Name: Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Aprenda a colher e crioresfriar cristais de proteínas de membrana crescidas em fases lipídicas cúbicas e esponja para cristalografia de raios X. Este método preserva a integridade estrutural das amostras.

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Há muitas pessoas que contribuíram para este trabalho e são mais da membrana Caffrey Estrutural e Funcional Grupo Biologia, ambos membros passados ​​e presentes. Para todos, e especialmente para Jingquan Tan e Lyon José, nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreciação. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Fundação Ciência da Irlanda (07/IN.1/B1836), os Institutos Nacionais de Saúde (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e do 7 COST e Acções Marie Curie (CM0902 e PIEF-GA-2009 -235612).

1. Laboratório de Set-up pré-colheita <ol><li> Em preparação para a colheita, preencher a espuma seca Dewar com nitrogênio líquido e colocá-lo ao lado do microscópio, onde a colheita está a ter lugar. </li><li> Submergir o disco de memória, abra acabam, no nitrogênio líquido dentro do Dewar espuma e deixe-o esfriar completamente. </li><li> Assegurar uma micro-montagem de um tamanho que corresponde ao cristal a ser colhido numa varinha magnética (Figura 5). É importante ter à mão um número de reposição varas magnéticas pré-carregado com micro-montagens para atender a situações em que é necessária a colheita de cristais a partir das várias um bolus. Spare varinhas devem estar disponíveis em todos os momentos. </li><li> Coloque uma micropipeta, pontas e a solução precipitante que foi utilizado para o crescimento de cristais ao lado do microscópio colheita. Pode ser necessário para cobrir a mesofase e para evitar a secagem quando o poço é aberto. </li><li> Tenha um caderno e uma caneta no banco por perto e / ouo computador abrir. Estes serão utilizados para gravar observações sobre a qualidade, a aparência, a localização, número de puck armazenamento, etc, dos cristais à medida que são colhidas, crio-arrefecida e colocada em armazém. </li><li> Se um assistente está disponível para ajudar com a colheita que pessoa deve entender claramente que o protocolo seja seguido, a ordem em que os vários passos será realizada, e o seu papel no processo global. </li></ol> Com todos os materiais e equipamentos em local a nossa próxima tarefa é: 2. Identificar Pratos e poços que contêm cristais <ol><li> O método mais simples e direta para encontrar cristais cultiváveis ​​é inspecionar poços à mão usando um microscópio com normal e com luz polarizada cruzada. Ajustar a intensidade da luz que ilumina o microscópio pode ajudar a localizar cristais. </li><li> Alternativamente, um gerador de imagens, onde as placas são rastreadas automaticamente com normal e cruzado polarized luz, pode ser usado para procurar cristais. </li><li> Avaliar por olho gravado imagens digitais em um monitor de computador. </li><li> Marcar claramente os poços com cristais para colheita e registro de comentários sobre o tamanho, qualidade e localização dos cristais na mesofase no notebook ou em um computador. </li><li> Remova a placa contendo cristais para a colheita a partir do sensor de imagem. </li></ol> 3. Abrindo um poço com mesofase cúbico. Método 1 As placas em que os cristais cresçam pelo método de meso são placas de vidro em sanduíche (figura 2). A fim de aceder a mesofase e os cristais, são preferíveis, é necessário abrir o poço. Isto é feito por meio de uma ferramenta de corte para cortar o vidro lamela superior que veda o bem que pode, então, ser removido. Existem várias abordagens para o corte e remoção da lamela em mais de uma cristalização bem. O que deve ser usado é ditada pelo tipo of mesofase na qual o cristal se encontra em crescimento. Esta pode ser a fase muito viscosa e pegajosa cúbico (Figura 3A) ou a sua variante mais fluidos, a fase esponja (Figura 3B). Neste artigo de vídeo que mostram como abrir poços e na colheita de cristais de ambos os materiais de hospedagem. <ol><li> Coloque a placa de vidro cristalização sanduíche no palco de um microscópio de luz. </li><li> Utilizando uma ferramenta de corte de vidro score a lamela levemente com dois círculos concêntricos situados acima do espaçador e do lado de fora do perímetro da cavidade. Com uma ferramenta de corte novo, requer pressão aplicada pontuação mínima. Substituir a ferramenta com um novo quando a pressão necessária para contagem aumenta ainda fraccionada, o que normalmente ocorre após a abertura de 10 poços. </li><li> Quebra-se o vidro no espaço entre os dois círculos marcados com o propósito de libertar o lamela interior. Isso gera muitos cacos de vidro e pó. Limpá-las com uma umedecidotoalha de papel. </li><li> Retire a lamínula libertou segurando-o com uma pinça de ponta fina e inclinando-o longe de dentro e fora do poço. Neste caso, a fase cúbica permanece preso no lugar e na placa de base do poço. </li><li> Aumentar o zoom para obter uma visão mais clara da