Name: Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a gerar camundongos adultos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por complementação de embriões tetraploides. Este método valida a pluripotência completa das linhagens celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Apoio a KKB, MJB, JLH e KLN foi fornecido pelo California Institute for Regenerative Medicine, a Pew Charitable Trusts Scholars Program Biomédica, a Esther B. Família O&#39;Keeffe ea Fundação Família Shapiro. KKB é um E. Donald e Delia B. Baxter Fundação Faculdade Acadêmico.

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em Boland et al Nature.. 461, 91-96 (2009) 1. 1. Preparação de Lentivirus Este protocolo utiliza doxiciclina induzíveis por vectores vaivém lentivirais que codificam para Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc sob o controlo de um elemento de resposta de tetO. Os transgenes são activados pela tetraciclina reversa proteína trans-activação, rtTAM2.2 16, que induz a expressão do factor de reprogramação na presença de doxiciclina. Este sistema permite a expressão controlada rigidamente, elevada de factores de reprogramação. Os lentivirais usados ​​aqui são auto-inativadora e, portanto, não pode replicar integração genômica seguinte. No entanto, é necessária precaução quando se trabalha com lentivírus e deve ser realizado em conformidade com laboratórios BSL2 (EUA) e S2 (Europa) padrões. <ol><li> Descongele as células HEK293T e passagem pelo menos uma vez antes de transfection. As células devem ser mantidas a densidade confluentes em meio de HEK a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. Células de passagem rotineiramente a cada 2 dias, com uma razão de divisão de 1:06 - 01:10. </li><li> Semente ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 meio com 25 ml de HEK. Usar um T150 para cada preparação lentivirus. </li><li> No dia seguinte, transfectar células HEK293T por precipitação com fosfato de cálcio. (Nota: nas nossas mãos de precipitação com fosfato de cálcio resulta rotineiramente em eficiência de transfecção de 80-90%, no entanto, reagentes lipídicos catiónicos de transfecção, tais como Lipofectamina 2000 também pode ser utilizado). Preparar dois tubos cónicos de 15 ml para cada virus a ser preparada. Rotular os tubos &quot;A&quot; e &quot;B&quot;. Tubo A, 10 ug de cada um: os lentivirais shuttle vector codificando factores de reprogramação (ou rtTAM2.2), os vectores virais de empacotamento, e plasmídeo que codifica a proteína do envelope viral, VSVg. Adicionar 186 ul de 2 M de CaCl2 para tubo A, e levar o volume até 1,5 ml com H2O estéril. Tubo B: 1,5 ml de 2x HBS (pré-aquecido até à temperatura ambiente). </li><li> Pipetar a mistura no tubo A, até que uma solução homogénea. Adicione-se uma solução de solução B, gota a gota e deixar em repouso à temperatura ambiente durante 2-3 min. </li><li> Aspirar meio de crescimento de células HEK293T e substituir por 22 ml de meio de HEK pré-aquecido, sem penicilina e estreptomicina. </li><li> Pipeta combinado soluções AB (fosfato de cálcio precipitado) diretamente para HEK293T células e distribuir uniformemente pelo suave balanço. </li><li> 24 horas após a transfecção de células HEK-293T células com lentivírus, remover meio de crescimento e substituí-la com 25 ml de fresco, médio HEK pré-aquecido. Retornar HEKS transfectadas para a incubadora. </li><li> 48 h após a transfecção de células HEK-293T células com lentivírus, recolher o meio de crescimento contendo partículas lentivirais das HEKS transfectadas. Remover os restos em partículas a partir da solução viral colhidas por centrifugação a 3000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Concentrar vírus por ultracentrifugação through uma almofada de sacarose a 20% (2 ml sucrose/25 sobrenadante viral ml) durante 2 horas a 112.000 xg a 4 ° C. Suspender pellet viral em 0,4 ml MEF meio a 4 ° C durante 15-30 minutos com agitação suave. Armazenar as partículas virais em alíquotas de uso único (isto é, 50 ul) a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) para a reprogramação Nota: O protocolo apresentado aqui refere-se à derivação de iPSCs de E 13,5 fibroblastos de rato embrionárias para uso em ensaios de TEC. Enquanto outros grupos têm gerado todo-iPSC ratos de fontes de células adultas de doadores, nós não testei este método em outros tipos de células e não pode ter certeza de que tipo de célula doadora não é um fator. <ol><li> Configure acasalamentos rato cronometrados. No dia embrionário 13,5 (E13.5), eutanásia a mulher grávida e dissecar os embriões dos cornos uterinos. Lugar e embriões de loja em 1x PBS (pré-refrigerada a 4 ° C) em gelo. </li><li> Remover os tecidos extra-embrionário (iecórion, âmnio e placenta). Decapitar o embrião e remova a cauda (opcional - se necessário para genotipagem) e membros. Retire os órgãos internos, utilizando fórceps ou uma espátula colher em forma e pique o restante da carcaça com a lâmina de uma tesoura ou bisturi afiado. </li><li> Lava-se a carcaça de picada em 5 ml pré-refrigerada 1x PBS. