Name: Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intraductal de LPS para modelar mastite em camundongos lactantes usando repórter transgênico NF-κB. Este método permite visualizar e quantificar a atividade inflamatória por imagem bioluminescente.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão CA113734 concedido a F Yull e do Departamento de Assuntos de Veteranos (TS Blackwell).

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care Vanderbilt University Institucional e Comitê de uso. 1. Preparando Ratos transgênicos <ol><li> Ratinhos fêmea, positivo para o (N-kB F-G-L uciferase FP) repórter NGL transgene (descrito anteriormente 1) são utilizadas para este procedimento. Quando as fêmeas são pelo menos 6 semanas de idade, eles acasalar com um macho tipo FVB selvagem. Harem criação podem ser utilizadas (até 4 fêmeas em uma gaiola com um macho). (Nota: ratos da estirpe FVB foram utilizados para o estudo ratos mais escuras, tais como da estirpe C57BL6 podem também ser usados, mas estes ratos deve ser raspada antes da imagiologia.). </li><li> A partir de 15 dias pós-acasalamento, as fêmeas verificar regularmente para detectar sinais de gravidez (girth salientes grande). Cada fêmea deve ser separada uma vez grávida eo homem retirado da gaiola de criação uma vez que a última fêmea fica grávida. </li><li> Assista as fêmeas separados umd anotar a data de nascimento, quando aparece uma maca. A ninhada de pelo menos 6 crias é necessária para a lactação adequada. Oito dias após o nascimento da ninhada, prosseguir com o protocolo (ver Figura 1 para um esquema timeline). </li></ol> 2. Preparação para Injeção <ol><li> Dissolve-se o E. LPS de E. coli em PBS para uma concentração final de 0,1 ug / uL. 50 ul desta solução, ou um total de 5 ug, irá ser injectado na glândula mamária. Preparar um segundo tubo de PBS por si só deve ser usado para a injecção de controlo. </li><li> Definir-se um escopo de dissecação e de anestesia isoflurano. Um aparelho de nariz-cone deve ser fixado à fase do escopo de dissecação em que o rato será colocado. Uma boa fonte de luz, seja do âmbito próprio ou de holofotes extras também deve estar preparado. </li><li> Uma vez que o set-up é completa, iniciar a máquina isoflurano e fluxo de ar. </li></ol> 3. Injeção intraductal de LPS <ol><li> Carregar a seringa agulha curta com 50 ul da solução de LPS. Defina este lado. </li><li> Anestesiar o mouse para ser injetado pela primeira colocação do sexo feminino em uma caixa cheia de isoflurano e, depois, a respiração é lenta, ela passar para o palco e colocar o nariz dentro do nariz cone. Use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Monitorizar a respiração do rato ao longo do processo e ajustar o nível de isoflurano em conformidade. A gaiola contendo a ninhada de filhotes que a fêmea tem sido tomadas a partir deve ser cuidadosamente retiradas até que a barragem pode ser devolvido após o procedimento. </li><li> Use uma pequena gota de etanol de 70% para fazer o casaco e colocar o plano para ajudar a visualizar o mamilo ligados à direita # 4 glândula mamária inguinal no abdômen inferior do mouse. </li><li> Concentre-se no âmbito de dissecação para uma visão ideal do mamilo. Com cuidado, use um conjunto de pinça fina para continuar a desenhar o mamilo longe da pele, mas não punção ou ferir o mamilo de forma alguma. Ofórceps nunca devem ser apertados em conjunto, quando da manipulação do tecido, mas utilizado com um porão de luz que requer uma quantidade mínima de tensão na mamilo. </li><li> Use a pinça na mão esquerda para segurar delicadamente o mamilo no lugar. Lentamente trazer a seringa pré-carregada no campo de visão usando a mão direita. A seringa deve ser mantido de modo a que nenhum reposicionamento tem que ocorrer de forma a injectar o conteúdo. </li><li> Uma vez que a seringa está em vista, procurar com cuidado na abertura pequena ductal dentro do centro do bocal, e inserir a seringa. </li><li> Sem reposicionar a mão, injecta o conteúdo da seringa e remover a agulha do mamilo. </li><li> Carregar uma segunda seringa com 50 ul de PBS para o controlo de injecção. Reposicionar o mouse sobre o palco e para a melhor vista da esquerda mamilo glândula mamária inguinal º 4 do outro lado do abdômen inferior do mouse. Repita os passos 3,4-3,7 utilizando a seringa PBS-carregado. </li><li> Uma vez que ambas as injeções são complEte, descontinuar a anestesia e mova o mouse para uma gaiola de recuperação. Monitorar a fêmea para assegurar que ela se torna móvel dentro de 5 min. Permitir que o rato para permanecer na gaiola de recuperação durante 1 hora. Depois de 1 hora de recuperação, coloque as costas feminino na gaiola com sua ninhada de filhotes. Ratos devem ser monitorizados periodicamente por 6 horas após a injecção antes de proceder à imagem. Em nossa experiência, não há conseqüências adversas foram observadas em qualquer fêmea ou os filhotes durante o período entre a injeção e de imagem. No entanto, se os sinais de perigo são observadas no sexo feminino (por exemplo, a postura arqueada, mordendo ou guarda do local de injecção, letargia geral) ou os filhotes (sem movimento, cor azulada da pele) a experiência deve ser interrompida. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging para Visualize NF-kB Atividade <ol><li> Uma vez que ratos foram transportados para a unidade de imagem, iniciar o procedimento de imagem, abrindo o software e inicializar a máquina. Ligue o éoflurane máquina e do fluxo de ar, assegurando que a anestesia é a fluir para ambos a caixa e a câmara de geração de imagens. </li><li> Posicione o mouse sob anestesia isoflurano na caixa de anestesia claro. Uma vez que a respiração desacelerou, use uma pitada de igual para confirmar o mouse é totalmente anestesiado. Em seguida, injecta-se 100 uL de substrato de luciferina no rato por injecção de retro-orbital 5 usando uma seringa estéril. </li><li> Transferir imediatamente o mouse para a câmara de imagem e colocar o nariz sob o isoflurano nariz-cone localizado lá. O mouse deve ser supina. Fixe cada pé para o palco com fita. </li><li> Entrada as configurações apropriadas para o software IVIS para tomar tanto uma imagem de luz branca fotográfico e uma imagem da atividade bioluminescente. O tempo de exposição deve ser de 10 segundos. Obter a imagem. </li><li> Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, permitem o mouse para se recuperar e, em seguida, colocá-la de volta na gaiola com seus filhotes e monitorar periodicamente. </li><li> A