mesofase cúbico que agora está pronto para ser utilizado na colheita de cristal. </li></ol> 4. Abrindo um Bem com mesofase cúbico. Método 2 <ol><li> Utilizando a ferramenta de corte de vidro pontuação linhas rectas paralelas na lamela a um lado do poço, e que se estendem por todo o poço em si. Isto permite um acesso mais fácil a pinça e retirada da lamela. </li></ol> Nesta demonstração particular, a lamela rachaduras na libertação da lamela da superfície pegajosa espaçador. No processo, a lamela muda de posição e o precipitante separa da fase cúbica. Quando a lamela é levantado algum do precipitante a acompanha. Ficamos com um b expostosolus de mesofase sem qualquer precipitante circundante. Imediatamente, adicionar um precipitante ul fresco no topo do bolo utilizando uma micropipeta para impedir a mesofase de secar e passando por uma mudança de fase que podem danificar os cristais. O bólus está agora pronto para ser usado na colheita de cristais. 5. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Sem sucesso A fase esponja é menos tolerante a trabalhar com devido à sua capacidade de fluir. Se que os resultados de fluxo na fase esponja contactando o perímetro da capilaridade assim vai chamar a mesofase e os cristais serão perdidos. Um exemplo de que isso aconteça é mostrada neste vídeo. <ol><li> Zoom sobre a fase de esponja e alternar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais na fase de esponja. </li><li> Em preparação para a abertura do escore bem e cortar a lamela, como descrito na Seção 3. No processo, a lamela rachaduras. Na tentativação para abrir a bem os deslocamentos precipitantes na direcção da fenda e, eventualmente, que entra em contacto com o separador. Com o precipitante de alguma da fase esponja e da sua carga de cristais que se perderam. </li></ol> Nesta sequência particular, os polarizadores no microscópio não são completamente cruzados e os cristais podem ser vistos como objectos brilhantes ao mesmo tempo que o poço e os seus conteúdos permanecem visíveis. 6. Abrindo um Bem com a Fase Esponja. Com sucesso <ol><li> Zoom sobre a fase de esponja e identificar um cristal, tanto em normal e cruzado luz polarizada. </li><li> Pontuação, cortar e remover uma seção de lamínula cobrindo o bem, como na Seção 4.1. Incompleta cruzou a luz polarizada é usada para manter o controle do cristal. </li><li> Introduzir uma folha de papel de seda seca, através da abertura na lamela e para dentro do poço até ela tocar a solução precipitante. Pavio fora a solução cuidadosoly até que seja quase todos embora e depois remover o tecido. Isso faz com que o precipitado restante e fase esponja, com o cristal ainda no lugar, para retrair sob a lamela. </li><li> Pontuação, cortar e remover com uma pinça o resto da lamela, como na Seção 4.1. Neste caso, a fase esponja divide; alguns permanece no poço e algumas varas para a lamela. O cristal é em bolus na lamela. Pois há muito pouca presente precipitante, a fase esponja começa a sofrer uma transição de fase provavelmente devido a secagem. Isto pode ser visto como um anel de birrefringência que migra em direcção ao centro do bolo. Imediatamente adicionar precipitante para o bolus para deter a transição. O bolo já está pronto para uso em colheita de cristal. </li></ol> 7. Colheita e Cryo-arrefecimento cristais a partir da fase cúbica <ol><li> Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais nas bolus fase cúbicos no bem aberto. Em ta sua sequência de vídeo até quatro cristais birrefringentes pode ser visto nos bolus fase cúbica com luz polarizada cruzada. </li><li> Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para sondar a mesofase recém exposta para cristais, para pescar cristais e, em seguida, ao mergulhá-los, contido no crio-loop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Idealmente, a colheita ea pressão refrigeração deve acontecer em um movimento contínuo e rápido. Como mesofase pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Em nossa experiência, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais. </li><li> Uma vez que não é possível olhar para o cristal no crio-loop imediatamente após a colheita, inspeccionar o bolus mesofase usado para colher a fim de verificar que o cristal já não existe sugerindo que foi colhida com sucesso. </li></ol> 8. Colheita e Cryo-arrefecimento Cristais da Fase Sponge <ol><li> Ir e voltar entre normal e cruzado luz polarizada para localizar cristais no bolo fase esponja no poço aberto. Nesta sequência de vídeo muitos cristais birrefringentes pode ser visto no bolus sob luz polarizada cruzada. </li><li> Use uma. Montado crio-loop (Figura 5) para pescar cristais a partir da fase de esponja e mergulhá-los, contido dentro ou sobre a cryoloop, em azoto líquido no vaso Dewar imediatamente após a colheita Tal como acontece com a colheita da fase cúbica, idealmente, o processo de crio-resfriamento deve acontecer imediatamente o cristal é colhida com tão pouco tempo quanto possível decorrido entre o evento de colheita real e