Name: Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprenda a localizar proteínas em micrografias eletrônicas usando microscopia de fluorescência correlacionada. Este método nano-FEM utiliza nematódeos transgênicos expressando histonas marcadas com proteínas fluorescentes para visualização precisa.

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Agradecemos Harald Hess e Eric Betzig para o acesso ao microscópio PALM para a prova de princípio experimentos, Richard Fetter para a partilha de protocolos de fixação, reagentes e encorajamento. Agradecemos Michael Davidson, Geraldine Seydoux, Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema e Marc Hammarlund para construções de DNA. Agradecemos também a Carl Zeiss Inc. para fornecer acesso à Zeiss PAL-M, uma versão beta do P.1 Elyra microscópio Zeiss PALM.

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<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
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Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Carl Zeiss, Inc.

Aqui descrevemos como preservar proteínas fluorescentes em plástico, localizar as proteínas fluorescentes nas seções, ea imagem do ultra-estrutura por microscopia eletrônica. Proteínas foram localizadas abaixo do limite de difração usando microscopia PALM para resolução de nanômetros. Para adaptar este protocolo para espécimes específicos, os seguintes parâmetros devem ser considerados: fluoróforo, quantificação e alinhamento. A escolha de uma proteína fluorescente ou fluoróforo orgânico depende da aplicação e o sistema de modelo. Temos testado numa variedade de proteínas fluorescentes, incluindo GFP, YFP, citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry e Dendra 12. A preservação da fluorescência de cada fluoróforo foram semelhantes, sugerindo que todas as proteínas fluorescentes podem ser preservados utilizando o método descrito. Escolhemos tdEos porque expressa bem em C. elegans, as proteínas se funcional, quando fundido a tdEos, e porque a suafoto-ativação características foram ideal para microscopia PALM. No entanto, a agregação ou não expressão de tdEos foi ocasionalmente observado 12. Dependendo da aplicação, um fluoróforo diferente, pode ser mais adequado. Em muitos casos, não é necessária a utilização de uma proteína de foto-activado fluorescente. Simples correlativo microscopia electrónica de fluorescência não requer foto-activado de proteína fluorescente. GFP ou corantes orgânicos podem ser utilizados para imagem de fluorescência de proteínas marcadas em secções acima do limite de difracção. Por exemplo, pode-se axon uma imagem num neuropil usando microscopia de fluorescência e correlacionar o sinal de fluorescência com um axónio particular em uma micrografia electrónica por imagiologia de fluorescência num microscópio de fluorescência. Outras técnicas de super-resolução, tais como microscopia de emissão estimulada esgotamento (STED) 12, chão de microscopia de depleção estado seguido de retorno molécula individual (GSDIM) 13, emicroscopia de iluminação estruturada (SIM) 14, não precisam de foto-activados proteínas fluorescentes. Além disso, as técnicas de super-resolução de imagem que utilizam corantes orgânicos 9,15,16 ou a propriedade intrínseca de sondas fluorescentes 17 são facilmente aplicáveis. Em PALM, o número de moléculas pode ser quantificada por fluorescência de cada molécula está separado espacialmente e temporalmente. No entanto, a quantificação pode ser enganosa por quatro motivos: oxidação, subestimação, overcounting e superexpressão. Em primeiro lugar, uma fracção das proteínas fluorescentes pode ser desnaturado ou oxidados durante o processamento da amostra 5,12. Embora ~ 90% do sinal de fluorescência foi preservada por meio da fixação e incorporação no nosso protocolo, a oxidação da proteína fluorescente pode ocorrer depois de o espécime foi seccionado e a superfície exposta ao oxigénio. Em segundo lugar, a activação do foto-activáveis ​​proteínas é estocástico, e, assim, as moléculas podem ser múltiplasativado em um ponto de difração dada limitada 8. Fluorescência das moléculas múltiplas mesma aparece como uma mancha, e, assim, o número total de proteínas será contado regressivamente. Em terceiro lugar, um problema semelhante pode levar a overcounting. Na palma, cada proteína fluorescente é localizado e então &quot;apagados&quot; pelo branqueamento. No entanto, as proteínas fluorescentes pode retornar do estado escuro sem estar permanentemente branqueada 18. Tais moléculas, então, ser contado várias vezes. Em quarto lugar, as proteínas marcadas são expressos como transgenes e são muitas vezes presentes em múltiplas cópias, o que pode conduzir a sobre-expressão. Assim, a quantificação de palma podem ser usados ​​para estimar com precisão, mas não determinar o número de moléculas de uma dada localização. O alinhamento de uma imagem PALM com uma micrografia de electrões pode também ser um desafio devido à diferença de resolução de microscopia óptica e electrónica e distorção provocada pelo feixe de electrões. Partículas de ouro servir bem locdesmineralizada marcadores fiduciais em microscopia eletrônica. No entanto, fluoresecence de partículas de ouro não é foto-ativado, e aparece como uma mancha de difração limitada de grande porte. Assim, a colocação de uma imagem de fluorescência ao longo de uma fotografia de microscopia electrónica é uma estimativa. Distorções também pode surgir a partir de interações dos elétrons com a secção de plástico. Resinas acrílicas tais como GMA são menos estáveis ​​sob o feixe de electrões, e as dimensões do que o plástico pode ser alterada. Sob estas circunstâncias, o alinhamento da fluorescência com ultraestrutura pode requerer a transformação não linear dos marcadores fiduciais.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Alta pressão congelador </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact e HPM 100 da Leica ou hpf-01 a partir de Wohlwend também podem ser usados. </td></tr><tr><td> Unidade de substituição automática congelamento </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 também pode ser usado. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon e Vutara também vender microscópios PALM comerciais. </td></tr><tr><td> Microscópio eletrônico de varredura </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Outros microscópios de alta resolução de SEM pode ser usado. </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Ósmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> O permanganato de potássio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma-aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de acetato de uranilo a partir desta empresa é ligeiramente maior. </td></tr><tr><td> Metacrilato de glicol (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Ácido baixo, grau TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo frascos </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de vidro </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Filme Aclar </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM cápsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropileno </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISCO socos </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> As nanopartículas de ouro </td><td> microesferas-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Pedir solução concentrada 2x </td></tr></tbody></table>