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Suspender o pellet em 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C com agitação vigorosa durante 20-30 min. </li><li> Adicionar 5 ml de meio de MEF (pré-aquecido a 37 ° C), misturar e centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em pré-aquecido médio MEF. </li><li> Placa MEFs dissociado em 2-3 cavidades de uma placa de 6 poços pré-revestidas com gelatina a 0,1%. Isto é considerado uma passagem. </li><li> MEFs passagem a uma diluição de 1:04 - 01:05 hr cada 48. MEFs na passagem 3 está pronto para a transdução lentiviral. </li></ol> 3. Derivação das linhas iPSC <ol><li> Um dia antes de transdução lentiviral; semente ~ 3 x 10 5 MEFs primário para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestidas com gelatina a 0,1%. </li><li> Dia 1: Primário MEFs deve ser de 80-90% confluentes para a transdução lentiviral. Adicionar lentivirais partículas directamente para MEF media e incubar com MEFs a noite a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. </li><li> No dia seguinte (dia 2) aspirar o meio e lava-se duas vezes com 3 ml de 1x PBS para remover as partículas virais. </li><li> Adicionar 0,5 ml pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA para as células e incubar a 37 ° C durante 3-5 min com agitação ocasional. </li><li> Tritura-se para obter uma suspensão de célula única. Observar as células por microscopia de luz para garantir uma suspensão de célula única. </li><li> Transferência MEFs para um tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml de meio MEF. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante as células e ressuspender em meio levemente MEF. </li><li> Divididos igualmente a suspensão de células entre dois poços de uma p 6 bemfinal pré-revestidas com gelatina a 0,1%. </li><li> Agitar a placa para trás e para frente, de lado a lado, e uma vez com um movimento circular para alcançar uma distribuição uniforme de células ao longo do poço. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% de CO 2 num ambiente humidificado. </li><li> Dia 3: Repita os passos 4-9, excepto dividir as células uniformemente a partir de um poço de 3 poços de uma placa de 6 bem pré-revestidas com gelatina a 0,1%. O resultado será de 6 poços transduzidos fibroblastos primários. </li><li> Dia 4: Adicionar doxiciclina (dox), a uma concentração de 10 ug / ml a 5/6 poços. Um poço deve permanecer sem tratamento para servir de controlo. </li><li> Adicionar VPA, 1,9 mM para 3 dos 5 poços tratados com dox. VPA reduz a taxa de proliferação de MEFs. Culturas densas de MEFs tolerar a exposição prolongada ao VPA enquanto que as culturas tendem a subconfluência senesce dentro de 2-5 dias. Por conseguinte, deve ser MEFs confluente de 100% quando o VPA é adicionado. Nota: Usamos VPA nas nossas experiências de reprogramação, porque é um modificador epigenética conhecida, e tem sido shprópria para aumentar a eficiência da geração iPSC 17, embora os efeitos e os mecanismos de acção de VPA com respeito à geração de linhas iPSC totalmente pluripotentes não são conhecidos. </li><li> Dia 5: Aspirar o meio, lave e Tripsinizar as células como antes. Passagem das células tratadas com dox / VPA a uma placa de cultura de 15 centímetros 2 tecido pré-revestido com gelatina a 0,1% e cada uma das outras condições de pré-revestidas com 10 cm 2 em meio de pratos de células ES suplementadas com dox fresco e VPA. </li><li> Repor células a cada dia com ESC meio suplementado com dox fresco e VPA. ESC-como colónias devem começar a aparecer após ~ 7 dias no tratamento dox / VPA e ~ 10 dias após o tratamento em dox sozinho. Sem colónias devem aparecer na ausência de tratamento dox. </li><li> Uma vez que as colónias possuir uma refracção brilhante, borda bem definido e contém 30-50 células, manualmente isolar as colónias com uma ponta de pipeta de gel de carregamento e transferência para um fundo em U placa de 96 poços contendo 20 ul de 00,25% de tripsina-EDTA. Tripsinizar as células individuais e transferir para alimentadores de uma placa plana 96 poços de fundo em 150 ul de meio contendo ESC dox / VPA ou dox sozinho. </li><li> Continuar a expandir as linhas clonalmente isoladas iPSC nos alimentadores em meio ESC. Remover dox VPA e no dia 19, após a sua adição (pós-transdução no dia 23). Descarte linhas iPSC que não mantêm auto-renovação ou taxa de proliferação semelhantes aos controles ESC. </li></ol> Pode ser útil para caracterizar suas linhas iPSC em relação a CES antes de tentar executar TEC. Temos caracterizado nossas linhas por 1) expressão de marcadores de pluripotência endógenos (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) por imunocitoquímica, 2) a análise do cariótipo por contagem de cromossomos e 3) formação de corpo embryoid. Pode-se também realizar lentiviral específica de RT-qPCR para confirmar que os transgenes provirais não são expressos nos iPSCs. No entanto, identificamos iPSCs totalmente pluripotentes usando apenas morfologia imunomarcação, e karyotyping. Nas nossas experiências, a selecção das linhas de base iPSC ESC-como morfologia e características de crescimento resulta em que a maioria das linhas que expressam marcadores de pluripotência enquanto que tipicamente identificar várias linhas de cariótipo potencialmente anormais. 