Name: Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T23:37:26.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a transplantar ilhotas pancreáticas na cápsula renal de camundongos diabéticos. Este método minimiza o estresse celular e melhora os resultados da terapia com células em modelos de diabetes.

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UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Núcleo Islet. JDRF. LifeScan Inc. Johnson &amp; Johnson Company.

Preparação de Ilhotas para Transplante (Tx) <ol><li> Em microscópio invertido, mão pick-ilhotas usando um Pipetman P200 e ponta da pipeta em linha reta do ilhotas cultivadas em uma placa de 100mm. </li><li> Contagem de 100 ilhotas de cada vez e transferir para cada tubo de microcentrífuga (~ 500 ilhotas tubo / / mouse). </li><li> Permitir ilhotas para resolver a parte inferior dos tubos de microcentrífuga. </li><li> Desenhe uma das ilhotas pellet em um Pipetman P200 (fixado em 130ul) usando uma ponta da pipeta em linha reta de parede fina. </li><li> Coloque um adaptador de tubo de silicone sobre a ponta da seringa. Inserir um comprimento de tubulação PE50 no adaptador silicone. </li><li> Pendurar o Pipetman para o lado da capa e fita da tubulação PE50 à parede capô superior as ilhotas na ponta. Isso permitirá que as ilhotas de resolver apenas na ponta da pipeta. </li><li> Transferência das ilhotas na tubulação PE50 por lentamente discar o Pipetman e movendo as ilhotas na tubulação PE50, tomando cuidado para não expulsar os ilhéus a partir do final. </li><li> Faça uma torção no final chanfrada do tubo PE50. Mantendo a torção, desconecte o tubo adaptador de silicone do Pipetman e segura a torção com o adaptador silicone. </li><li> Coloque as ilhotas, no PE50 tubulação dobrada lado de silicone, tubo adaptador para baixo, em um 15 ml cônico com uma pipeta mL cortar 5 e tape o tubo PE50 sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling da tubulação PE50 enquanto centrifugação. </li><li> Centrifugar a conicals PE50/15mL a 1000 rpm e desligar centrífuga. (Nunca prepare mais de 10 preparações das ilhotas de uma só vez). </li><li> Coloque o tubo no gelo. </li></ol> Preparação de mouse para Transplante <ol><li> Anestesiar os ratos com isofluorano ou com Ketamina / Xylexene (ver protocolo de preparação). </li><li> Após anestesia tomou afeto, raspar o flanco esquerdo do mouse. </li><li> Swab pele de rato, centro-out, com swab iodopovidona e depois limpe com um algodão embebido em álcool etílico. </li><li> Localizar o rim esquerdo (logo à direita do baço). Fazer uma pequena incisão na pele, expondo o peritônio. </li><li> Fazer uma pequena incisão no peritônio expor o rim. Mantendo a pequena incisão irá ajudar na manutenção do rim levantadas e expostas. </li><li> Aplique uma leve pressão para ambos os lados da incisão, aumentar ou pop do rim para fora do mouse. </li><li> Manter a umidade do rim através da aplicação de soro fisiológico com um algodão com ponta cotonete. </li><li> Usando uma seringa de 23 ou 25 agulha, faça um pequeno arranhão no flanco direito do rim, a criação de um nick na cápsula renal, não muito profundas ou muito grande. </li></ol> Transplante de ilhotas Nota: Enquanto o mouse está sendo preparado para Tx, a segunda pessoa deve preparar o Hamilton parafuso drive-seringa transplante de ilhotas. <ol><li> Lentamente, retirar a mangueira do adaptador de silicone do tubo PE50, mantendo o kink na tubulação. </li><li> Coloque a extremidade oposta do tubo PE50 no tubo adaptador de silicone e colocar o tubo adaptador de silicone na ponta da pipeta anexado à seringa de vidro &quot;parafuso-drive&quot; Hamilton. Lentamente, liberte o kink na tubulação PE50, certificando-se que as ilhas não vazar. </li><li> Avançar a ilhotas lentamente até a ponta do tubo PE50 usando o &quot;parafuso&quot; mecanismo, mas manter uma pequena bolha de ar na frente das ilhotas na tubulação PE50. </li><li> Para o nick fez no rim, deslize cuidadosamente o tubo PE50 sob a cápsula, fazendo uma pequena bolsa. Tenha muito cuidado para não arrancar o rim ou punção através da cápsula. </li><li> Ela ajuda a manter a área e úmido de algodão cápsula com solução salina Gentamicina normais embebido ponta cotonete; uma cápsula seca vai rasgar facilmente. </li><li> Mova cuidadosamente o tubo em todas as direções, criando uma &quot;bolsa&quot; para as ilhotas transplantadas para descansar. Lembre-se de reaplicar o soro fisiológico adicional para manter a área úmida. </li><li> Sob a direção da pessoa que abriu o mouse e que tem colocado o tubo PE50 sob a cápsula renal, a segunda pessoa, que preparou o mouse e Hamilton seringa transplante, lentamente vai avançar ilhéus sob a cápsula, dentro do &quot;bolso&quot;, atrás de uma pequena bolha de ar emitido pela tubulação PE50, até que todas as ilhotas são transplantadas. </li><li> Lentamente, retirar a mangueira PE50, seque a área com um cotonete seco e cuidadosamente cauterizar o nick em lume brando. </li><li> Usando um cotonete de algodão seco ponta, certifique-se todas as sangramento parou. Uma vez que o sangramento parou, re-umedecer o rim com solução salina estéril, e gentilmente substituir o rim para o peritônio antes do fechamento do mouse com grampos de sutura e pele. </li></ol> Fechamento / Revival of Mouse <ol><li> Fechar o peritônio com um ponto em execução usando seda 5-0 w / a agulha C-6 19mm. </li><li> Forceps desenhar usando ambos os lados da incisão na pele junto. </li><li> Pele o grampo, juntamente com 2 ou 3 grampos. </li><li> Limpe a pele do mouse de qualquer sangue, usando um cotonete de algodão com ponta e saline. </li><li> Imediatamente tratar o mouse com uma injeção subcutânea de Flunixina e buprenorfina. </li><li> Posicione o mouse em uma gaiola, que é colocada sobre uma almofada de aquecimento ou abaixo de uma lâmpada de aquecimento, até que o mouse é totalmente ativo. </li><li> Remova os grampos de pele em duas semanas. </li></ol>