nano-fem: localização de proteínas usando a foto-ativada microscopia localização e microscopia eletrônica

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapear a distribuição de proteínas é essencial para a compreensão da função de proteínas numa célula. A microscopia de fluorescência é usado extensivamente para localização de proteínas, mas contexto subcelular é frequentemente ausente em imagens de fluorescência. Imuno-microscopia electrónica, por outro lado, pode localizar as proteínas, mas a técnica é limitada pela falta de anticorpos compatíveis, a preservação da morfologia pobre e porque a maioria dos antigénios não estão expostos à superfície da amostra. Abordagens correlativas pode obter a imagem de fluorescência a partir de uma célula inteira em primeiro lugar, quer a partir de imuno-fluorescência ou proteínas geneticamente marcadas. A amostra é, em seguida, fixadas e incluídas para a microscopia electrónica, e as imagens são correlacionados 1-3. No entanto, a imagem de baixa resolução da fluorescência e da falta de marcadores fiduciais exclui a localização precisa de proteínas. Alternativamente, imagens de fluorescência pode ser feito após a preservar o espécime em plástico. EmNesta abordagem, o bloco é seccionado, e as imagens de fluorescência e as micrografias electrónicas de a mesma secção são correlacionados 4-7. No entanto, o limite de difracção de luz na imagem correlacionada obscurece as localizações das moléculas individuais, e a fluorescência frequentemente se estende para além do limite da célula. Nano-resolução de fluorescência microscopia eletrônica (nano-FEM) é projetado para localizar proteínas em escala nanométrica por imagens usando as mesmas seções de foto-ativado microscopia localização (PALM) e microscopia eletrônica. PALM ultrapassa o limite de difracção por imagem individuais proteínas fluorescentes e, subsequentemente, o mapeamento do centroide de cada mancha fluorescente 8-10. Nós delineamos a técnica de nano-FEM em cinco etapas. Em primeiro lugar, a amostra é fixa e incorporado utilizando condições que preservam a fluorescência de proteínas marcadas. Em segundo lugar, os blocos de resina são cortados em segmentos ultrafinas (70-80 nm), que são montadossobre uma tampa de vidro. Em terceiro lugar, é criada uma imagem de fluorescência nestas secções, utilizando o microscópio Zeiss PALM. Quarta, estruturas densas de elétrons são gravadas nestas mesmas seções usando um microscópio eletrônico de varredura. Em quinto lugar, as micrografias de fluorescência e de electrões são alinhadas usando partículas de ouro como marcadores fiduciais. Em resumo, a localização subcelular de proteínas marcadas com fluorescência pode ser determinada com alta nanometros em cerca de uma semana.