4. Preparação de iPSCs para injeção Blastocisto Número de passagens de uma linha de PSC tem sido demonstrado que afecta a sua pluripotencialidade 18, embora isto possa ser a linha 19 dependente. Temos usado iPSCs de passagens a partir de 8-14 para a produção de adultos de todos os iPSC ratos. <ol><li> IPSCs descongelamento e placa em alimentadores em meio ESC. Passagem das células pelo menos uma vez nos alimentadores antes da utilização de injeção. </li><li> Um poço de uma placa de 6 poços contendo 70-80% confluentes iPSCs irá fornecer mais do que um número suficiente de células para a injecção. Aspirar meio de crescimento e de lavar as células com ~ 3 ml de PBS 1x (sem + / ​​Mg 2 + Ca 2). </li><li> Adicionar 0,5 ml pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA paraas células e incubar a 37 ° C durante 10 minutos com agitação ocasional. </li><li> Tritura-se para obter uma suspensão de célula única. Observar as células por microscopia de luz para garantir uma suspensão de célula única. Os iPSCs precisam de estar em suspensão de célula única como colónias / agregados de células vão entupir a pipeta de injecção. </li><li> Uma vez que uma única suspensão celular obtida foi ben, adicionar 1,0 ml ESC meios para o bem e devolver a placa à incubadora a 37 ° C. Incubar durante ~ 15 min, ou até a maior parte dos alimentadores de ter começado a aderir. </li><li> Remover suavemente o meio contendo as iPSCs tendo cuidado para não deslocar os alimentadores fracamente aderentes. </li><li> Coloque as iPSCs num tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml de meio de ESC. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e remover o restante meio de células ES com uma micropipeta. Toque no tubo para retirar o sedimento de células e ressuspender em 0,2-0,5 suavemente meio FHM ml pré-arrefecida. Loja de células no gelo e até durante a injecção tetraplóide blastocysts. </li></ol> 5. Geração de blastocistos tetraploides Os procedimentos realizados nesta secção foram descritas em detalhe noutro local 5,6,20. Aqui destacamos a nossa técnica, otimizada para o celular Manipulator BTX Electro ECM 2001. <ol><li> Configure camundongos doadores de embrião por priming 23-28 dias de idade camundongos fêmeas (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) com TPM e HCG. Administrar 5 UI de PMS em 14:00 e 5 UI de HCG 47 horas mais tarde. Após a injeção de HCG, criado camundongos fêmeas com C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ acasaladas F1. Verifique o dia seguinte para plugues vaginais. </li><li> Euthanize conectado camundongos fêmeas e recolher ovidutos. Colete 1 de células de embriões oviductos colocando em FHM com hialuronidase e gentilmente rasgar a ampulae. Permitir que as massas cumulus de se sentar em FHM / Hialuronidase para 5-7 min. </li><li> Colete 1 de células de embriões utilizando uma pipeta de boca e lavar através de gotas de mídia FHM antes de colocá-los em KSOMCultura-AA. Cultura a 37 ° C, CO2 a 5% em óleo mineral durante a noite e seleccione 2 células de embriões no dia de electrofusão, eliminar todos os embriões outros. </li><li> Coloque um MICROSLIDE BTX em uma placa de 10 cm de Petri. Despeje espaço suficiente mídia eletrofusão temperatura para submergir a lâmina na solução, mas não tanto que os pólos do eletrodo são completamente submerso. </li><li> Ligue ECM 2001 e Enhancer BTX 400. Conectar cabos a ECM para o eléctrodo MICROSLIDE e fixar os cabos para o lado da placa de Petri para impedir o movimento não intencional do slide. </li><li> Executar um pulso manual para obter uma leitura sobre o potenciador BTX e observe a tensão das correntes AC / DC a ser aplicadas. Corrente AC irá controlar a velocidade a que os embriões se alinhar entre os eléctrodos, a corrente CC irá fundir os blastómeros, e tempo de pulso irá definir o comprimento do impulso de DC. Um bom ponto de partida é o AC 3V, CC 100V, e tempo de 0,05 ms. A DC óptima varia na gama de 90-150 volts. </li&gt; <li> Usando uma pipeta, tomar cerca de 30-40 duas células de embriões de KSOM-AA cultura e lavá-los através de algumas gotas de meio de eletrofusão. Desenhe mídia eletrofusão frescos do prato MICROSLIDE em pipeta e tomar embriões a partir da lavagem. Colocá-los no intervalo de 1 mm entre os eletrodos sobre a MICROSLIDE. Ter o cuidado de que estão alinhados no meio da fenda e que eles não estão em contacto uns com os outros. </li><li> Aplicar AC atual pressionando o botão de pulso manual. Os embriões rodará no campo AC, até que o plano de contacto blastômero é paralela aos eléctrodos. Se os embriões não estão alinhados em poucos segundos, aumente a configuração de CA. </li><li> Depois de ter alinhado embriões, pressione o botão de pulso manual novamente para aplicar o pulso DC. </li><li> Com meio eletrofusão na pipeta, recolher os embriões do MICROSLIDE. Lavar os embriões através de várias gotas de KSOM-AA e colocá-los em KSOM-AA cultura a 37 ° C CO, 5% 2. O blastômero fusão should ser completado em menos de 30 min em cultura. </li><li> Repita os passos 7-11 para permanecer duas células de embriões. Após os grupos de fusão subseqüentes, monitorar e selecionar embriões com blastômeros fundidos. Embriões fundidas com sucesso irão parecer ser de uma célula de fase. Descartar embriões lisadas e 2-célula após 30 min em cultura. Se a taxa de fusão é inferior a 80%, o aumento de tensão e / ou de tempo, em incrementos de 5 V e 0,01 mseg. Se a lise for superior a 20%, diminuir a tensão de CC e / ou de tempo em conformidade. Os melhores ajustes em nossos experimentos foram AC 4V, DC 146V, e 0,07 ms. Estas definições consistentemente produziu taxas de 90% ou mais elevadas de fusão com pouca ou nenhuma lise. </li><li> Continuar a cultura de embriões fundidos em microgotas de KSOM-AA em óleo mineral a 37 ° C, 5% CO 2. Deve esperar 85-95% de embriões fundidos para formar tetraplóides (4n) blastocistos após 48 h de incubação. </li></ol> 6. Microinjeção de iPSCs em blastocistos tetraploides Nós usamos uma Nikon TE-2000Umicroscópio invertido