<ol><li>Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+to+induce+tolerance+through+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Inability to induce tolerance through direct antigen presentation.</a> Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transplant+rejection+following+treatment+with+anti-B7-2+and+anti-B7-1+antibodies.+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation.</a> Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).</li>
<li>Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+xenogeneic+pancreatic+islet+grafts+induced+by+CTLA4lg%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg.</a> Science. 257, 789-792 (1992).</li>
</ol>

Este protocolo fornece uma opção prática e eficiente para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. A técnica de concentração e as ilhotas de granulação ou células ao tubo de final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal oferece um método fácil e eficaz de transplante de células, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse.

<table><tbody><tr><td>Luvas cirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-394-95(sz)</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas para antissepsia cirúrgica</td><td>Moore Medical</td><td>42940AK</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Miltex Inc.</td><td>6-114 e 6-26</td><td>2 com dentes, 2 lisas</td></tr><tr><td>Tesouras de dissecação n=2</td><td>Miltex Inc.</td><td>5-290</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de barbear Oster (lâmina tamanho 40)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-305-10B</td><td></td></tr><tr><td>Compressas estéreis 4x4</td><td>Moore Medical</td><td>08252AK</td><td></td></tr><tr><td>Compressas de iodopovidona</td><td>Moore Medical</td><td>08486AK</td><td></td></tr><tr><td>Compressas de álcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-819-2</td><td></td></tr><tr><td>Manta térmica</td><td>Moore Medical</td><td>42508AK</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas 23G ou 25G</td><td></td><td></td><td>1&quot; de comprimento</td></tr><tr><td>Solução de Cidex</td><td>Moore Medical</td><td>07535AK</td><td>para limpeza e desinfecção de instrumentos</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE50</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td>PE50, 0,965 mm de diâmetro externo x 0,58 mm de diâmetro interno</td></tr><tr><td>Cidex + solução por 28 dias</td><td>Moore Medical</td><td>35625AK</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>Spectrum Chromat.</td><td>123732</td><td>5/32&amp;#8221; DE x 1/32&amp;#8221; DI</td></tr><tr><td>Recipiente para esterilização de instrumentos</td><td>Moore Medical</td><td>39074AK</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta retas</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0810</td><td>estéreis</td></tr><tr><td>Seringa de vidro com êmbolo rosqueável</td><td>Hamilton Co</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de cauterização</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS230</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Moore Medical</td><td>41-067</td><td></td></tr><tr><td>Seda 5-0</td><td>LOOK Surgical</td><td>754B</td><td>para sutura (6-C)</td></tr><tr><td>Cotonete com ponta de algodão</td><td>Moore Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampeador automático de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7630</td><td></td></tr><tr><td>Grampos de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7631</td><td></td></tr><tr><td>Removedor de grampos de 9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>7637</td><td></td></tr></tbody></table>

transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de ratos diabéticos ou normal. Descobrimos que era mais fácil concentrar as ilhotas ou células em pelotas na tubulação de entrega final (PE50) utilizado para o transplante de células sob a cápsula renal. Esta técnica fornece a velocidade e facilidade, reduzindo qualquer estresse para as células ou para o mouse. Loading: Settled, escolhidos a dedo, ou células ilhotas peletizadas são cuidadosamente aspirado fora da parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pipetteman p200 e uma reta, de parede fina ponta da pipeta. Um comprimento de tubos PE50 está ligado à ponta da pipeta usando um tubo de pequeno adaptador silicone. Células estão autorizados a resolver, na ponta, e depois são transferidos para o tubo PE50 lentamente por marcar o pipetteman. Uma vez que as células estão perto do fim do tubo PE50, uma torção é feita eo adaptador de tubo de silicone é colocado sobre o kink. A tubulação PE50 é transferido para a 15 mL uma pipeta de corte cônico contendo 5 mL, e os tubos PE50 é gravado sobre o lado da pipeta de 5 mL para evitar curling durante a centrifugação. Células podem chegar a 1.000 rpm e parou. Transplante: ratos são anestesiados destinatário, raspada e limpa. Uma pequena incisão é feita no flanco esquerdo do mouse e do rim está exposto. O rim, tecido adiposo, tecido e são mantidas úmidas com uma compressa de soro fisiológico. A extremidade distal do PE50 é anexado a uma seringa Hamilton movimentação do parafuso, contendo uma ponta de pipeta, usando o tubo adaptador silicone. Um nick pequeno é feito no lado do flanco direito do rim, não muito grande nem muito profundo. O fim chanfrada do tubo PE50, mais próximo das células, é cuidadosamente colocada sob a cápsula, a tubulação é movido suavemente para dar espaço ao mesmo tempo limpando soro fisiológico; uma cápsula seca pode rasgar facilmente. Uma pequena bolha de ar é fornecido sob a cápsula por lentamente marcação da unidade de rosca seringa. Ilhotas são entregues em seguida, lentamente por trás da bolha de ar. Homeostase renal uma vez que as ilhotas foram entregues é mantido e os knick é cauterizado com fogo baixo. O rim é colocado de volta na cavidade e do peritônio e da pele são suturados e grampeados. Ratos são imediatamente tratados com Flunixina quadrados e buprenorfina e colocado em uma jaula em uma almofada de aquecimento.

Nosso protocolo foi desenvolvido para fornecer precisão e facilidade ilhotas ou células sob a cápsula renal de camundongos. Células estão concentradas em pelotas na tubulação final utilizada para o transplante de células sob a cápsula renal. A facilidade desta técnica reduz o estresse nas células e mouse.

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Nosso protocolo foi desenvolvido para implantar ilhotas ou células de forma limpa e simples sob a cápsula renal de camundongos diabéticos ou normais. Verificamos que era mais fácil...