Descreve-se um método para localizar proteínas marcadas por fluorescência em micrografias electrónicas. A fluorescência é inicialmente localizado utilizando foto-activado microscopia localização em cortes ultrafinos. Estas imagens são então alinhadas com micrografias electrónicas da mesma secção.

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

O mapeamento da distribuição de proteínas é essencial para a compreensão da função proteica em uma célula. A microscopia de fluorescência é amplamente utilizada para...

O objetivo geral do experimento a seguir é localizar proteínas e micrografias eletrônicas utilizando microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica correlacionadas. Este método, conhecido como nano FEM, é usado para localizar proteínas em C. elegans. Primeiro, um verme transgênico que expressa histona TD eos é embutido em plástico e seccionado.Cada seção é imagiada por microscopia de localização por ativação fotônica ou PALM e por microscopia eletrônica de varredura. As duas micrografias de cada seção são alinhadas usando marcadores fiduciais no Photoshop. A imagem correlativa mostra a localização de moléculas de histona no núcleo.Portanto, a principal vantagem da técnica que vamos descrever hoje é que, em vez de usar imuno-EM, estamos utilizando fluoróforos codificados geneticamente, de modo que cada proteína esteja associada a uma proteína fluorescente. Ao trabalhar com imuno-EM, muitos dos anticorpos não funcionam com plásticos. Simplesmente não são compatíveis, e, mesmo que sejam, os anticorpos não conseguem penetrar profundamente na seção onde estão os antígenos.Ao usar proteínas fluorescentes, cada proteína é marcada com um fluoróforo. Assim, hoje Shige WBI demonstrará esta técnica. O seguinte procedimento será demonstrado utilizando nematoides transgênicos que expressam histonas marcadas com a proteína fluorescente TDE os.Para esta demonstração, utilizaremos bactérias como crioprotetor, mas você também pode usar BSA 20% para congelar a *sea elegance*. Uma hora antes da substituição por congelação, preencha o aparelho automático de substituição por congelação ou um dispositivo de FS com nitrogênio líquido. Também com antecedência, prepare os fixadores necessários de acordo com as instruções no documento anexo, armazene os fixadores em alíquotas de um mililitro em tubos criogênicos e coloque-os em nitrogênio líquido até o momento de uso.Use um pincel para recolher os animais de um gramado bacteriano e transferi-los para preencher um porta-espécime de 100 mícrons. Encha levemente além da capacidade para garantir que não haja bolhas de ar. Após o congelamento, coloque o copo do espécime na armadura de um congelador de alta pressão para congelá-lo. Em seguida, transfira imediatamente a amostra para um banho de nitrogênio líquido ao lado da câmara de congelamento.Em seguida, utilizando uma pinça e um par de fórceps, transfira o espécime para um tubo criogênico contendo fixadores. Certifique-se de que o espécime permaneça sob nitrogênio líquido durante todo o tempo. Repita este processo para cada espécime e, depois, transfira todos os tubos criogênicos para uma unidade FS.Após colocar todos os tubos criogênicos na unidade de FS, inicie o programa. O protocolo de congelação e processamento é mostrado neste diagrama. Durante a incubação inicial a menos 90 graus Celsius, o gelo vítreo é substituído pelo fixador em acetona.Em seguida, à medida que a temperatura da amostra aumenta, o fixador na acetona líquida realiza ligações cruzadas com a amostra para preservar a estrutura. Quando a temperatura em uma unidade de FS atingir menos 60 graus Celsius, coloque frascos cintiladores contendo 20 mililitros de acetona a 95% no FS para