Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

O objetivo geral do experimento a seguir é localizar proteínas e micrografias eletrônicas utilizando microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica correlacionadas. Este método, conhecido como nano FEM, é usado para localizar proteínas em C. elegans. Primeiro, um verme transgênico que expressa histona TD eos é embutido em plástico e seccionado.

Cada seção é imagiada por microscopia de localização por ativação fotônica ou PALM e por microscopia eletrônica de varredura. As duas micrografias de cada seção são alinhadas usando marcadores fiduciais no Photoshop. A imagem correlativa mostra a localização de moléculas de histona no núcleo.

Portanto, a principal vantagem da técnica que vamos descrever hoje é que, em vez de usar imuno-EM, estamos utilizando fluoróforos codificados geneticamente, de modo que cada proteína esteja associada a uma proteína fluorescente. Ao trabalhar com imuno-EM, muitos dos anticorpos não funcionam com plásticos. Simplesmente não são compatíveis, e, mesmo que sejam, os anticorpos não conseguem penetrar profundamente na seção onde estão os antígenos.

Ao usar proteínas fluorescentes, cada proteína é marcada com um fluoróforo. Assim, hoje Shige WBI demonstrará esta técnica. O seguinte procedimento será demonstrado utilizando nematoides transgênicos que expressam histonas marcadas com a proteína fluorescente TDE os.

Para esta demonstração, utilizaremos bactérias como crioprotetor, mas você também pode usar BSA 20% para congelar a *sea elegance*. Uma hora antes da substituição por congelação, preencha o aparelho automático de substituição por congelação ou um dispositivo de FS com nitrogênio líquido. Também com antecedência, prepare os fixadores necessários de acordo com as instruções no documento anexo, armazene os fixadores em alíquotas de um mililitro em tubos criogênicos e coloque-os em nitrogênio líquido até o momento de uso.

Use um pincel para recolher os animais de um gramado bacteriano e transferi-los para preencher um porta-espécime de 100 mícrons. Encha levemente além da capacidade para garantir que não haja bolhas de ar. Após o congelamento, coloque o copo do espécime na armadura de um congelador de alta pressão para congelá-lo. Em seguida, transfira imediatamente a amostra para um banho de nitrogênio líquido ao lado da câmara de congelamento.

Em seguida, utilizando uma pinça e um par de fórceps, transfira o espécime para um tubo criogênico contendo fixadores. Certifique-se de que o espécime permaneça sob nitrogênio líquido durante todo o tempo. Repita este processo para cada espécime e, depois, transfira todos os tubos criogênicos para uma unidade FS.

Após colocar todos os tubos criogênicos na unidade de FS, inicie o programa. O protocolo de congelação e processamento é mostrado neste diagrama. Durante a incubação inicial a menos 90 graus Celsius, o gelo vítreo é substituído pelo fixador em acetona.

Em seguida, à medida que a temperatura da amostra aumenta, o fixador na acetona líquida realiza ligações cruzadas com a amostra para preservar a estrutura. Quando a temperatura em uma unidade de FS atingir menos 60 graus Celsius, coloque frascos cintiladores contendo 20 mililitros de acetona a 95% no FS para resfriá-los. Depois, quando a temperatura atingir menos 50 graus Celsius, utilize uma pipeta Pasteur com ponteira P200 para remover o fixador e adicione cerca de um mililitro de acetona a 95% pré-resfriada a cada amostra.Bile.

Repita este processo a cada 20 minutos durante duas horas. Além disso, durante a incubação a menos 50 graus Celsius, coloque um frasco de contagem contendo 20 mililitros de acetato de urinal a 0,1% em acetona a 95% numa câmara FS para pré-resfriá-lo a menos 50 graus Celsius. Em seguida, após a última lavagem com acetona, adicione cerca de um mililitro da solução de acetato de urinal a cada frasco para corar a amostra e realçar o contraste da membrana.

Se o programa tiver sido pausado, reinicie-o. Quando a temperatura atingir menos 40 graus Celsius, coloque frascos cintiladores contendo etanol a 95% na câmara FS. Quando a temperatura atingir menos 30 graus Celsius, utilize uma pipeta de Pasteur para substituir o acetato de uranila por etanol a 95% a cada 20 minutos durante duas horas.