equipado com óptica de DIC e micromanipuladores Narishige para injecção de blastocistos. Cada blastocistos tetraplóides é injectado com 10-12 iPSCs utilizando um protocolo padrão para injecção ESC em blastocistos de ratinho que tem sido demonstrada em uma publicação anterior JoVE 5,20,21 <ol><li> Colocar uma gota de 20 ul de FHM no centro de uma lâmina de microscópio côncava e cobri-lo com 150 uL de óleo mineral. </li><li> Abaixe a pipeta holding e agulha microinjeção na gota FHM. 2-3 min para permitir que ambas as agulhas para encher parcialmente com FHM. </li><li> Lavar 20-30 blastocistos tetraplóides através gotas de FHM e transferência para a queda FHM na lâmina de microscópio. </li><li> Boca pipeta mistura iPSC na gota. Pode ser necessário diluir a mistura de células numa gota de FHM antecipadamente se as células são muito concentradas, ou agregados. </li><li> Pegue 100-200 células com a agulha de injeção. </li><li> Segurar o blastocisto com a massa celular interna no posit horas 9íon. Injectar células em blastocélica penetrando a zona pelúcida e trofoblasto na posição de 3 horas. Injectar 16-18 células por blastocisto. </li><li> Retornar iPSC blastocistos complementadas para KSOM-AA cultura. </li></ol> 7. Transferência de complementada Blastocistos tetraploides nos cornos uterinos de camundongos destinatário Complementadas blastocistos tetraplóides são cirurgicamente transferidos para os cornos uterinos de camundongos fêmeas receptoras de acordo com as diretrizes do instituto do pesquisador, utilizando a técnica padrão de 20 que vamos resumir. Selecione femininos ratinhos CD-1 na fase pró-estro e configurá-los para o acasalamento com machos vasectomizados. Verifique para plugues vaginais na manhã seguinte. As fêmeas estão prontas para a transferência de embriões uterinos, dois dias após o bujão foi detectada (2,5 dpc). Um dia antes de fêmeas receptoras são acasaladas com machos vasectomizados, configurar adicionais CD-1 fêmeas com machos vasectomizados nãopara ser usado como mães adotivas para todo-iPSC ratos recuperados por cesariana. 8. Cesariana e Fomento da iPSC derivados Pups A transferência de embriões TC normalmente resulta em múltiplas reabsorções após o implante, mesmo se o iPSC ou ESC linha tem um alto potencial de desenvolvimento. Como resultado, pode-se esperar que não mais de 4 crias viáveis ​​(geralmente 1-2) por recipiente. Estas ninhadas pequenas são normalmente negligenciados pelos destinatários. Para aumentar o nível de cuidado neonatal ea taxa de sobrevivência, nós realizar cesarianas e fomento de acordo com os protocolos padrão de 20. Para realizar a cesariana, eutanásia ratos receptores 16 dias após a transferência de embriões em 7 20:00 (destinatário 18,5 dpc) e dissecar os filhotes dos cornos uterinos. Promover filhotes viáveis ​​para um CD-mães que ninhadas entregues no mesmo dia.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
<li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li>
<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Camundongos de geração de linhas iPSC usando ensaios TEC fornece um teste rigoroso funcional para a pluripotência de uma linha de IPSC. Este teste pode ser útil para avaliar a eficácia relativa dos diferentes métodos de reprogramação ou para identificar linhas iPSC que podem ser mais úteis para a geração de certos tipos celulares in vitro. Gerados a partir de ratinhos iPSCs pode ser usado para testar rigorosamente a estabilidade a longo prazo e de tumorigenicidade iPSC derivados de tecidos. Este protocolo irá ser útil para investigadores que desejam gerar totalmente pluripotentes linhas iPSC ou ratinhos iPSC ou para comparar a utilidade relativa dos diferentes métodos de reprogramação. Os mecanismos que controlam a geração e identificação de iPSCs totalmente pluripotentes permanecem pouco compreendidos e é possível que algumas linhas iPSC produzida usando este método não vai passar no teste de TEC. Muitos fatores podem variar entre ensaios, incluindo fundos genéticos, título lentiviral, padrões de i lentiviralnsertion, os parâmetros do ciclo celular da população de dadores, inter-laboratoriais diferenças nas várias etapas do procedimento de TEC e inclinações variáveis ​​de iPSCs abrigar aberrações genéticas ou epigenético. Para melhor garantir o sucesso, ter o cuidado de estabelecer níveis apropriados de expressão do gene lentiviral em experiências de derivação iPSC testando diluições virais de controlo MEFs para garantir que cada vírus seja suficientemente concentrada para produzir a expressão do gene detectável pelo menos 80% e, de preferência 100% do MEFs. Isso nos permite identificar linhas com várias cópias de lentivírus diferentes, limitando a toxicidade para o MEFs e produzindo colônias sem superlotação dos poços. Deve notar-se que vários outros protocolos têm sido mostrados para produzir iPSCs com potencial de desenvolvimento total, utilizando diversos métodos e fontes de células doadoras, sugerindo que múltiplos caminhos para pluripotência completo pode existir 1,8-13,15. Actualmente, iPSC no entanto, nenhum biomarcador definitiva totalmente pluripotentefoi identificado e, portanto, o ensaio do TCE é o teste padrão ouro de saber se uma linha de iPSC pode gerar todas as linhagens de células de um organismo.