resfriá-los. Depois, quando a temperatura atingir menos 50 graus Celsius, utilize uma pipeta Pasteur com ponteira P200 para remover o fixador e adicione cerca de um mililitro de acetona a 95% pré-resfriada a cada amostra.Bile.Repita este processo a cada 20 minutos durante duas horas. Além disso, durante a incubação a menos 50 graus Celsius, coloque um frasco de contagem contendo 20 mililitros de acetato de urinal a 0,1% em acetona a 95% numa câmara FS para pré-resfriá-lo a menos 50 graus Celsius. Em seguida, após a última lavagem com acetona, adicione cerca de um mililitro da solução de acetato de urinal a cada frasco para corar a amostra e realçar o contraste da membrana.Se o programa tiver sido pausado, reinicie-o. Quando a temperatura atingir menos 40 graus Celsius, coloque frascos cintiladores contendo etanol a 95% na câmara FS. Quando a temperatura atingir menos 30 graus Celsius, utilize uma pipeta de Pasteur para substituir o acetato de uranila por etanol a 95% a cada 20 minutos durante duas horas.É importante usar etanol nesta etapa, pois a resina não polimerizará na presença de acetona. Na próxima parte do protocolo, os espécimes são embutidos em plástico enquanto se encontram a menos 30 graus Celsius. Em um FS, substitua o etanol 95% por resina pré-resfriada de metacrilato de glicol, ou GMA, em etanol 95%. Após três a cinco horas, substitua a GMA 30% pela GMA 70%. Após quatro a seis horas, remova a GMA 70% e incube os espécimes em GMA 97% durante a noite.O aumento gradativo da concentração de GMA permite a penetração do meio nos tecidos. Observe que, como 3% de água é adicionada à resina de GMA, o GMA a 97% não é diluído. No dia seguinte, com etanol, transfira as amostras para um molde de inclusão no A FS usando uma pipeta de Pasteur; coloque as amostras no molde de inclusão e, então, substitua o GMA a 97% por GMA recém-preparado três vezes ao longo de seis horas a menos 30 graus celsius.Após a terceira troca, toque suavemente na matriz bacteriana para separar o espécime do crioprotetor. Adicione o iniciador nn dimetil udina ao GMA a 97% em um frasco com ventilação. A quantidade de iniciador adicionada é de 1,5 microlitros por mililitro de GMA; adicione imediatamente a solução de GMA a cada molde de inclusão e posicione os animais no molde de modo que fiquem uniformemente espaçados.Reinicie o programa para que a temperatura aumente a menos 20 graus Celsius. Embora a resina polimerize rapidamente dentro de uma hora, deixe o plástico curar durante a noite a menos 20 graus Celsius. Para garantir que a polimerização seja completa.Após a cura do plástico, armazene o espécime em um saco à vácuo preenchido com gás nitrogênio a menos 20 graus Celsius. O corte de espécimes embutidos em GMA deve então ser realizado conforme descrito no documento complementar para microscopia de localização ativada por luz ou imagem PALM. O sistema de microscópio deve ser configurado com a câmera E-M-C-C-D ajustada a menos 70 graus Celsius ou abaixo.Usando uma pipeta, aplique cerca de 50 microlitros de partículas de ouro de 100 nanômetros a uma concentração de um vezes 10 à décima potência partículas por mililitro em solução sobre a amostra a ser visualizada. Coloque uma tampa preta sobre as amostras e deixe a solução repousar por 30 segundos sobre a lamínula. Para remover a solução de ouro, empurre-a até a borda da lamínula e absorva-a com um lenço de papel absorvente.Em seguida, aplique graxa de vácuo a um suporte circular para lamínula e insira a lamínula. Aplique óleo de imersão na face inferior da lamínula. Posicione-a diretamente abaixo da amostra.Insira o porta-amostras na ranhura da platina do microscópio e ajuste-o de modo que fique bem firme e centralize as seções acima da