a pressão arterial média e da frequência cardíaca permanecer estável durante todo o período de investigação. Além disso, monitoramos homeostase por meio de medições freqüentes do pH do sangue arterial, que variaram dentro dos limites fisiológicos e não mostrou significativas entre grupos de diferenças. IRI induz rolamento de leucócitos na circulação cremastérico Interação endotelial de leucócitos é uma chaveevento na inflamação aguda. Por meio de microscopia intravital foi observado um aumento dependente do tempo no número de leucócitos de rolamento em IRI do músculo cremaster (Figura 3A) concordantes com os dados anteriores 21, 25. Rolamento montado sobre o tempo de observação de duas horas para um máximo de 137,63 ± 22,55% do valor de linha de base após 120 minutos de tempo de reperfusão e, em seguida, atingiram significância estatística em comparação com animais operação simulada (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% do valor de linha de base). IRI induz a adesão de leucócitos na circulação cremastérico Para a avaliação adicional de leucócito-endotelial interacção analisamos a adesão de leucócitos em uma secção do vaso 200 uM. IRI induziu um aumento no número de leucócitos aderentes que excedeu significativamente os valores de operação simulada animais após 60 minutos (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% do valor de linha de base) e ainda mais ASCEnded por 120 minutos de reperfusão (Figura 3B). Em resumo, o descrito no modelo in vivo fornece dados consistentes de ativação leucocitária aguda em IRI sobrevivência animal, enquanto a circulação ea estabilidade é garantida. <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. A. Fluxograma para o desempenho de microscopia de epifluorescência intravital na isquemia-reperfusão do músculo cremaster de rato. Após os preparativos necessários para anestesia e monitoramento, o músculo cremaster de rato é exposto para a imagem latente. Registros de ativação leucocitária são tomadas antes e depois da isquemia tecidual. Análise de vídeo subsequente é melhor executada offline. B. Figura esquemática da configuração proposta intravital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within página = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. IRI do músculo cremaster não tem nenhum efeito sobre a pressão arterial média (MAP), ritmo cardíaco e pH do sangue. A pressão arterial média (A) e da frequência cardíaca (B) foram monitorizados a cada 30 minutos durante toda a experiência através de transdutor de pressão após canulação da direita da artéria carótida. A medição do pH do sangue arterial-(C) foi realizada após 0, 60 e 120 minutos. Valores são média ± EPM de 6 animais diferentes, variando em níveis fisiológicos, sem diferenças significativas inter-grupos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3973/3973fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. IRI aumenta leucócitos-Endotelial interacção na circulação cremastérico. Após marcação de leucócitos com rodamina 6G (0,4 peso corporal mg / kg) microscopia de epifluorescência intravital foi utilizado para determinar leucócito-endotelial de interacção em lesão de reperfusão através de um protocolo minutos 120 após 30 minutos de isquemia de tecido. Registos foram tomadas a ampliação de cerca de 800 ×. A. IRI aumenta significativamente o número de leucócitos de rolamento em vénulas pós-capilares do músculo cremaster por 120 minutos de reperfusão Considerando rolamento de leucócitos permanece estável ao longo da experiência no tecido cremastérico que não foi submetido a isquemia. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P &lt;0,05 utilizando o teste t não emparelhado. B. O número de leucócitos aderentes é significativamente aumentada em uma secção do vaso escolhido aleatoriamente 200μm postcapillary após 30 minutos de isquemia cremastérico e subsequentes 60 minutos de reperfusão do tecido. Resultados ficar ainda more pronunciado após um período de reperfusão de duas horas. Os valores são média ± SEM de 6 ratos observados. # P &lt;0,05 utilizando o teste t não pareado. Imagens representativas C. de uma vênula postcapillary antes da isquemia (esquerda) e 120 minutos após o IRI (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3973/3973fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
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<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Leucócito-endotelial interacção, a produção de espécies reactivas de oxigénio e de activação do sistema do complemento são as principais características de IRI induzida por disfunção do tecido. 26 microcirculação A do tecido afectado é considerado como o local integral para o início inflamatória. Para além de experimentações ex vivo, tais como ensaios de câmara de fluxo 27, 28, é obrigatória a existência de modelos bem-estabelecidos de imagem intravital para avaliar melhor a relevância <em...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento: </td><td> Empresa: </td><td> N º de Catálogo: </td><td> Comentários: </td></tr><tr><td> Forene 100% (V / V) </td><td> Abade </td><td> B506 </td><td> API isoflurano </td></tr><tr><td> Terylene Sutura </td><td> Serag Weissner </td><td> OC108000 </td><td></td></tr><tr><td> Portex fina Diâmetro Tubos de polietileno </td><td> Smiths Medical </td><td> 800/100/100 </td><td> 0,28 mm de diâmetro interno </td></tr><tr><td> 0,9% de solução salina </td><td> Fresinus Kabi </td><td> 808771 </td><td></td></tr><tr><td> Mudanças-A ponta de luxo kit cauterização </td><td> Bovie Medical </td><td> DEL1 </td><td></td></tr><tr><td> Abbocath-T 14G </td><td> Venisystems </td><td> G713- A01 </td><td> utilizado como tubo de lente </td></tr><tr><td> Ventilador Servo 900C </td><td> Maquet </td><td></td><td> utilizado como ventialtor animais </td></tr><tr><td> Transdutor de pressão lógico </td><td> Smiths Medical </td><td> MX1960 </td><td></td></tr><tr><td> Sirecust 404 monitor </td><td> Siemens </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ABL 700 bancada Analyzer </td><td> Radiômetro </td><td></td><td> para medição de gás de sangue </td></tr><tr><td> Almofada de aquecimento </td><td> Effenberger </td><td> 8319 </td><td></td></tr><tr><td> Estágio de alumínio </td><td> Alfun </td><td> AW7022 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio cirúrgico OPMI 6-SDFC </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microcirúrgica instrumentos de laboratório set </td><td> S &amp; T </td><td> 767 </td><td></td></tr><tr><td> Biemer clipe de navio </td><td> Diener </td><td> 64,562 </td><td></td></tr><tr><td> Aplicando fórceps </td><td> Diener </td><td> 64,568 </td><td> para Biemer clipe de navio </td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4127 </td><td></td></tr><tr><td> Vaseline branco DAB </td><td> Winthrop </td><td> 2726853 </td><td></td></tr><tr><td> Cubra óculos </td><td></td><td></td><td> 32x32 milímetros </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Configuração intravital </td></tr><tr><td> Zeis Axio Scope A-1 MAT </td><td> Carl Zeis </td><td> 490036 </td><td> microscópio de epifluorescência </td></tr><tr><td> 470 nm LED </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td> fonte de luz de fluorescência </td></tr><tr><td> Colibri Sistema 2 </td><td> Carl Zeis </td><td> 423052 </td><td></td></tr><tr><td> W Plano Apochromat-20x / 1,0 DIC </td><td> Carl Zeis </td><td> 421452 </td><td> objetiva de imersão de água </td></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 FireWire </td><td> Carl Zeis </td><td> 426509 </td><td> de alta resolução da câmera digital </td></tr><tr><td> Axio LE visão software </td><td> Carl Zeis </td><td> 410130 </td><td> utilizar para análise offline </td></tr></tbody></table>