mergulhar em nitrogênio líquido. Como fase esponja pouco aderente quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Como se observa, crio-protetor não é necessária com no meso-crescidos cristais. </li></ol> 9. Armazenar em Cristais Dewars <ol><li> Depois mergulhou o circuito montado em ni líquidoTrogen colocá-lo em uma das ranhuras de fixação do disco de armazenamento no Dewar espuma. Todas as manipulações são realizadas com o circuito, a parte superior da varinha magnética e o disco imerso em azoto líquido. </li><li> Registrar o local e detalhes da colheita e crio-refrigerado cristal no notebook e / ou no computador. </li><li> Quando o disco no Dewar cheio de espuma ou de captura para o dia é completada a transferência do disco para dentro de um suporte de disco de um dispositivo de armazenamento em prateleira ou um Dewar transporte cheio com azoto líquido. Os cristais podem ser enviados em Dewars de transporte para a instalação síncrotron para a coleta de dados de difração. </li></ol> 10. Resultados representativos Os objetivos dos exercícios de colheita e crio-refrigeração demonstrado aqui são para transferir um cristal da mesofase hospedagem em crio-loops, para vitrificar o cristal em loop e colocá-lo no armazenamento em nitrogênio líquido em um Dewar. A situação ideal é quando a colheita e cryo-arrefecimento é feito de tal modo que a qualidade de difracção do cristal é preservada durante o processo. Como mesofase pouco quanto possível, deve ser colhida com o cristal. Isto é para tornar a localização do cristal e centrando-o no feixe de raios-X que muito menos exigente, para acelerar o arrefecimento da crio-com vista à vitrificação, e para minimizar a interferência de fundo de dispersão a partir da mesofase durante a recolha de dados de difracção. Alguns exemplos de crio-arrefecidos amostras onde o cristal podem e não podem ser vistas são mostrados na Figura 6. Sempre que o cristal não pode ser visto a olho nu, é geralmente necessário recorrer a rastering difracção, a fim de encontrar o cristal e para centrá-la no feixe de recolha de dados 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática de uma membrana biológica que mostra a bicamada lipídica e em que are situado a uma variedade de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Uma totalmente carregado e selado de 96 poços da placa de vidro de cristalização sanduíche. Cada poço contém 50 nl fase cúbica e uma solução precipitante ul. Para maior clareza, a fase cúbica foi corado com Sudan Red e a solução precipitante compreende azul de metileno. A partir de Referência 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristais de proteínas de membrana que crescem na mesofase lipídica. A. A fase cúbica com um cristal de bacteriorodopsina de H. halobium. B. fase A esponja contendo um cristal do receptor de vitamina B12 BtuB / transportador, a partir de E. coli. Da referência 25. As fases cúbicas e esponja têm contrastantes appeaRances como é óbvio, comparando os painéis A e B. A fase cúbica em que A é extremamente viscosa e retém a sua forma original. Ele não flui. Isto é particularmente evidente nas bordas dos bolus mesofase que têm uma aparência rugosa. Por contrato, a fase de esponja é consideravelmente menos viscoso e flui. Assim, a fase esponja não reter a sua forma original e as suas bordas são caracteristicamente lisa. Precipitantes que incluem Jeffamine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiol, pentaeritritol propoxilato, butanodiol e hexanodiol, pode resultar em uma transição da fase cúbica para a esponja de 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. O fluxograma resume os passos envolvidos na produção de colheita, e crio-de arrefecimento em meso-crescidos cristais de proteína de membrana (A). Apenas os passos cercados pelo vermelho tracejadolinha, e descritos em detalhe em (B), são cobertos neste artigo JoVE. Um painel é de Referência 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Um vazio crio-loop montado em um pino que é realizada no local em uma varinha magnética. Vistas expandidas do pino (A) e micro-montagem (B) desta ferramenta importante para a colheita e crio-arrefecimento são mostrados. O loop vazio no final da micro-montagem em B é de 30 um de diâmetro. Apesar de não ter testado outros tipos de loop extensivamente, nós achamos que o MiTeGen laços trabalho mostrado bem com ambas as fases cúbicas e esponja. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Colhido e crio-arrefecido cristais de proteínas de membrana em crio-loop quando vistos com um microscópio in-line em uma linha de luz síncrotron. A, B. Exemplos de cristais colhidas (Caa3 citocromo oxidase 34 (A), quinase de diacilglicerol, DgkA (B)) em que os cristais (seta azul), são visíveis através da mesofase crio-arrefecido num C. Exemplo crio-loop. de onde o cristal colhido não é visível na mesofase crio-arrefecido num crio-loop. A ponta do laço é identificado com uma seta vermelha. A adesão mesofase crio-refrigerado é identificado com uma seta azul.