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>SFB qualificado para células ES</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina 0,1%</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Meio 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF murino)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Valpróico</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; gratuito</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina sérica de égua prenhe, para superovulação, liofilizada, 2.000 UI</td><td>Instituto de Pesquisa Harbor-UCLA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Meio FHM com hialuronidase</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>meio KSOM-1/2 AA</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>MHA</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Água, para transferência de embrião, embrião testado</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral, testado em embriões</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina (BSA), testada em embriões</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionários de camundongo, não irradiados</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;&lt;forte&gt;Meios e tampões utilizados neste protocolo&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;Meio de crescimento para HEK293T. 90% DMEM, 10% SBF, 100 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina. Exclua penicilina e estreptomicina do meio para HEK utilizado no dia da transfeção. O meio para HEK pode ser armazenado a 4 &amp;deg;C por até 1 mês.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM Dextrose. Ajustar o pH para 7,1 ± 0,1. O pH é crítico! Filtrar esterilmente e armazenar a 4 °C. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;Meio de crescimento para fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) (também utilizado com células alimentadoras). 70% DMEM, 20% Meio 199, 10% SBF, 100 U/ml de penicilina e 10 mg/ml de estreptomicina. Armazenar a 4 &amp;deg;C por até 1 mês.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;Meio de crescimento para ESC. 85% DMEM, 15% FBS qualificado para células ES, Glutamax 1x, 0,1 mM aminoácidos não essenciais, 0,1 mM &amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol, 1.000 U/ml de ESGRO, 100 U/ml de penicilina e 10 mg/ml de estreptomicina. O meio para ESC pode ser armazenado a 4 &amp;deg;C por até três semanas.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt;Meio de eletrofusão. 0,3 M Manitol, 0,1 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;e 3% de BSA em água testada para embriões. Armazenar a 4 &amp;deg;C por até 3 meses.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

A produção de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células somáticas, proporciona um meio para criar ferramentas valiosas para a investigação básica e também pode produzir uma fonte de células-paciente combinados para terapias regenerativas. iPSCs pode ser gerada utilizando vários protocolos e derivado de fontes de células múltiplas. Uma vez gerados, iPSCs são testados usando uma variedade de ensaios, incluindo os marcadores de imunocoloração para pluripotência, geração de três camadas germinais em corpos embrióides e teratomas, comparações de expressão de genes em células estaminais embrionárias (ESC) e na produção de ratinhos quiméricos, com ou sem contribuição da linha germinativa 2 . É importante notar que as linhas iPSC que passam estes testes ainda variam na sua capacidade para produzir diferentes tipos de células diferenciadas 2. Isso tornou difícil estabelecer quais protocolos de derivação IPSC, fontes de células doadoras ou métodos de selecção são mais úteis para diferentes aplicações. O teste mais rigorosose uma linha de células-tronco tem o potencial de desenvolvimento suficiente para gerar todos os tecidos necessários para a sobrevivência de um organismo (denominado pluripotência cheio) é a complementação de embriões tetraplóides (TEC) 3-5. Tecnicamente, TEC envolve electrofusão de duas células de embriões para gerar tetraplóides (4n) uma célula de embriões que podem ser cultivados in vitro para a fase de blastocisto 6. Diplóides (2n), as células estaminais pluripotentes (por exemplo, ESCs ou iPSCs) são então injectado na cavidade do blastocele blastocistos tetraplóides e transferido para uma fêmea receptora de gestação (ver Figura 1). O componente do embrião tetraplóide complementado contribui quase exclusivamente aos tecidos extra-embrionário (placenta, saco vitelino), enquanto que as células diplóides constituem o embrião propriamente dito, o que resulta em um feto derivado totalmente a partir da linha de células estaminais injetadas. Recentemente, relatou a derivação de linhas de iPSC que reproduzível gerar ratos adultosatravés de uma TEC. Estas linhas iPSC dar origem a filhotes viáveis ​​com eficiências de 5-13%, que é comparável com os CES 3,4,7 e maior do que o relatado para a maioria das outras linhas iPSC 8-12. Estes relatórios mostram que a reprogramação direta pode produzir iPSCs totalmente pluripotentes que correspondem CES no seu potencial de desenvolvimento e eficiência de gerar filhotes em testes TEC. No momento, não está claro o que distingue entre iPSCs totalmente pluripotentes e linhas menos potentes 13-15. Também não é claro que os métodos de reprogramação irá produzir essas linhas com a maior eficiência. Aqui nós descrevemos um método que produz iPSCs totalmente pluripotentes e &quot;todo-iPSC&quot; ratos, que podem ser úteis para pesquisadores que desejam comparar a pluripotência das linhas iPSC ou estabelecer a equivalência de diferentes métodos de reprogramação.