fotográfico e luminescentesas imagens são sobrepostas e automaticamente apresentada no ecrã, como na Figura 2. Analisar as imagens adquiridas, colocando região de interesse ou &quot;ROI&quot; círculos de igual tamanho em cada lado do abdômen inferior do mouse (um sobre a glândula PBS-injetado e um sobre a glândula LPS-injetados). Defina a leitura para fótons. Um número deve ser exibido indica a luminescência detectada dentro de cada ROI (ver Figura 2B). Utilize este número em análise estatística. </li><li> Para exibir a imagem ideal, ajustar ainda mais o limiar do sinal exibido. Isso não vai alterar a luminescência total de Leitura, mas irá permitir que você remova sinal de fundo e visualizar as diferenças entre o controle e LPS-tratados glândula. Diminuir a quantidade de luminescência mostrado até a glândula PBS-injetada é livre de sinal de fundo. Isso deve deixar o sinal aumentado na glândula LPS-tratado ainda aparente na imagem, como pode ser visto na Figura 2. </li><li> AdditionaAnálise l, incluindo os ensaios de proteína e ARN, pode ser preenchido com tecido mamário recolhida da fêmea post-mortem 6. </li></ol> 5. Resultados representativos Para se obter resultados interpretáveis ​​destes métodos, LPS (ou PBS) devem ser infundido apenas para as condutas mamárias, deixando o tecido adjacente intacta. A injecção no tecido subcutâneo envolvente do bocal irá resultar em inflamação devido a uma lesão em vez da infecção simulada. Injecção de corante azul de tripano diluído em PBS é útil quando a aprendizagem da técnica. Figura 3A mostra uma glândula com sucesso injectado infundidos com 100 ul de azul de tripano em PBS. Como se mostra, apenas a árvore ductal deve ser cheio com a solução injectada, e não deve haver nenhuma bolus no local da injecção. A &quot;bolus&quot;, neste contexto, é uma acumulação de líquido injectado no bocal ou no tecido que envolve o bocal sem infusão para a árvore ductal. Este é shprópria na Figura 3B. Por favor note que as injecções de prática mostrado na Figura 3 foram completadas em uma fêmea no dia 21 da lactação. Durante o pico de lactação (dias 8-10, a fase em que é injectado por LPS utilizando o protocolo de corrente), o leite é abundante, e é difícil de visualizar as condutas e determinar se a injecção ter sido concluída correctamente. Portanto, os pontos depois do tempo em lactação são melhores para injeções de prática. Injeção bem sucedida de LPS nos resultados mamárias dutos em aumento de NF-kB atividade dentro da glândula. Isso deve ser evidente no rato repórter sobre IVIS de imagem, e a glândula LPS injectada deve ter substancialmente a actividade de luciferase mais elevada (medido por contagem de fotões) que a glândula PBS-injectado, conforme mostrado na Figura 2 (em média, a glândula LPS lê 200% do sinal de controlo de PBS). Um aumento estatisticamente significativo da luminescência nas glândulas LPS-tratadas como amostraared ao controle contralateral foi feito através da realização de um grupo de 4 ratos 4. Um estudo adicional também utilizados para injeção mamária intraductal de qualquer E. coli ou LPS em transgênicos repórter NF-kB. Semelhante ao nosso próprio trabalho, esses autores viu um aumento significativo na atividade de repórter hr 6 depois E. coli injeção 2. Por favor note, devido à atividade de NF-kB constitutivo no cérebro e outros órgãos abdominais, as cabeças e abdômen de ratos nosso repórter mostram consistentemente um sinal quando fotografada, mesmo na linha de base antes de qualquer manipulação. Assim, este sinal deverá ser ignorado no que diz respeito a esta experiência. Um sinal evidente deve permanecer dentro da glândula mamaria LPS injectada após a leitura de imagem é ajustado para minimizar a luminescência fundo na glândula PBS. Figura 2 mostra as imagens com o fundo reduzido. Injeção mal sucedida da glândula vontademais provável resultado em dano ao mamilo. Isto fará com que assinalou, a inflamação da pele-nível que será evidente em cima da imagem latente. Este tipo de sinal de ferimento será muito forte e confinado à área do bocal em que o dano tenha ocorrido, não emana toda a glândula, como pode ser visto depois de uma injecção de LPS de sucesso para as condutas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de Procedimento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figura 2. Os resultados representativos de IVIS bioluminescente de imagem. (A) Adquirida imagem com fundo reduzido, revelando o aumento da atividade da luciferase na glândula LPS-injetados. (B) imagem de uma região com juros de quantificações acrescentou. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3 injecção Practice:.. Glândula mamária injectados com corante via injecção intraductal Para testar a exactidão do fornecimento através do bocal, um ratinho no dia 21 da lactação foram injectados com 100 uL de corante azul de tripano diluído em PBS. Após o sacrifício, a glândula foi exposto para visualização. (A) a injecção de sucesso e (B) em bolus de corante no mamilo.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui nós utilizamos um rato transgênico repórter NF-kB e uma técnica de injeção otimizado à mastite modelo, inflamação do tecido da mama mais comumente causada por infecção bacteriana. O passo mais importante neste processo é a injeção intraductal si. Na prática, é normalmente aparente se a injecção intraductal tem sido bem sucedida. A injecção dos agentes (LPS ou PBS) deve sentir-se fluido e não deve haver pouca ou nenhuma resistência, como a seringa é esvaziado. A armadilha mais comum é o ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Lipopolissacárido de Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sorotipo 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 46-013 CM- </td><td></td></tr><tr><td> 31 seringa de insulina Calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Agulha curta </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando escopo </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell isoflurano, USP </td><td> MINRAD INC para Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 sistema de imagem &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (anteriormente Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de injecção de luciferina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciferina Firefly, monohidrato de sal de sódio (Substrato luciferina) </td><td> Química e Biologia Biosynth </td><td> L-8240 </td><td> Diluir a 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