É importante usar etanol nesta etapa, pois a resina não polimerizará na presença de acetona. Na próxima parte do protocolo, os espécimes são embutidos em plástico enquanto se encontram a menos 30 graus Celsius. Em um FS, substitua o etanol 95% por resina pré-resfriada de metacrilato de glicol, ou GMA, em etanol 95%. Após três a cinco horas, substitua a GMA 30% pela GMA 70%. Após quatro a seis horas, remova a GMA 70% e incube os espécimes em GMA 97% durante a noite.

O aumento gradativo da concentração de GMA permite a penetração do meio nos tecidos. Observe que, como 3% de água é adicionada à resina de GMA, o GMA a 97% não é diluído. No dia seguinte, com etanol, transfira as amostras para um molde de inclusão no A FS usando uma pipeta de Pasteur; coloque as amostras no molde de inclusão e, então, substitua o GMA a 97% por GMA recém-preparado três vezes ao longo de seis horas a menos 30 graus celsius.

Após a terceira troca, toque suavemente na matriz bacteriana para separar o espécime do crioprotetor. Adicione o iniciador nn dimetil udina ao GMA a 97% em um frasco com ventilação. A quantidade de iniciador adicionada é de 1,5 microlitros por mililitro de GMA; adicione imediatamente a solução de GMA a cada molde de inclusão e posicione os animais no molde de modo que fiquem uniformemente espaçados.

Reinicie o programa para que a temperatura aumente a menos 20 graus Celsius. Embora a resina polimerize rapidamente dentro de uma hora, deixe o plástico curar durante a noite a menos 20 graus Celsius. Para garantir que a polimerização seja completa.

Após a cura do plástico, armazene o espécime em um saco à vácuo preenchido com gás nitrogênio a menos 20 graus Celsius. O corte de espécimes embutidos em GMA deve então ser realizado conforme descrito no documento complementar para microscopia de localização ativada por luz ou imagem PALM. O sistema de microscópio deve ser configurado com a câmera E-M-C-C-D ajustada a menos 70 graus Celsius ou abaixo.

Usando uma pipeta, aplique cerca de 50 microlitros de partículas de ouro de 100 nanômetros a uma concentração de um vezes 10 à décima potência partículas por mililitro em solução sobre a amostra a ser visualizada. Coloque uma tampa preta sobre as amostras e deixe a solução repousar por 30 segundos sobre a lamínula. Para remover a solução de ouro, empurre-a até a borda da lamínula e absorva-a com um lenço de papel absorvente.

Em seguida, aplique graxa de vácuo a um suporte circular para lamínula e insira a lamínula. Aplique óleo de imersão na face inferior da lamínula. Posicione-a diretamente abaixo da amostra.

Insira o porta-amostras na ranhura da platina do microscópio e ajuste-o de modo que fique bem firme e centralize as seções acima da objetiva. Tenha especial cuidado para não tocar nas objetivas. Em seguida, utilizando iluminação de campo claro, localize as seções com uma lente objetiva de 10 x.

Em seguida, mude para a lente objetiva de 100 x e foque no espécime. Se necessário, alterne para iluminação de fluorescência utilizando o laser de 488 nanômetros com a intensidade ajustada em 10%. Aguarde cinco minutos para que a temperatura da amostra atinja equilíbrio. Então, identifique as regiões com a fluorescência mais intensa e coloque-as em foco.

Altere os lasers para 561 nanômetros e aumente a intensidade para 100%. Para eliminar a autofluorescência de fundo, bata a amostra por aproximadamente dois minutos. Se o foco mudar durante a cloração, aguarde cinco minutos antes de ajustar o foco e capturar as imagens. Quando a cloração estiver concluída, ative o laser de 405 nanômetros e configure-o na intensidade mais baixa.

Inicie a coleta das imagens a 20 quadros por segundo. Colete um número suficiente de quadros para atingir o objetivo do experimento aqui. São coletados de 5.000 a 6.000 quadros para determinar a localização de 584 proteínas da histona dentro de um núcleo.