Na etapa 3, "Derivação de iPSCs a partir de MEFs", deve-se observar heterogeneidade morfológica e formação de colônias de iPSCs imaturas a partir de 4-5 dias após a adição de doxiciclina/VPA, e colônias maduras entre 7-10 dias (Figura 2). A produção de embriões tetraploides de uma célula na etapa 5 é altamente eficiente (Figura 3). Rotineiramente observamos até 95% dos embriões de duas células tratados se fundirem com sucesso, produzindo embriões tetraploides de uma célula. O protocolo seguido para injetar iPSCs em blastocistos tetraploides (Etapa 6, Figura 4) é semelhante ao protocolo para injeção de ESCs em blastocistos diplóides para gerar camundongos quiméricos, e pode ser realizado por um microinjectionista experiente. O número de filhotes nascidos vivos depende da linhagem celular (Tabela 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">0,01-0,03% de eficiência na pré-programação de MEF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">eficiência da produção de iPSCs murinas por TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Nome</td>
			<td>Descrição</td>
			<td>Blastocistos injetados</td>
			<td>Nascidos vivos</td>
			<td>Adultos vivos</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6,1%)</td>
			<td>19 (2,2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3,6%)</td>
			<td>4 (2,1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1 (0,3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Resultados representativos.
<img alt="Diagrama de complementação de blastocisto tetraploide; criação de camundongos iPSC a partir de embriões diplóides, E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Esquema do desenho experimental. Parte superior esquerda: produção de blastocistos tetraploides. Embriões fertilizados de dois células de camundongos albinos são eletrofusados para gerar embriões tetraploides de uma célula, que são cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Parte inferior esquerda: reprogramação. Fibroblastos embrionários de camundongos são transduzidos com partículas lentivirais que codificam Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc e a proteína transativadora reversa de tetraciclina, rtTAM2.2. A adição de doxiciclina resulta na expressão do transgene e na iniciação da reprogramação para iPSCs. Direita: produção de camundongos iPSC. iPSCs derivadas de camundongos pigmentados são injetadas no blastocele de blastocistos tetraploides e, em seguida, implantadas cirurgicamente em camundongos receptores pseudo-grávidos. Os camundongos iPSC recém-nascidos são retirados por cesariana e criados por mães adotivas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Processo de reprogramação celular; imagens de microscopia; transformação de MEFs em iPSCs com ampliação de 10x e 20x." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Alterações morfológicas associadas à reprogramação. Da esquerda para a direita: exemplos da progressão morfológica de fibroblastos para colônias de iPSCs durante o curso de um experimento de reprogramação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Estágios do desenvolvimento embrionário: 2 células (2n), fusão de blastômeros, 1 célula (4n); imagens de microscopia." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Produção de embriões tetraploides. Embriões diploides de duas células são submetidos a um pulso elétrico, resultando na fusão de blastômeros e na geração de embriões unicelulares tetraploides.
<img alt="Injeção de iPSCs em blastocisto, resultando em filhote de camundongo iPSC e camundongo com três semanas; resultados do estudo celular." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Produção de camundongos iPSC. Esquerda: iPSCs são injetadas no blastocele de um blastocisto tetraploide. Centro: filhotes de camundongo iPSC são identificados pelos olhos pigmentados. Direita: camundongo iPSC com três semanas após o nascimento.

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência completa<sup&gt; 1</sup&gt;.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

A produção de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células somáticas fornece um meio de criar ferramentas valiosas para a pesquisa básica e também pode...