injeção intraductal de lps como um modelo do rato de mastite: sinalização visualizada através de uma nf-kb reporter transgênico

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Os modelos animais de doenças humanas são necessárias a fim de estudar rigorosamente as fases de progressão da doença e os mecanismos associados, e, finalmente, como modelos pré-clínicos para testar intervenções. Nestes métodos, é descrita uma técnica na qual os lipopolissacáridos (LPS) é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal, de forma eficaz a mastite modelagem, ou a inflamação, da glândula. Isto resulta de infecção simulados em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, como visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase 1. Nosso objetivo final no desenvolvimento desses métodos foi estudar a inflamação associada com mastite na glândula lactantes, que muitas vezes inclui vermelhidão, inchaço, e infiltração de células imunes 2,3. Por isso, estavam completamente cientes de que a incisão ou a qualquer tipo de ferimento da pele, do mamilo ou da glândula de modo a introduzir os LPS poderianão ser utilizado nos nossos métodos desde que a abordagem provavelmente confundir a leitura de inflamação. Nós também desejou um método simples e direto que não exige feitos especialmente desenhados à mão pipetas ou o uso de micromanipuladores para manter essas ferramentas especializadas no lugar. Assim, determinou-se a utilizar uma seringa de insulina comercialmente disponíveis e para injectar o agente dentro do ducto mamário de um mamilo intacta. Este método foi bem sucedida e permitiu-nos estudar a inflamação associada com a injecção de LPS, sem quaisquer efeitos adicionais sobrepostos pelo processo de injecção. Além disso, este método também utilizado um NF-kB luciferase repórter transgénico do rato e bioluminescentes tecnologia de imagem para mostrar visualmente e quantitativamente aumentar a sinalização de NF-kB na glândula LPS injectada 4. Estes métodos são de interesse para pesquisadores de várias disciplinas que desejam doença modelo dentro da glândula mamária em lactação, em última análise, a técnicaaqui descrita pode ser utilizada para a injecção de um certo número de substâncias, e não está limitado a apenas a LPS.