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<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000(2012).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo, demonstramos como cristais crescidos numa mesofase lipídica são colhidas e crio-arrefecido em preparação para utilização na recolha de dados de difracção e, finalmente, para a determinação da estrutura. A mesofase hospedagem pode ser a fase viscosa e pegajosa cúbico ou a fase esponja mais fluido 4. Como as placas de sanduíche de vidro são abertas e como os cristais são colhidas depende muito do tipo de mesofase. É importante, portanto, saber qual dos dois é um lidar com antecedência. A identidade do lípido e do precipitante de hospedagem utilizado são importantes, a este respeito, e a aparência física dos bolus mesofase na cristalização bem podem ser usados ​​para distingui-los (Figura 3). A colheita de ambos os tipos de mesofase foi ilustrado neste artigo. Colheita de pequenos cristais de uma mesofase lipídico em placas de sanduíche de vidro é um processo trabalhoso que requer tempo, habilidade exper,IENCE paciência, e uma mão firme. É importante reservar uma quantidade de tempo adequado para a colheita e para configurar o laboratório para que todos os suprimentos e equipamentos estão à mão com antecedência. Uma segunda pessoa para facilitar a colheita não é essencial, mas é recomendado. Essa pessoa pode ajudar com o fornecimento de placas pré-marcadas para o indivíduo fazer a colheita, bem como a colocação de crio-refrigerados laços montados com cristais colhidas para o disco de armazenamento. O assistente também pode desempenhar um papel importante apoio na documentação de observações sobre os cristais feitos durante a colheita, que pode revelar-se crucial durante a coleta de dados de difração. Na ausência de um assistente, um dispositivo ativado por voz de gravação de áudio pode ser usado com vantagem para a documentação. Seguindo o protocolo descrito neste artigo irá ajudar a obter o Visualizador instalado e funcionando com a colheita de cristal. No entanto, é importante ter em conta que o processo não é linear e que practice é necessária antes de se lançar na colheita de cristais de proteínas de membrana valiosos. Recomenda-se, portanto, que as placas de teste com cristais de proteínas que não são particularmente valiosas ser experimentado em primeiro lugar. Isto irá fornecer a neophyte com experiência valiosa no corte de vidro, a remoção de fragmentos de vidro, erguendo-se a lamela de cima da mesofase, utilizando a funcionalidade de polarização no microscópio para observar cristais e localizá-los durante a colheita, e, finalmente, tratamento dos diferentes tipos de mesofases e colher a partir deles. A textura da mesofase, e, por extensão, a facilidade com que os cristais podem ser colhidos, que muda com o tempo, durante a cristalização. É importante, por conseguinte, para a prática de colheita de cristais de menor valor, mas com as que cresceram sob as mesmas condições como as mais importantes. É possível crescer cristais de lisozima e taumatina pelo meso ou no método de fase lipídica cúbica 28 e estes devem ser consideradosrado pelo modo de obter a familiaridade com os materiais e os métodos. Deve-se considerar também a trabalhar com a proteína livre de mesofase primeiro a saber de seus caprichos. Os procedimentos demonstrados aqui foram todas feitas em um confortável 20 ° C ou menos. É possível cultivar os cristais pelo método de meso a temperaturas mais baixas. Assim, como a mono-oleína lipídico hospedagem em um estado metaestável de fase podem ser utilizados, a 4 ° C 1,2,29,30. Uma alternativa é usar a racionalmente concebidos 7,9 MAG para a cristalização a baixa temperatura 31. Fazemos crysallogenesis baixa temperatura rotineiramente com metas determinadas proteínas de membrana. Neste caso, o crescimento dos cristais e a colheita é feita de uma cabina de refrigerador C 4 °. Trabalhando sob tais condições tem seus próprios desafios não menos do que é a necessidade de roupas quentes e confortáveis. O passo seguinte no processo global de determinação da estrutura cristalina através macromolecularestallography é coletar dados de difração em cristais colhidos e snap-resfriado, como demonstrado neste artigo. No meso-grown cristais são geralmente pequenas. No entanto, a recolha de dados úteis de difracção tem sido possível com os cristais possuindo uma dimensão máxima de 20 um 9. Para este efeito, micro-feixe síncrotron radiação X é usado e é o foco de um artigo separado JoVE nesta série 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> Pinças curvas </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Ponteiras descartáveis </td><td> Gilson </td><td> Vário </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Espuma dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Resíduos recipientes de vidro e metal </td><td> Daniels Saúde </td><td> DD479OL </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Ciclos de colheita </td><td> MiTeGen </td><td> Vário </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Colheita microscópio </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Caderno de anotações </td><td> Vário </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Repulsão magnéticabotão varinha de carregamento de amostra </td><td> Hampton Research / dimensões moleculares </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Puck Original (para uso com ALS-estilo apenas robôs) </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-035 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Dispositivos de pipetagem </td><td> Gilson </td><td> Vário </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Soluções precipitantes </td><td> Vário </td><td> Vário </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-030 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Puck Cane envio Guardadas (originais ALS-style) com cabo em forma de gancho e haste de travamento </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-029 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Água purificada </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Óculos de segurança </td><td&gt; Vários </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Bases Pin amostra - magnética (cobre ou não) </td><td> Posicionamento Sistemas de cristal </td><td> CP-111-015 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Envio dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Tecidos </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Carboneto de tungstênio cortador de vidro (Scriber TCT) </td><td> Ferramentas Silverline (Yeovil, no Reino Unido) </td><td> 633657 </td><td> Ferramenta </td></tr></tbody></table>