real-time digital imaging de leucócito-endotélio interação em isquemia-reperfusão (iri) do músculo cremaster de rato

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicado em uma grande variedade de condições patológicas tais como acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, isquemia intestinal, assim como após o transplante, e cirurgia cardiovascular. 1 reperfusão do tecido isquémico anteriormente, enquanto essencial para a prevenção de irreversível lesão tecidual, elicia inflamação excessiva do tecido afectado. Adjacente à produção de espécies reactivas de oxigénio, activação do sistema do complemento e aumento da permeabilidade microvascular, a activação de leucócitos é um dos agentes princípio na cascata patológico do dano tecidual inflamatória durante a reperfusão. 2, 3 activação dos leucócitos é um processo em várias etapas consistindo de laminagem, adesão firme e transmigração e é mediada por uma interacção complexa entre moléculas de adesão, em resposta a chemoattractants tais como factores do complemento, quimiocinas, ou factor de activação de plaquetas. 4 &lt;p = classe &quot;jove_content&quot;&gt; Enquanto circulante de leucócitos em vénulas pós-capilares é predominantemente mediado pela interacção das selectinas 5 com os seus ligandos de balcão, adesão firme dos leucócitos ao endotélio é-selectina controlada através da ligação a moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular As moléculas de adesão (VCAM). 6, 7 Padrão-ouro para a observação em vivo de leucócito-endotelial interação é a técnica de microscopia intravital, descrita pela primeira vez em 1968 8. Embora vários modelos de IRI (isquemia-reperfusão) têm sido descritos para vários órgãos, 9-12 apenas poucos são adequados para a visualização directa do recrutamento de leucócitos no leito microvascular em um elevado nível de qualidade de imagem. 8 Nós aqui promover a microscopia de epifluorescência intravital digitais da vênula postcapillary na microcirculação cremastéricodo rato 13 como um método conveniente para qualitativamente e quantitativamente analisar o recrutamento de leucócitos para a pesquisa IRI-no tecido do músculo estriado e fornecer um manual detalhado para a realização da técnica. Nós ilustrar ainda mais as armadilhas comuns e fornecer dicas úteis que deverão permitir ao leitor a apreciar verdadeiramente, e executar com segurança o método. Em um passo a passo protocolo que descrevem como começar com anestesia respiração controlada sob monitorização suficiente para manter o animal anestesiado com firmeza por longos períodos de tempo. Em seguida, descrevem a preparação cremastérico como uma folha fina e plana para a resolução óptica surpreendente e fornecer um protocolo para imagiologia de leucócitos no IRI que tem sido bem estabelecidas nos nossos laboratórios.