Aqui descrito é uma técnica na qual lipopolissacárido é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal para simular a mastite, uma condição geralmente causada por infecção bacteriana. Resultados lipopolissacarídeos injeção em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase.

Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

Modelos animais de doenças humanas são necessários para estudar rigorosamente os estágios da progressão da doença e os mecanismos associados e, fundamentalmente, como...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a mastite ou inflamação da glândula mamária, e mais especificamente, visualizar e quantificar a atividade de NF Kary dentro de uma glândula lactante inflamada. Isso é realizado primeiramente cruzando uma fêmea transgênica repórter de NF Kappa b com um macho selvagem. Oito dias após o nascimento das crias, lipopolissacarídeo é introduzido na glândula lactante da fêmea por meio de uma técnica de injeção introdutória, que não danifica completamente o local da injeção seis horas após a injeção.O camundongo passa por imagem bioluminescente para detectar a atividade da luciferase dentro da glândula mamária. Em última análise, os resultados podem mostrar atividade significativa de NF κB nas glândulas tratadas com LPS por meio do uso do método de injeção intraductal, seguido de imagem bioluminescente. A principal vantagem da nossa abordagem em comparação com outros métodos de injeção intraductal é que o local da injeção não é danificado de forma alguma.Isso é absolutamente essencial se você pretende estudar a inflamação associada à injeção de LPS, pois qualquer dano ao local ou ao mamilo sobrepor-se-ia e confundiria essas análises. Camundongos

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Medicine

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Fonte: Radulovic, K., et al. Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para imitar a entrada de produtos derivados de microbianos após ruptura da barreira intestinal. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para injetar lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos intraperitonealmente para induzir inflamação sistêmica.

Injeção intraperitoneal de lipopolissacarídeo bacteriano em camundongos para estudar respostas imunes sistêmicas

Um protocolo para a entrega intraductal não-invasivo de reagentes aquosas para a glândula mamaria do rato está descrito. O método aproveita injecção localizada nos mamilos das glândulas mamárias destinadas especificamente ductos mamários. Esta técnica é adaptável para uma variedade de compostos, incluindo o siRNA, agentes quimioterapêuticos e moléculas pequenas.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Este protocolo atual emprega repórteres fluorescentes, marcação in vivo e técnicas de imagem intravital para permitir o monitoramento do processo dinâmico de priming de neutrófilos em animais vivos.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Aqui apresenta-se um protocolo para imitar a entrada de compostos derivados de bactérias após a quebra da barreira intestinal. Um baixas doses subletais de lipopolissacarídeo foi injetado sistemicamente em ratos, que foram monitorados por injeção de pós 24h. Determinou-se a expressão de citocinas pró-inflamatórias em vários pontos de tempo no cólon, fígado e baço.

Injeções de lipopolissacarídeo em camundongos para imitar a entrada de produtos de origem microbiana após a quebra da barreira Intestinal

O objetivo deste protocolo é descrever uma nova abordagem de modelagem de câncer de mama baseada na injeção intraductal de adenovírus expressando CRE em glândulas mamárias de camundongo. Esta aproximação permite a manipulação Cell-Type-e órgão-específica de eventos oncogênico em uma maneira temporally controlada.

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Descrevemos uma injeção intracisternal que emprega uma agulha dobrada na ponta que pode ser estabilizada no crânio, eliminando assim o risco de dano ao parênquima subjacente. A abordagem pode ser usada para mapeamento do destino genético e manipulações de células leptomeningeais e para rastrear o movimento do fluido cefalorraquidiano.

Indução da Modificação das Células Leptomenínias via Injeção Intracisternal

Um método de injeção intradutal de reagentes para uma solução ablativa à base de etanol para a árvore ductal mamária do camundongo para a imagem in vivo e prevenção do câncer de mama é descrito. A injeção diretamente na abertura do mamilo permite atingir células epiteliais mamárias com danos colaterais mínimos.

Entrega intraduto e visualização de raios-X da solução ablativa baseada em etanol para prevenção e tratamento local do câncer de mama em modelos de camundongos

O presente protocolo descreve a injeção intraductal de vetores virais via teto para entregar genes de interesse nas células epiteliais mamárias.

In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Aprenda a técnica de injeção intraductal de LPS para modelar mastite em camundongos lactantes usando repórter transgênico NF-κB. Este método permite visualizar e quantificar a atividade inflamatória por imagem bioluminescente.

Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

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