Real-time Digital Imaging de leucócito-endotélio Interação em isquemia-reperfusão (IRI) do músculo cremaster de rato

A microscopia intravital da microcirculação do músculo CRE é um método conveniente para obter informações sobre isquemia e lesão por reperfusão do tecido muscular estriado. Em um protocolo passo a passo, descrevemos como iniciar uma anestesia controlada por respiração com monitoramento adequado por meio de canulação arterial para manter o animal firmemente anestesiado por períodos prolongados. Ilustramos como realizar a canulação da veia jugular e, em seguida, descrevemos o preparo do músculo CRE como uma lâmina fina e plana, proporcionando excelente resolução óptica.

Apresentamos um protocolo para imagem de leucócitos em lesão por isquemia e reperfusão que foi bem estabelecido em nossos laboratórios. Este modelo pode ser utilizado para analisar a ativação de leucócitos em isquemia. Pesquisa sobre lesão por reperfusão.

A lesão por fusão isquêmica tem sido implicada em uma ampla gama de condições patológicas, como infarto do miocárdio, isquemia intestinal, bem como após transplante e cirurgia cardiovascular. A hiperperfusão de tecido previamente isquêmico, embora essencial para a prevenção de lesão tecidual irreversível, provoca inflamação excessiva no tecido afetado, associada à produção de espécies reativas de oxigênio, à ativação do sistema complemento e ao aumento da permeabilidade microvascular. A ativação de leucócitos é uma dos principais fatores na cascata patológica de dano tecidual inflamatório durante a reperfusão.

Aqui promovemos a microscopia intravital do leito capilar pós-capilar como um método conveniente para analisar a ativação de leucócitos na lesão por isquemia e reperfusão. Além disso, ilustramos armadilhas comuns e fornecemos dicas úteis que devem permitir ao leitor compreender plenamente e realizar com segurança o método. Após aprovação do comitê de ética e anestesiar ratos machos com peso corporal entre 120 e 180 gramas, coloque o rato dentro da caixa de plexiglass e administre dois a três por cento em volume de isoflurano por meio de vaporizador de isoflurano.

Assim que o nível apropriado de anestesia for alcançado, o rato é pesado e depilado na região cervical ventral. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma placa aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius e aplique isoflurano a dois por cento em volume utilizando uma máscara de silicone. Os seguintes procedimentos são melhor realizados com o auxílio de um microscópio cirúrgico.

Realize uma incisão cutânea horizontal de dois centímetros na região da escotadura esternal. Mobilize as glândulas salivares lateralmente. Agora você está diante dos músculos anteriores do pescoço.

Sequencie-os cuidadosamente na linha média e localize a traqueia. Exponha um a dois centímetros da traqueia e posicione uma pinça microcirúrgica por baixo para elevá-la. Agora, insira cerca de metade do caminho através do lado ventral da traqueia um tubo de calibre 14 como cânula traqueal na parte inferior da traqueia, que previamente foi conectada a um ventilador para animais.

A respiração pode então ser controlada por volume com uma frequência de 35 a 45 respirações por minuto. Um volume corrente de 4,5 a cinco M e uma concentração de fluoreto ISO de 1,5 a dois por cento em volume para a cânula da carótida. O músculo hióide esternal direito é separado por dissecação romba.

Para localizar uma artéria carótida, separe cuidadosamente o nervo vago da artéria carótida e posicione a artéria sobre pinças microcirúrgicas Anki para impedir que o sangue flua do coração além de dois pontos de sutura sob a artéria carótida em relação ao coração; o ponto mais distal é amarrado firmemente, enquanto o ponto proximal é amarrado frouxamente ao redor da artéria carótida. A aplicação de um segundo ponto proximal evita sangramento após a remoção das pinças microcirúrgicas, utilizando tesouras microcirúrgicas para fazer um pequeno corte na artéria carótida entre as duas ligaduras. Insira um cateter de polietileno preenchido com solução salina normal que está conectado a um transdutor de pressão.

Remova a pinça microcirúrgica e avance o cateter mais profundamente na artéria. Realize análise intermitente de gasometria sanguínea arterial utilizando um analisador de gases sanguíneos e mantenha o pH sanguíneo dentro dos limites fisiológicos para a aplicação intravenosa de corantes fluorescentes ou outras substâncias de interesse. Foque na região da veia jugular esquerda com o microscópio cirúrgico, segurando uma pinça em cada mão, e rompa a fina fáscia para expor a veia jugular.

Posicione a veia sobre uma pinça microcirúrgica inclinada para interromper o fluxo sanguíneo. Com o auxílio da pinça, passe duas tiras de sutura de mesmo comprimento sob a veia jugular de maneira idêntica à realizada na canulação da carótida, faça um pequeno corte na veia jugular e insira um cateter de polietileno previamente lavado com solução da linhagem celular. Introduza o cateter em direção ao coração e aperte o ligadura mais próximo ao coração.