colheita e cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de cristalografia macromolecular

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Uma via importante para a compreensão de como proteínas funcionar a um nível mecanístico é ter a estrutura da proteína alvo disponível, idealmente em resolução atómica. Presentemente, há apenas uma maneira para captar informação, tais como aplicado a proteínas integrais de membrana (Figura 1), e os complexos se formam, e esse método é a cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Para fazer cristais de qualidade MX difracção que são necessários, no caso de proteínas de membrana, não se formam prontamente. Um método para cristalizar proteínas da membrana que envolve o uso de mesofases lipídicos, especificamente as fases cúbicos e esponja 1-5, ganhou atenção considerável devido tarde para o sucesso que teve no campo receptor acoplado à proteína G 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). No entanto, o método, doravante referida como a em meso ou método fase lipídica cúbico, vem com sua própria técnicadesafios. Estas surgem, em parte, devido à natureza geralmente viscoso e pegajoso da mesofase lipídico no qual os cristais, os quais são muitas vezes micro-cristais, crescer. Manipulando cristais torna-se difícil, como resultado e, particularmente, durante a colheita, 22,23. Os problemas surgem também no passo que precede a colher que requer que as placas de vidro em sanduíche no qual os cristais crescem (Figura 2) 24,25 são abertos para expor o bolus de mesofase, e os cristais na mesma, para a colheita, crio-arrefecimento e X eventuais -ray de coleta de dados de difração. As variantes de mesofase cúbicos e esponja (Figura 3) a partir da qual devem ser colhidas cristais têm reologias 4,26 profundamente diferentes. A fase cúbica é viscosa e pegajosa semelhante a uma pasta de dentes de espessura. Por outro lado, a fase de esponja é mais fluida com uma clara tendência para fluir. Por conseguinte, as diferentes abordagens para a abertura de poços de cristalização containicristais ng crescem na fase cúbica e esponja são chamados como, aliás, para diferentes métodos são necessários para a colheita de cristais a partir dos dois tipos de mesofase. Protocolos para fazer apenas que foram refinados e aplicados no Membrane Biology estrutural e funcional (MS &amp; FB) de grupo, e são descritos em detalhe neste artigo JoVE (Figura 4). São dados exemplos de situações em que os cristais são colhidos com sucesso e crio-arrefecido. Nós também dar exemplos de casos onde os problemas surgem que levam à perda irreparável de cristais e descrever como esses problemas podem ser evitados. Neste artigo o Viewer é fornecido com o passo-a-passo para a abertura de poços de vidro de cristalização de sanduíche, para a colheita e para crio-refrigeração cristais de proteínas da membrana que crescem em cúbico e em fases de esponja.

Aqui é descrito procedimentos implementados na membrana Caffrey Estrutural e Grupo Biologia Funcional para colheita e crio-cool cristais de proteína de membrana lipídica cultivadas em fases cúbicas e esponja de uso na determinação estrutura usando cristalografia de macromoléculas de raios-X.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

Uma via importante para compreender como as proteínas funcionam em nível mecanístico é ter a estrutura da proteína alvo disponível, idealmente em...