O objetivo geral deste procedimento é gerar camundongos adultos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, ou iPSCs, por complementação de embriões tetraploides. Isso é realizado primeiramente obtendo iPSCs de fibroblastos embrionários de camundongo utilizando lentivírus que carregam OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc e suplementando o meio com ácido valpróico ou VPA.Uma vez que as CIPs são geradas, elas são caracterizadas por imunomarcação, contagem cromossômica e formação de corpos embrioides. O próximo passo é gerar um blastocisto auxiliar tetraploide receptor por meio de fusão e cultura in vitro. Posteriormente, as CIPSc são injetadas no blastocisto auxiliar tetraploide e os blastocistos complementados são transplantados para fêmeas receptoras para gestação.No passo final, animais a termo completo são entregues por cesariana a mães substitutas. Assim, o desenvolvimento pós-natal pode ser monitorado. Em última análise, se forem gerados animais viáveis a termo completo.A linhagem celular IPSC é considerada totalmente pluripotente. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos de geração de IPSCs é que o nosso método gera de forma reprodutível linhagens celulares IPS totalmente pluripotentes. Linhagens celulares IPS geradas por esses métodos podem ser úteis para outros pesquisadores que desejem comparar a pluripotência de suas células IPS ou estabelecer a equivalência de outros métodos de reprogramação. Esses métodos serão úteis para pesquisadores que desejem gerar linhagens celulares IPS totalmente pluripotentes para aplicações específicas downstream, como ensaios de diferenciação in vitro.Além disso, a geração de todos os camundongos IPSC. O uso da complementação telomérica pode servir como um meio útil para determinar a estabilidade genética e epigenética de diversas linhagens celulares. As micro-manipulações envolvidas na complementação de embriões tetraploides são tecnicamente desafiadoras.Pode levar vários meses para alguém se tornar proficiente nas técnicas desenvolvidas pelo IPSC, que requerem condições de cultura semelhantes às utilizadas em experimentos tradicionais de direcionamento gênico em ESL. Vinte e quatro horas após a transfeção de células HEC 2 9 3 T com lentivírus, remova o meio de crescimento e substitua-o por 25 mililitros de meio pré-aquecido fresco.Retorne o meio ao incubador por 24 horas. Após 48 horas da transfeção de células HEC 293T com lentivírus, colete o meio de crescimento contendo partículas lentivirais das células transfectadas. Remova os detritos particulados do meio contendo o vírus por centrifugação a 3000 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, concentre o vírus por ultracentrifugação através de um coxim de sacarose a 20% por duas horas a 112.000 Gs a quatro graus Celsius.Decante cuidadosamente para um recipiente de resíduos para descontaminação, sem perturbar o pellet viral. Re-suspenda o pellet viral em 0,4 mililitros de meio para fibroblastos embrionários de camundongo e feche o tubo. Em seguida, agite suavemente a 4 graus Celsius por 15 a 30 minutos.Armazene partículas virais e alíquotas de uso único a menos 80 graus Celsius. Linhagens de IPSC são derivadas de fibroblastos embrionários de camundongo ou células meth. Quando as colônias de IPSC apresentam uma borda bem definida, brilhante e refrativa e contêm de 30 a 50 células, estão prontas para serem selecionadas manualmente e expandidas como linhagens independentes de IPSC.Retire colônias isoladas com uma ponteira de pipeta para eletroforese e transfira cada colônia diretamente para uma única cavidade de uma placa de 96 poços com fundo em U contendo 20 microlitros de tripsina EDTA a 0,25%. Incube as colônias retiradas e a tripsina por cerca de oito minutos a 37 graus Celsius ou até que as colônias se dissociem em células isoladas. Monitore o progresso da dissociação por microscopia de luz. Pode ser necessário agitar suavemente.Transfira a suspensão celular dissociada para uma placa de 96 poços contendo uma camada de alimentação e 150 microlitros de meio ESC suplementado com doxiciclina e VPA. Quando as colônias de iPSC reaparecerem em cada poço, divida-as em poços maiores para análise e armazenamento celular, utilizando procedimentos padrão de derivação de ESC e cultivo celular para iniciar o procedimento de geração de embriões auxiliares em estágio de blastocisto tetraploide. Embriões de um único célula coletados de camundongos fêmeas são cultivados até o estágio de embriões de duas células durante a noite em KSOM a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, no dia seguinte. Coloque uma lâmina micro BTX em uma placa de Petri de 10 centímetros.Despeje uma quantidade suficiente de meio de eletrofusão em temperatura ambiente para submergir a lâmina na solução, mas não em excesso a ponto de os polos do eletrodo ficarem completamente submersos. Ligue o manipulador de células eletrofusão BTX ECM 2001 e o amplificador BTX 400. Conecte os cabos do ECM aos eletrodos da micro-lâmina e fixe os cabos ao lado da placa de Petri para evitar movimentos indesejados da lâmina.Execute um pulso manual para obter uma leitura no amplificador BTX e anote a tensão das correntes contínuas (DC) aplicadas. A corrente alternada (AC) controlará a velocidade com que os embriões se alinham entre os eletrodos. A corrente contín游戏副本Um bom ponto de partida é CA três volts CC 100 volts e vezes 0,05 milissegundos. A CC ideal varia na faixa de 90 a 150 volts. Usando uma pipeta bucal.Retire 30 a 42 embriões da cultura KSOM e transfira-os para uma gota de meio de eletrofusão. Lave passando por várias gotas de meio de eletrofusão. Em seguida, aspire meio de eletrofusão fresco do recipiente de microscopia para a pipeta bucal.Retire os embriões lavados e coloque-os na lacuna de um milímetro entre os eletrodos na lâmina microscópica. Tenha cuidado para que os embriões estejam alinhados ao centro da lacuna e não estejam em contato uns com os outros. Aplique corrente alternada pressionando o botão de início manual.Os embriões irão girar no campo CA até que o plano de contato blastular esteja paralelo aos eletrodos. Se os embriões não se alinharem em alguns segundos, aumente a configuração de CA. Após o alinhamento dos embriões, pressione novamente o botão de início manual