Ao redor da veia e do cateter, utilizamos uma imagem cremastérica estágio quatro de alumínio que rapidamente adota a temperatura desejada da placa de aquecimento. O corte inicial é feito na pele e no fáscio espermático externo acima do escroto, na extremidade mais distante, seguido por uma dilatação cuidadosa do espaço subdérmico com tesoura fina. Assim que o tecido é exposto, ele é umedecido com uma solução salina pré-aquecida.

O tecido conjuntivo entre a fáscia espermática externa e o músculo CRE master é cuidadosamente removido para liberar os músculos do trimestre dos tecidos circundantes. A superfusão contínua durante a dissecação hidrata o tecido, o que facilita a visibilidade e a remoção, como a extremidade distal do CRE master S, para segurar e levemente estender a extremidade do S no interior da extremidade distal do saco na face ventral e alongar a incisão proximalmente. Usando tesoura microcirúrgica, identifique cuidadosamente os vasos sangrantes ao longo das linhas de incisão.

Utilizando um termocauterizador, o músculo cremaster aberto fica plano sobre a dose do pedestal de alumínio, ainda conectado por delgados ligamentos aos EPIs sob o testículo, incluindo uma pequena artéria e veia. Use o termocauterizador para selar os vasos e cortar os ligamentos conjuntivos entre o tecido escrotal e o tecido cremasteriano. Empurre suavemente o testículo isolado de volta para o canal inguinal.

Além da primeira fixação, que são quatro pontos do tecido, e com cuidado prenda as bordas da fita, espalhando radialmente o tecido cremastérico sobre a platina de alumínio. Posicione as duas extremidades de um cateter de polietileno próximas ao tecido cremaster para a montagem da superfusão. Desenhe uma linha de gel de petróleo ao redor do músculo cremaster usando uma seringa para criar uma câmara líquida.

Coloque uma lamínula quadrada sobre o tecido cri-cóide e fixe firmemente as bordas à linha de vaselina. O tecido cremastérico está agora pronto para a imagem microscópica. A configuração básica in vivo pode variar.

Utilizamos um microscópio intravital de epifluorescência equipado com uma fonte luminosa de LED de 470 nanômetros para a laminação EP. Com um objetivo de imersão em água, alcançamos uma ampliação de aproximadamente 800 x e registramos a observação por meio de uma câmera digital de alta resolução. Para a imagem de epifluorescência, o experimento deve ser realizado em um ambiente escuro.

Para a marcação de leucócitos, injete rumina seis J por via intravenosa através do cateter jugular na concentração de 0,4 miligrama por quilograma de peso corporal. Escolha um vaso pós-capilar para observação. O diâmetro do vaso deve variar entre 20 e 60 micrômetros e o fluxo sanguíneo deve ser suficiente.

Antes de ocorrer a isquemia, deixe o tecido se estabilizar por 30 minutos. Em seguida, realize um registro de 30 segundos para estabelecer os valores basais de rolamento e aderência de leucócitos. Coloque suavemente um clipe vascular bemer ao redor da extremidade mais proximal do tecido cremastérico exposto, utilizando pinças de aplicação.

Remova o grampeamento do vaso após 30 minutos de isquemia. As gravações subsequentes podem ser realizadas durante todo o período de reperfusão. Para a quantificação do rolamento de leucócitos, defina uma linha virtual que intersecte o vaso verticalmente, sendo essa linha consistente em todos os registros.

Conte manualmente o número de leucócitos rolantes que atravessam a linha dentro de 30 segundos. Para a quantificação de leucócitos aderentes, defina uma seção vascular de 200 micrômetros que seja consistente em todos os registros.

Conte o número de leucócitos claramente visíveis que permanecem estáticos durante 30 segundos. Resultados representativos são fornecidos no protocolo escrito. Embora a lesão por isquemia e reperfusão tenha sido implicada em vários sistemas orgânicos, aqui descrevemos um método para analisar a interação entre leucócitos e endotélio na lesão por reperfusão do tecido muscular estriado.

Assim, particularmente relevante para cirurgias com retalho, já que se presume que a lesão tecidual pós-isquêmica de outros órgãos envolva os mesmos mecanismos inflamatórios. O método descrito pode ser utilizado para obter insights fundamentais sobre os mecanismos patológicos na lesão por isquemia e reperfusão. A aplicação de isquemia no músculo cremasteriano pode ser facilmente realizada e reflete perfeitamente condições clinicamente relevantes, como a cirurgia de retalho livre.

Além disso, modificações como isquemia fria ou isquemia tépida ou a superfusão crônica com substâncias que influenciam a inflamação podem ser facilmente aplicadas. A injeção intraoral pode ser o método de escolha quando o tratamento for necessário, horas ou dias antes da gravação.