Olá e bem-vindo ao Grupo de Biologia Estrutural e Funcional de Membranas. Meu nome é Martin Caffery. Este é mais um artigo de uma série da JO sobre a cristalização de proteínas de membrana para determinação estrutural utilizando o método in meso ou da fase cúbica lítica.No primeiro artigo, Jo de 1 7 1 2, demonstramos como a fase cúbica carregada de proteína é preparada e como a fase viscosa e adesiva, em meso, é dispensada manualmente em placas de cristalização tipo sanduíche de vidro para ensaios de cristalização. Este artigo em vídeo descreverá o método de colheita e resfriamento criogênico de cristais cultivados pelo método in meso. Os materiais e equipamentos necessários para colher e resfriar criogenicamente cristais crescidos em meso são mostrados aqui.Eles incluem um caderno de laboratório para registrar informações sobre os cristais e detalhes da colheita para referência futura, óculos de proteção, recipientes para resíduos de vidro e metal, a placa de cristalização em sanduíche de vidro da qual os cristais serão colhidos. Poços contendo cristais são marcados de forma legível, uma ferramenta de corte de vidro para abrir poços de cristalização, papel-toalha e uma garrafa d'água, pinças curvas, solução do peneiro de precipitante, uma micropipeta e ponteiras, alças de criopreservação para colher cristais, uma haste magnética, um suporte para armazenar alças criopreservadas contendo cristais, uma tampa de espuma cheia de nitrogênio líquido para criopreservação dos cristais, pinças, uma tampa de transporte ou armazenamento e um microscópio de colheita.Como preparação para a colheita, o recipiente de espuma deve ser preenchido com nitrogênio líquido e colocado ao lado do microscópio onde ocorrerá a colheita, com antecedência. O puck de armazenamento, com a extremidade aberta voltada para cima, deve ser submerso no nitrogênio líquido no recipiente e deixado esfriar. Um loop criogênico de tamanho adequado ao cristal a ser colhido deve ser fixado em um suporte microscópico na haste magnética, com todos os materiais e equipamentos devidamente posicionados. Nossa próxima tarefa é identificar as placas e poços que contêm cristais.Podemos fazer isso de duas maneiras. O método mais simples e direto é inspecionar manualmente os poços usando um microscópio com luz normal e com luz polarizada. O segundo método utiliza um sistema de imagem no qual as placas são analisadas automaticamente com luz normal e luz polarizada.Imagens digitais são registradas pelo equipamento de imagem e são avaliadas em um monitor de computador. Poços com cristais para colheita devem ser rotulados claramente. Comentários sobre o tamanho, qualidade e localização dos cristais na imagem devem ser registrados no caderno de laboratório ou em um computador.Isso ajudará na etapa de colheita. Aqui, uma placa contendo cristais para colheita é removida do imageador, abrindo o poço. As placas nas quais os cristais crescem pelo método meso final são placas tipo sanduíche de vidro do tipo mostrado aqui. Para acessar a cavidade e os cristais nela contidos, é necessário abrir o poço.Isso é feito utilizando uma ferramenta de corte de vidro para cortar o vidro de cobertura superior que selo o poço, o qual pode então ser removido. Existem várias abordagens para realizar isso. A escolha do método depende do tipo de meio em que o cristal está crescendo.Essa pode ser a fase cúbica muito viscosa e pegajosa, ou sua variante mais fluida denominada fase esponja. Neste artigo em vídeo, mostramos como abrir poços e colher cristais a partir desses dois materiais hospedeiros. Nesta sequência de vídeo, demonstramos duas maneiras de marcar o vidro de cobertura em um poço contendo a fase cúbica viscosa.A pontuação e o corte são mostrados em detalhes ao serem visualizados com um microscópio óptico. Começamos examinando um único poço de cristalização e identificando suas diferentes partes. A primeira seta vermelha aponta para o bolo de mease que contém os cristais.Incidentalmente, os cristais não são visíveis nesta sequência específica. A segunda seta aponta para a solução precipitante que envolve a mancha. A terceira seta aponta para o perímetro do poço.A quarta seta aponta para o espaçador duplo em forma de bastão sobre o qual o lamínula repousa, utilizando o cortador de vidro. O lamínula é marcado levemente com dois círculos concêntricos posicionados logo fora do perímetro do poço. Em seguida, o cortador de vidro é usado para quebrar o vidro na região entre os dois círculos marcados.Para soltar o vidro de cobertura interno, isso gera muitos fragmentos de vidro e poeira, que podem ser removidos com um pano de papel úmido. O vidro de cobertura solto permanece apoiado no espaçador ao longo de sua borda circular. O vidro de cobertura é removido segurando-o com uma pinça de ponta fina e inclinando-o para longe e para fora do poço.Neste caso, a fase cúbica permanece presa e fixa na base do poço. Parte do precipitante é removida com o lamínula, mas uma fração considerável de precipitante permanece no local ao redor do bolo de mease. Ao ampliar a imagem, obtemos uma visão mais nítida do mease cúbico, que agora está pronto para ser usado na colheita de cristais.Na próxima sequência, mostramos uma segunda maneira de abrir um poço de cristalização contendo a fase cúbica viscosa. Neste caso, são feitos traços retos adicionais e linhas de corte na lamínula ao lado do poço, estendendo-se através do próprio poço. Isso permite um acesso mais fácil com pinças e a remoção da lamínula.Nesta demonstração específica, o lamínula se quebra e, ao soltar o lamínula da superfície aderente ou pegajosa, o próprio lamínula se move e o precipitado se separa da fase cúbica. Quando o lamínula é levantado, parte do precipitado o acompanha. O inseto mostra uma visão ampliada do processo.Agora, resta um bolo exposto de mease, sem nenhum precipitante ao redor para impedir que a mease seque e sofra uma mudança de fase, o que poderia danificar os cristais. Um precipitante fresco é adicionado sobre o bolo usando uma micropipeta preparada. O bolo está agora pronto para ser usado na colheita de cristais.A fase esponja é um pouco menos tolerante para trabalhar devido à sua capacidade de fluir. Se esse fluxo resultar na fase esponja, o contato com a periferia do poço fará com que ela seja sugada para fora e os cristais serão perdidos. Um exemplo desse fenômeno é mostrado no próximo clipe de vídeo.