para aplicar o pulso de CC com o meio de eletrofusão na pipeta.Colete os embriões da lâmina de microscopia, lave os embriões através de várias gotas de meio KSOM e, em seguida, cultive os embriões em KSOM sob óleo mineral a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A fusão dos blastômeros deve ser concluída em menos de 30 minutos. Durante o cultivo, monitore e selecione embriões com blastômeros fusionados com sucesso.Os embriões fundidos aparecerão em estágio de uma célula; descarte os embriões lisados e os embriões de duas células após 30 minutos de cultivo. Continue o cultivo dos embriões fundidos em microgotas de KSOM sob óleo mineral a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, para preparar os IPCs para injeção na blástula. Descongele previamente os IPCs armazenados e plaque-os sobre células alimentadoras em meio para células-tronco embrionárias (ESC). Passe as células pelo menos uma vez sobre as células alimentadoras após o descongelamento e antes do uso para injeção.Uma cavidade de uma placa de seis poços contendo IPCs com 70 a 80% de confluência fornecerá mais do que o número suficiente de células para injeção. Aspire o meio de crescimento e lave as células com três mililitros de PBS sem cálcio ou magnésio. Adicione 0,5 mililitros de tripsina-EDTA 0,05% pré-aquecida às células e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos, agitando ocasionalmente. Adicione então 3,0 mililitros de meio ESC e pipete para obter uma suspensão de células únicas. Observe as células por microscopia de luz para garantir uma suspensão de células individuais, pois colônias ou agregados celulares podem entupir a pipeta de injeção. Uma vez obtida a suspensão de células únicas, adicione um mililitro de meio ESC ao poço e retorne a placa ao incubador a 37 graus Celsius.Incubar por cerca de 15 minutos ou até que a maioria das células alimentadoras tenha começado a aderir; em seguida, remover cuidadosamente o meio contendo as CIPs, tomando cuidado para não deslocar as células alimentadoras aderidas semanais. Colocar as CIPs em um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio para CCE e centrifugar a 200 Gs por cinco minutos.Aspire o sobrenadante e remova o restante do meio ESC com uma pipeta micrométrica. Bata suavemente no tubo para desprender o pellet e resuspenda cuidadosamente as células em 0,2 a 0,5 mililitros de meio FHM previamente resfriado. Mantenha as células no gelo até o momento da injeção e durante a injeção em blastocistos tetraploides. Para o protocolo de injeção em blastocistos, consulte o artigo que acompanha este manuscrito e um artigo previamente publicado, do qual está sendo exibido um trecho na tela aqui.Exemplos da progressão morfológica de fibroblastos a colônias de IPSC durante o curso de um experimento de reprogramação são mostrados nestas imagens. Deve-se observar a heterogeneidade morfológica e a formação de colônias de IPSC parcialmente reprogramadas a partir de quatro a cinco dias após a adição de doxiciclina e VPA, conforme mostrado nos painéis B a EESC. Colônias semelhantes a IPSC devem aparecer entre sete e 10 dias, conforme mostrado no painel F. A produção de embriões de telo com uma célula por fusão eletroquímica de embriões diplóides com duas células é altamente eficiente.É rotina observar até 95% dos embriões tratados com duas células corretamente fundidos, produzindo embriões tetraplóides de uma única célula. O protocolo utilizado neste experimento para injetar IPSCs em blastocistos tetraplóides é semelhante ao protocolo para injeção de ES em blastocistos diplóides, com o objetivo de gerar camundongos quiméricos. Para descartar facilmente a geração de quimeras diplóides, a pigmentação das linhagens de camundongos utilizadas para gerar as IPSCs e os embriões tetraplóides é cuidadosamente escolhida, sempre que possível. Neste exemplo, os embriões tetraplóides são produzidos a partir de uma linhagem albina e as IPSCs são geradas a partir de uma linhagem pigmentada.Assim, camundongos IPSC recém-nascidos exibem olhos pigmentados e uma cor de pelagem uniformemente pigmentada na idade adulta, enquanto os diplóides kyras exibiriam coloração mista albina e pigmentada. O número de filhotes nascidos vivos depende da linhagem celular, conforme mostrado nesta tabela. Para uma linhagem IPSC média e boa, os pesquisadores devem esperar entre 1% e 10% dos blastocistos injetados resultando em filhotes nascidos vivos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como derivar células IPS totalmente pluripotentes e também de como validar seu potencial de desenvolvimento. Utilizando o ensaio de complementação tetraploide, uma vez dominada esta técnica, desde a derivação de MES até camundongos recém-nascidos a partir de IPSCs, o processo pode ser concluído em dois a três meses. O desenvolvimento e a manutenção de IPSCs exigem um alto nível de técnica em cultura celular.Experiência prévia com a cultura de ESL é essencial. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus, especialmente lentivírus concentrado, pode ser extremamente perigoso. Deve-se sempre usar os equipamentos de proteção individual exigidos pela sua instituição e certificar-se de tratar tudo o que entrou em contato com o vírus com água sanitária a 10% por pelo menos 20 minutos, seguindo este procedimento.Todos os camundongos IPSC e seus tecidos podem ser analisados quanto a fenótipos fisiológicos, patológicos e comportamentais.

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Este protocolo descreve o procedimento detalhado para a criopreservação de células iPS humanas no meio de criopreservação KnockOut SR e recuperação destas células em completa KnockOut Feeder SR Free (KSR-FF) médio ou alimentação baseada em médias KnockOut SR.

Criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando KnockOut Completa Feeder livre de substituição de soro Médio

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.

Geração e Manutenção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Primatas Derivadas da Urina

Aprenda a gerar camundongos adultos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por complementação de embriões tetraploides. Este método valida a pluripotência completa das linhagens celulares.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Explorar mais vídeos