Após a coleta de 5.000 quadros, todas as moléculas são identificadas e mapeadas pelo software de imagem. A imagem de fluorescência final, ou chamada imagem de some turf, é uma composição de toda a fluorescência detectada pela câmera. Em contraste, a imagem palm mapeia o OID de cada ponto fluorescente e apenas indica a localização de cada proteína.

Antes da imagem em MEV, corar os cortes utilizando acetato de uranila a 2,5% em água durante quatro minutos. Remover completamente o acetato de uranila com água Milli-Q filtrada. Após a secagem dos cortes, usar um sputter para revestir com carbono a lamínula até que fique suficientemente escura.

Aplicar fita condutora de carbono na borda da lamínula em uma extremidade e no suporte metálico na outra extremidade, de modo que os elétrons que se acumulam na superfície da lamínula sejam aterrados. Montar a lamínula na câmara do MEV e localizar a amostra no microscópio. Obter uma imagem de baixa ampliação da amostra, depois ampliar a região de interesse e obter imagens de alta ampliação.

Repita este processo com uma nova seção até que todas as seções tenham sido imagiadas. Em seguida, as imagens de palma e de ME devem ser alinhadas. Para isso, primeiro abra as imagens de ME adquiridas no Photoshop.

Crie uma nova janela com dimensões de 5.000 por 5.000 pixels e resolução de 300 pixels por polegada. Copie a imagem de MEV com ampliação carregada para a nova janela. Utilize o comando de transformação livre encontrado no menu editar para redimensionar a imagem, de modo que ela preencha toda a janela.

Em seguida, copie as imagens de MEV com maior aumento e redimensione e transforme conforme necessário. Selecione a rotação da imagem na barra de menu suspenso da imagem e inverta a imagem da soma do tapete de grama horizontalmente. Copie e cole a imagem da soma do tapete de grama em uma nova camada.

Utilize o comando de transformação livre encontrado no menu editar para redimensionar a imagem, de modo que ela tenha aproximadamente o mesmo tamanho da micrografia eletrônica de baixa ampliação. Em seguida, rotacione a imagem conforme necessário para alinhar a fluorescência das partículas de ouro com as estruturas correspondentes visualizadas na MEV. Depois, copie a imagem da palma para uma nova camada e aplique a mesma transformação para extrair uma imagem de maior ampliação.

Aproxime a região de interesse e copie a imagem da palma da mão a partir dessa região. Cole a imagem em uma imagem de MEV de maior resolução para apresentação. Deve-se aplicar uma transparência em gradiente à imagem da palma da mão, de modo que apenas o fundo preto, e não os sinais da palma, torne-se transparente.

Copie a imagem da palma transformada para uma nova camada. Selecione os sinais da palma, mas não o fundo, utilizando o intervalo de cores no menu suspenso Selecionar. Em seguida, selecione um pixel de fundo como referência e ative a opção de inversão.

Corte os sinais de palma desejados e cole-os em uma nova camada. Aplique transparência à camada de fundo e defina-a em 10%. Isso permite a visualização dos sinais de palma, tornando o fundo transparente sem comprometer a intensidade. Proteína histona.

Os eos com marcação em His 11 foram expressos de forma estável no nematódeo C. elegans, e os animais transgênicos foram processados e analisados utilizando o protocolo descrito neste vídeo. Micrografias de palma e eletrônicas foram obtidas a partir da mesma seção. As nanopartículas de ouro, que aparecem tanto nas micrografias de fluorescência quanto nas eletrônicas, foram então utilizadas para alinhar as duas imagens.

Aqui ampliamos uma região próxima à extremidade superior da micrografia. Como pode ser observado aqui, detalhes subcelulares, como um núcleo.

Um núcleo, poros nucleares e retículo endoplasmicopodem ser observados. No entanto, as moléculas de histona marcadas estão exclusivamente localizadas no núcleo, mas não no núcleo. Como esperado, a microscopia eletrônica e PALM correlativas permitem, assim, a localização de proteínas com a mais alta resolução. Após realizar este procedimento, pode-se obter esses cortes com a distribuição das proteínas e empilhá-los utilizando tomografia de matriz, de modo a gerar uma estrutura tridimensional, a qual mostra onde as proteínas estão distribuídas na célula.

E lembre-se de que, ao usar o tetróxido de ósmio, trata-se de um produto químico muito perigoso, e você sempre deve usar luvas.