É iniciado com um aumento de aproximação na fase esponjosa e, em seguida, alternando entre luz normal e luz polarizada cruzada. Os cristais, que podem ser observados com alguma dificuldade em luz normal, tornam-se claramente visíveis entre polarizadores cruzados como pontos brilhantes sobre um fundo escuro. Na preparação para abertura do poço, o lamínula é marcado e cortado conforme descrito acima.No processo, no entanto, o lamínula se quebra onde não deveria. Algumas manipulações são realizadas com o objetivo de continuar o processo de abertura do poço, mas o precipitante desloca-se em direção à trinca e, eventualmente, entra em contato com o espaçador; por azar, junto com o precipitante, parte da fase esponja também se desloca, e é claro, sua carga. Naturalmente, nesta sequência específica, os polarizadores do microscópio não estão completamente cruzados, e os cristais podem ser vistos como objetos brilhantes ao mesmo tempo em que o poço e seu conteúdo permanecem visíveis.No próximo clipe, mostramos como o problema é resolvido removendo primeiro o precipitante em excesso. Começamos ampliando a fase da esponja e identificando um cristal, tanto em luz normal quanto entre polarizadores cruzados, um segmento dos lamínulas é recortado e removido cuidadosamente de cima. A luz incompletamente polarizada é usada novamente para observar o cristal, que brilha nitidamente.Um pedaço de papel-toalha seco é introduzido pela abertura no lamínula e dentro do poço até tocar levemente a solução precipitante. A solução é absorvida cuidadosamente até que quase toda ela desapareça e a fase esponjosa comece a se mover na direção do pavio. A remoção do papel faz com que o precipitante remanescente e a fase esponjosa, com os cristais ainda em posição, se retraiam sob o lamínula.Uma repetição em câmera lenta desta última sequência é mostrada aqui para maior clareza. O restante do lamínula é recortado em formato de gomo e cortado. Conforme descrito anteriormente, o lamínula é agora levantado com a pinça.O inserto mostra uma visão ampliada do processo. Neste caso específico, a fase esponja separa alguns resíduos no poço e parte adere ao lamínula. Verifica-se que o cristal está no bolo sobre o lamínula com os polarizadores cruzados.O cristal é claramente visível na fase esponja, mas, como há muito pouco precipitante presente, ele começa a passar por uma transição de fase, provavelmente devido à dessecação. Isso pode ser observado como um anel de franjas de birefringência que migra em direção ao centro do glóbulo. Ao adicionar precipitante ao glóbulo, o processo pode ser interrompido e revertido, em preparação para a próxima etapa, que é a colheita dos cristais.Após abrir o poço e expor a fase hospedeira Misa, o próximo passo do processo é colher os cristais. Nos clipes a seguir, mostramos exemplos de colheita a partir da fase cúbica e da fase esponja. A fase mea no poço recém-aberto é examinada ao microscópio para localizar cristais adequados.Alternar entre luz normal e luz polarizada pode auxiliar muito esse processo. As soluções precipitantes devem estar à mão e disponíveis para serem adicionadas ao bolo, a fim de retardar ou impedir qualquer secagem. Em seguida, utiliza-se um suporte para alça criogênica para sondar a fase de visa recém-exposta em busca de cristais, coletar os cristais e, imediatamente após a colheita, mergulhá-los na alça criogênica em nitrogênio líquido no dur.A seguir, mostramos a coleta inicial a partir da fase cúbica viscosa e adesiva nesta sequência de colheita até quatro franjas de Biore, e os cristais podem ser observados no bolo da fase cúbica utilizando luz polarizada. O loop criogênico entra pela direita, recolhe o cristal com o mínimo possível de meio aderente, é imediatamente resfriado criogenicamente e o loop é colocado no porta-amostras sob nitrogênio líquido. O processo de colheita é repetido três vezes neste vídeo.Toda vez que o polarizador é usado para verificar a localização do cristal. Como não é possível procurar o cristal no laço criogênico após a colheita, é recomendável examinar a fase mesa da qual o cristal foi retirado, para confirmar que ele já não está mais lá, o que indica que a colheita foi bem-sucedida. Na sequência seguinte, é mostrada a colheita a partir da fase esponja, mais fluida, assim como na fase cúbica, devendo-se colher o mínimo possível da fase esponja, para que ela não permaneça com o cristal.Quanto maior a quantidade no loop de criopreservação ao redor do cristal, mais difícil será localizar o cristal a olho nu. Para a coleta de dados de difração, quanto mais dispersão de fundo houver, maior será a contribuição durante a medição de difração. Na sequência seguinte, mostramos o processo de resfriamento criogênico, que deve ocorrer imediatamente.O cristal é colhido com o menor tempo possível transcorrendo entre o momento da colheita e o mergulho em nitrogênio líquido. Após mergulhar o suporte com o loop em nitrogênio líquido, ele é posicionado em um dos orifícios do puck de armazenamento na porta, neste caso na posição número um, e liberado da haste magnética. Neste momento, a localização e os detalhes dos cristais colhidos e resfriados criogenicamente devem ser registrados no caderno de anotações e/ou no computador.Quando o puck na gaveta de espuma estiver cheio ou quando você terminar a colheita do dia, transfira o puck para um suporte com prateleiras para puck em um recipiente J de armazenamento ou transporte preenchido com nitrogênio líquido. As duas próximas imagens mostram cristais resfriados com criogenia em alças criogênicas que foram colhidos. Seguindo o protocolo acima aqui descrito, os cristais podem ser vistos claramente dentro da fase meza no interior da alça.Neste caso, no entanto, o cristal não é visível e precisaria ser localizado por difração. O próximo passo no processo geral de determinação da estrutura utilizando cristalografia macromolecular é coletar dados de difração em cristais colhidos conforme demonstrado neste artigo. Isso geralmente é feito utilizando radiação síncrotron de raios X e é o foco de um artigo separado da jove nesta série.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Os protocolos descrevem os passos essenciais para a obtenção de cristais de difração de qualidade de uma proteína de membrana a partir de reconstituição da proteína em uma fase lipídica cúbicos (LCP), encontrando condições iniciais com os ensaios pré-cristalização LCP-FRAP, a criação de ensaios de cristalização LCP e cristais colheita .