Microscopia de epifluorescência intravital Digital de vênulas na microcirculação cremastérico é um método conveniente para obter insights sobre leucócito-endotelial interação<em&gt; In vivo</em&gt; Na isquemia-reperfusão (IRI) do tecido muscular estriado. Nós aqui fornecer um protocolo detalhado para executar com segurança a técnica e discutir suas aplicações e limitações.

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) tem sido implicada em uma ampla gama de condições patológicas, tais como acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, ...

A microscopia intravital da microcirculação do músculo CRE é um método conveniente para obter informações sobre isquemia e lesão por reperfusão do tecido muscular estriado. Em um protocolo passo a passo, descrevemos como iniciar uma anestesia controlada por respiração com monitoramento adequado por meio de canulação arterial para manter o animal firmemente anestesiado por períodos prolongados. Ilustramos como realizar a canulação da veia jugular e, em seguida, descrevemos o preparo do músculo CRE como uma lâmina fina e plana, proporcionando excelente resolução óptica.Apresentamos um protocolo para imagem de leucócitos em lesão por isquemia e reperfusão que foi bem estabelecido em nossos laboratórios. Este modelo pode ser utilizado para analisar a ativação de leucócitos em isquemia. Pesquisa sobre lesão por reperfusão.A lesão por fusão isquêmica tem sido implicada em uma ampla gama de condições patológicas, como infarto do miocárdio, isquemia intestinal, bem como após transplante e cirurgia cardiovascular. A hiperperfusão de tecido previamente isquêmico, embora essencial para a prevenção de lesão tecidual irreversível, provoca inflamação excessiva no tecido afetado, associada à prod

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este estudo demonstra a preparação cirúrgica do músculo cremaster de rato para a visualização da camada livre de células in vivo. Fatores consideráveis que afetam a precisão da medição da largura da camada livre de células são discutidos neste estudo.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Aqui, mostramos como realizar microscopia intravital em venulos pós-capilar esfarelados do músculo cremaster do rato. Comumente aplicada a diferentes modelos de inflamação e sepse, particularmente aqueles induzidos por quimiocinas e citocinas, destacamos sua relevância no estudo de muscolopatias envolvendo infiltração exagerada de leucócitos musculares.

Infiltração de leucócitos do Músculo Cremaster em Camundongos Avaliados por Microscopia Intravital

A lesão por isquemia renal está associada à alta morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. Aqui, apresentamos um modelo de camundongo simples e eficaz de lesão unilateral de isquemia renal-reperfusão e fornecemos uma visão geral sequencial das alterações patológicas representativas observadas no rim.

Um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Um sistema de imagem de contraste a laser foi utilizado para monitorar as mudanças no fluxo sanguíneo microvascular renal durante a isquemia-reperfusão unilateral renal após a resseção do rim direito em camundongos.

Perfusão Microvascular Monitorada por Imagem de Contraste Speckle-Laser durante Lesão por Isquemia-Reperfusão Renal em Camundongos

Aprenda a realizar microscopia intravital digital para estudar interações leucócito-endoteliais durante lesão de isquemia-reperfusão no músculo cremaster de ratos. Este protocolo detalhado permite visualização em tempo real da inflamação.

Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

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