objetiva. Tenha especial cuidado para não tocar nas objetivas. Em seguida, utilizando iluminação de campo claro, localize as seções com uma lente objetiva de 10 x.Em seguida, mude para a lente objetiva de 100 x e foque no espécime. Se necessário, alterne para iluminação de fluorescência utilizando o laser de 488 nanômetros com a intensidade ajustada em 10%. Aguarde cinco minutos para que a temperatura da amostra atinja equilíbrio. Então, identifique as regiões com a fluorescência mais intensa e coloque-as em foco.Altere os lasers para 561 nanômetros e aumente a intensidade para 100%. Para eliminar a autofluorescência de fundo, bata a amostra por aproximadamente dois minutos. Se o foco mudar durante a cloração, aguarde cinco minutos antes de ajustar o foco e capturar as imagens. Quando a cloração estiver concluída, ative o laser de 405 nanômetros e configure-o na intensidade mais baixa.Inicie a coleta das imagens a 20 quadros por segundo. Colete um número suficiente de quadros para atingir o objetivo do experimento aqui. São coletados de 5.000 a 6.000 quadros para determinar a localização de 584 proteínas da histona dentro de um núcleo.Após a coleta de 5.000 quadros, todas as moléculas são identificadas e mapeadas pelo software de imagem. A imagem de fluorescência final, ou chamada imagem de some turf, é uma composição de toda a fluorescência detectada pela câmera. Em contraste, a imagem palm mapeia o OID de cada ponto fluorescente e apenas indica a localização de cada proteína.Antes da imagem em MEV, corar os cortes utilizando acetato de uranila a 2,5% em água durante quatro minutos. Remover completamente o acetato de uranila com água Milli-Q filtrada. Após a secagem dos cortes, usar um sputter para revestir com carbono a lamínula até que fique suficientemente escura.Aplicar fita condutora de carbono na borda da lamínula em uma extremidade e no suporte metálico na outra extremidade, de modo que os elétrons que se acumulam na superfície da lamínula sejam aterrados. Montar a lamínula na câmara do MEV e localizar a amostra no microscópio. Obter uma imagem de baixa ampliação da amostra, depois ampliar a região de interesse e obter imagens de alta ampliação.Repita este processo com uma nova seção até que todas as seções tenham sido imagiadas. Em seguida, as imagens de palma e de ME devem ser alinhadas. Para isso, primeiro abra as imagens de ME adquiridas no Photoshop.Crie uma nova janela com dimensões de 5.000 por 5.000 pixels e resolução de 300 pixels por polegada. Copie a imagem de MEV com ampliação carregada para a nova janela. Utilize o comando de transformação livre encontrado no menu editar para redimensionar a imagem, de modo que ela preencha toda a janela.Em seguida, copie as imagens de MEV com maior aumento e redimensione e transforme conforme necessário. Selecione a rotação da imagem na barra de menu suspenso da imagem e inverta a imagem da soma do tapete de grama horizontalmente. Copie e cole a imagem da soma do tapete de grama em uma nova camada.Utilize o comando de transformação livre encontrado no menu editar para redimensionar a imagem, de modo que ela tenha aproximadamente o mesmo tamanho da micrografia eletrônica de baixa ampliação. Em seguida, rotacione a imagem conforme necessário para alinhar a fluorescência das partículas de ouro com as estruturas correspondentes visualizadas na MEV. Depois, copie a imagem da palma para uma nova camada e aplique a mesma transformação para extrair uma imagem de maior ampliação.Aproxime a região de interesse e copie a imagem da palma da mão a partir dessa região. Cole a imagem em uma imagem de MEV de maior resolução para apresentação. Deve-se aplicar uma transparência em gradiente à imagem da palma da mão, de modo que