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Bicelles são misturas de lipídios / anfifílico que mantêm as proteínas da membrana (MPs) dentro de uma bicamada lipídica, mas têm comportamento de fase única que facilita high-throughput screening por robôs de cristalização. Esta técnica, com sucesso, produziu uma série de alta resolução de estruturas de ambas as fontes procariotas e eucariotas. Este vídeo descreve os protocolos para gerar a mistura bicelle lipídico, incorporando MPs na mistura bicelle, a criação de cristalizações ensaios...

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Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Estudos estruturais de biomacromolecules por cristalografia requerem cristais de alta qualidade. Aqui demonstramos um protocolo que pode ser usado pelo OptiCrys (um instrumento totalmente automatizado desenvolvido em nosso laboratório) e/ou botões de microdiálise para o crescimento de grandes cristais de alta qualidade com base no conhecimento do diagrama de fase de cristalização.

Otimização do Crescimento de Cristal para Cristalização Macromolecular de Nêutrons

O objetivo deste artigo é dar ao espectador uma compreensão sólida de como transformar seu protocolo de difusão de vapor de pequeno volume, para o cultivo de grandes cristais de proteína única, em um método de microcristalização em lote de grande volume para cristalografia seriada.

Otimizando o Crescimento de Cristais de Endotiapsina para Experimentos de Cristalografia Seriada

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

O protocolo apresentado descreve uma abordagem direta para triagem de condições de cristalização de proteínas e crescimento de cristais usando uma placa de diálise de alto rendimento de 96 poços. O uso de tubos dialisadores para o crescimento em larga escala de microcristais também é demonstrado para aplicações de cristalografia seriada e MicroDE.

Cristalização de proteínas de alto rendimento via microdiálise

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Aprenda a colher e crioresfriar cristais de proteínas de membrana crescidas em fases lipídicas cúbicas e esponja para cristalografia de raios X. Este método preserva a integridade estrutural das amostras.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular (Vídeo) | JoVE Journal

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

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