Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

O objetivo geral deste procedimento é estudar a mastite ou inflamação da glândula mamária e, mais especificamente, visualizar e quantificar a atividade do NF Kary dentro de uma glândula lactante inflamada. Isso é feito cruzando primeiro uma fêmea transgênica NF Kappa b repórter com um macho do tipo selvagem. Oito dias após o nascimento dos filhotes, o lipopolissacarídeo é introduzido na glândula lactante da fêmea por meio de uma técnica de injeção introdutória, que não danifica todas as feridas no local da injeção seis horas após a injeção.

O camundongo passa por imagens bioluminescentes para detectar a atividade da luciferase na glândula mamária. Em última análise, os resultados podem mostrar atividade significativa de NF KB nas glândulas tratadas com LPS através do uso do método de injeção intraductal, seguido de imagens bioluminescentes. A principal vantagem de nossa abordagem sobre outros métodos de injeção intraductal é que o local da injeção não é danificado de forma alguma.

Isso é absolutamente crítico se você planeja estudar a inflamação associada à injeção de LPS, pois qualquer dano ao local ou ao mamilo se sobreporia e confundiria essas análises. Camundongos fêmeas positivos para o transgene NGL Reporter são usados para este procedimento. Um. As fêmeas têm pelo menos seis semanas de idade.

Acasalá-los com um macho do tipo selvagem FVB por har e reproduzindo 15 dias após o acasalamento. Comece a verificar as fêmeas regularmente em busca de sinais de gravidez, ou seja, grande circunferência saliente. Separe as fêmeas grávidas em suas próprias gaiolas e, quando a última fêmea engravidar, remova o macho da gaiola de reprodução.

Uma ninhada de pelo menos seis filhotes é necessária para uma lactação adequada. Oito dias após o nascimento de tal ninhada. Prossiga com o protocolo.

A parte mais desafiadora do procedimento é a própria injeção introdutória. Ter mãos firmes e muita prática ajudará, mas armadilhas sempre podem ocorrer. Esteja preparado para ter vários camundongos prontos no dia da injeção para garantir o sucesso.

Comece diluindo o lipopolissacarídeo derivado de e coli em PBS até uma concentração final de 0,1 microgramas por microlitro. 50 microlitros desta solução de LPS serão injetados na glândula mamária. Prepare um segundo tubo de PBS sozinho para ser usado para injeção de controle.

Ao lado do estágio do escopo de dissecação. Prenda um aparelho de cone nasal para administrar a anestesia. Prepare uma iluminação brilhante do palco usando holofotes extras, conforme necessário.

Quando a configuração da dissecção estiver pronta, inicie a máquina de flúor isof e o fluxo de ar. Em seguida, carregue a seringa de insulina de calibre 31 com 50 microlitros da solução LPS e reserve a seringa para injeções práticas. Use o corante azul triam diluído em PBS para visualizar os resultados.

Em seguida, anestesie o mouse a ser injetado assim que sua respiração diminuir. Coloque-o no palco e forneça flúor iso através do cone do nariz. Use um para beliscar para confirmar o totalmente anestesiado durante todo o procedimento.

Monitore o padrão de respiração do mouse. Ajuste continuamente o isof de flúor para mantê-lo estável. Use uma pequena gota de etanol 70% para achatar o cabelo no abdômen ventral do animal e localizar os mamilos.

Localize o mamilo da glândula mamária inguinal número quatro direita na parte inferior do abdômen com uma pinça fina na mão não dominante. Retire cuidadosamente o mamilo da pele. A pinça nunca deve ser apertada com força.

Apenas uma leve fixação deve ser aplicada ao mamilo da mão dominante. Coloque a seringa pré-carregada no campo de visão e segure-a de forma que não seja necessário reposicionar para injetar seu conteúdo. Aponte cuidadosamente a agulha para a pequena abertura dúctil no centro do mamilo.

Insira aproximadamente um quarto da agulha no duto sem reposicionar. Injete o conteúdo da seringa durante três a cinco segundos. Em seguida, remova cuidadosamente a agulha do mamilo.

Carregue uma segunda seringa com 50 microliberações de PBS e repita o procedimento à esquerda. Número quatro, mamilo da glândula mamária inguinal usando o controle PBS. Assim que ambas as injeções forem concluídas, interrompa a anestesia e mova o mouse para uma gaiola de recuperação.

A fêmea deve estar se movendo em cinco minutos. Depois de uma hora, devolva-a a uma gaiola doméstica com suas baforadas. O camundongo deve ser fotografado por seis horas de injeção.

Durante esse ínterim, monitore o mouse se forem observados sinais de angústia. Interrompa o experimento e eutanasiar os camundongos na instalação de imagem. Prepare-se para anestesiar a fêmea usando flúor.

Certifique-se de que a anestesia esteja fluindo para a caixa e para a câmara de imagem. Coloque o mouse sob anestesia com flúor na caixa de anestesia transparente. Depois que a respiração diminuir, use um para beliscar para confirmar se o mouse está totalmente anestesiado.

Em seguida, retroorbital, injete 100 microlitros de substrato de Lúcifer através de uma agulha de calibre 26. Transfira imediatamente o mouse para a câmara de imagem após a injeção e conecte o cone do nariz que fornece Isof Lorraine. Coloque o mouse em decúbito dorsal e prenda cada pé ao palco com fita preta opaca.

Insira as configurações apropriadas no software IVIS para obter uma imagem fotográfica de luz branca e uma imagem da atividade bioluminescente. O tempo de exposição deve ser de 10 segundos após a aquisição das imagens. Siga o mesmo protocolo de recuperação descrito para pós-injeção.

As imagens fotográficas e luminescentes são automaticamente sobrepostas e exibidas na tela. Analise as imagens adquiridas colocando círculos de região de interesse ou ROI de tamanho igual em cada lado da parte inferior do abdômen do camundongo. Um sobre a glândula injetada PBS e outro sobre a glândula injetada LPS.

Defina a leitura para fótons. Um número deve ser exibido indicando a luminescência detectada em cada ROI, use esse número na análise estatística para exibir a imagem ideal. Ajuste ainda mais o limite do sinal exibido.

Isso não alterará a leitura total da luminescência, mas permitirá a remoção do sinal de fundo quando a glândula injetada PBS estiver livre do sinal de fundo. O aumento do sinal na glândula tratada com LPS deve ser aparente na prática de imagem As injeções foram realizadas no dia 21 da lactação, quando há menos produção de leite e o sucesso de uma injeção pode ser facilmente visualizado por trian blue Coloração em glândulas de memória injetadas com sucesso, apenas a árvore ductal foi preenchida com solução em uma injeção malsucedida. Houve acúmulo de líquido no mamilo ou tecido circundante.

A injeção bem-sucedida de LPS nos ductos mamários no oitavo dia resultou em aumento da atividade de NF KB dentro da glândula devido à atividade constitutiva de NF KB no cérebro e em outros órgãos abdominais. Houve um sinal de linha de base consistente antes de qualquer manipulação. A atividade da luciferase foi substancialmente maior na glândula injetada com LPS do que na glândula injetada com PBS de um grupo de quatro camundongos.

Um aumento estatisticamente significativo na luminescência dentro das glândulas tratadas com LPS foi medido. Este método pode fornecer informações sobre a inflamação da glândula mamária. Também pode ser aplicado a outras áreas de pesquisa, como a pesquisa do câncer.

Você pode injetar células cancerígenas ou cancerígenas diretamente no ducto mamário.