apenas o fundo preto, e não os sinais da palma, torne-se transparente.Copie a imagem da palma transformada para uma nova camada. Selecione os sinais da palma, mas não o fundo, utilizando o intervalo de cores no menu suspenso Selecionar. Em seguida, selecione um pixel de fundo como referência e ative a opção de inversão.Corte os sinais de palma desejados e cole-os em uma nova camada. Aplique transparência à camada de fundo e defina-a em 10%. Isso permite a visualização dos sinais de palma, tornando o fundo transparente sem comprometer a intensidade. Proteína histona.Os eos com marcação em His 11 foram expressos de forma estável no nematódeo C. elegans, e os animais transgênicos foram processados e analisados utilizando o protocolo descrito neste vídeo. Micrografias de palma e eletrônicas foram obtidas a partir da mesma seção. As nanopartículas de ouro, que aparecem tanto nas micrografias de fluorescência quanto nas eletrônicas, foram então utilizadas para alinhar as duas imagens.Aqui ampliamos uma região próxima à extremidade superior da micrografia. Como pode ser observado aqui, detalhes subcelulares, como um núcleo.Um núcleo, poros nucleares e retículo endoplasmicopodem ser observados. No entanto, as moléculas de histona marcadas estão exclusivamente localizadas no núcleo, mas não no núcleo. Como esperado, a microscopia eletrônica e PALM correlativas permitem, assim, a localização de proteínas com a mais alta resolução. Após realizar este procedimento, pode-se obter esses cortes com a distribuição das proteínas e empilhá-los utilizando tomografia de matriz, de modo a gerar uma estrutura tridimensional, a qual mostra onde as proteínas estão distribuídas na célula.E lembre-se de que, ao usar o tetróxido de ósmio, trata-se de um produto químico muito perigoso, e você sempre deve usar luvas.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o BiFC-PALM ― uma combinação de microscopia de localização fotoativada e complementação de fluorescência bimolecular ― para avaliar as interações proteína-proteína. BiFC envolve a fusão de dois fragmentos de proteína fluorescente com duas proteínas de interesse que interagem. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos são aproximados, o que permite que as duas partes se juntem e reconstituam uma proteína fluorescente funcional. A fluorescência de um único fluoróforo é...

Microscopia de localização fotoativada acoplada à complementação de fluorescência bimolecular

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

As interações proteína-proteína são visualizadas em células com resolução espacial nanométrica combinando complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com microscopia de localização fotoativada (PALM). Descrito aqui é o uso de BiFC-PALM para interações Ras-Raf de imagem em células U2OS para visualizar o agrupamento em nanoescala e difusão de complexos Ras-Raf individuais.

Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

O presente protocolo descreve uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica clonável para detecção de proteínas marcadas com metalotioneína em células usando uma nova técnica de síntese de nanopartículas de ouro baseada em mecanismo de supressão de autonucleação.

Síntese Direta de Nanopartículas de Ouro EM-Visíveis em Células para Análise de Localização de Proteínas com Ultraestrutura Bem Preservada

Aprenda a localizar proteínas em micrografias eletrônicas usando microscopia de fluorescência correlacionada. Este método nano-FEM utiliza nematódeos transgênicos expressando histonas marcadas com proteínas fluorescentes para visualização precisa.

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

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