Olá, meu nome é Greg Zod. Estou no Centro de Diabetes da UCSF, no Laboratório Bluestone, e hoje vou mostrar como transplantar ilhotas pancreáticas sob a cápsula renal de camundongos diabéticos. Este procedimento envolve obter ilhotas purificadas de cepas de camundongos singênicos ou alogênicos, purificá-las e transplantá-las sob a cápsula renal de camundongos diabéticos.Camundongos que podem ser naturalmente diabéticos, como os NOD, ou camundongos que são tornados diabéticos artificialmente mediante injeção de estreptozotocina. Agora estamos prontos para selecionar manualmente os ilhotes. Vou selecionar manualmente os ilhotes e contá-los enquanto os aspiro com uma pipeta usando uma ponteira.Vou deixar para trás qualquer 'a' em nosso tecido, e é possível ver apenas pela maneira como a luz é refratada no tecido o que é uma argola e o que não é uma argola. Em seguida, conto as argolas. Vou colocá-las em um tubo de microcentrífuga e as coletaremos para transplante.Os olhinhos têm uma aparência mais densa, quase avermelhada, e o ás em R é mais claro e fofinho. Além disso, também tem um aspecto esbranquiçado. Portanto, você acabará obtendo algum tecido de ás em R enquanto coleta os olhinhos, mas, desde que pegue a maioria dos olhinhos, ficará tudo bem.E você pode ver que há um bom pedaço grande de tecido de a em R. E então aqui há um belo ilhózinho com outro ilhózinho acima dele. E então, embora haja um pouco de ace em r entre eles, você pode mover as coisas um pouco e capturar os ilhózinhos individualmente.E se você notar, estou usando uma ponteira de pipeta não cônica. Esta ponteira tem paredes muito finas e é reta. Isso permite maior facilidade para os olhais entrarem e saírem da ponteira.Tenha cuidado para não tentar pegar um linfonodo. Esses são linfonodos esotéricos, linfonodos pancreáticos que são digeridos e purificados. Eu apenas tento pegar as alças, se possível, e deixo os linfonodos para trás.Depois de selecionar manualmente as âncoras, tenho 500 âncoras soltas no fundo deste tubo de microcentrífuga. Agora vou transferir essas âncoras para o nosso tubo P150 para transplante. Para isso, pego uma ponteira de pipeta e aspiro lentamente as âncoras do fundo do tubo.Eu, uma vez que os olhais estejam na ponta da pipeta, pego meu tubo de silicone conectado ao tubo B 50 e os deixarei assentar agora na ponta da pipeta, fixando-os com fita ao lado da parede da cabine de segurança. Assim que os pellets tiverem sedimentado dentro da ponta da pipeta, removeremos a pipeta e avançaremos lentamente o pellet para dentro do tubo, utilizando o botão de ajuste da pipeta, não o êmbolo. E enquanto giro o botão da pipeta, movo o tubo.Eles permitem que os pellets entrem no tubo P 50. Quando os pellets se deslocaram para cerca de um centímetro do fim do tubo, amassei o tubo para manter os pellets no interior. Removi o tubo de silicone e transfira os pellets para a dobra.Em seguida, isso é colocado em um tubo de centrífuga com uma pipeta de cinco mililitros que foi cortada. Depois, eu dobro a tubulação e a fixo com fita adesiva à pipeta de cinco mililitros. Agora está pronto para a Centrifusão.O camundongo foi depilado e anestesiado, e vamos verificar se ele não responde ao aperto nos dedos dos pés. Vou limpar o camundongo com cotonetes de iodo de propila. A cirurgia é realizada de forma asséptica, mas todas as pontas dos meus instrumentos são estéreis.Logo à direita do baço, no flanco esquerdo do camundongo, vou fazer uma pequena incisão. A ideia agora é manter essa incisão pequena para que ela sustente o rim. Ao isolar o rim, você cortará agora a parede peritoneal logo acima desse rim, fazendo uma pequena incisão.E com um único movimento, levanto a pele para a esquerda e empurro para cima, depois para baixo no rim, fazendo-o sair assim mesmo. Mantenho o rim úmido, com um pouco de solução salina e gentamicina, um antibiótico. Com uma agulha de 25 gauge, vou fazer um pequeno corte no rim no local onde o tubo será colocado.Você não quer perfurar o rim, apenas deseja fazer um pequeno corte. Você verá uma pequena linha de sangue. Então saberá que atingiu a cápsula.Usando meu tubo P 50 que foi cortado em bisel, vou introduzir abaixo do rebordo desse corte que fiz e colocar lentamente o tubo sob a cápsula. Pavel mantém o rim úmido durante este procedimento, pois uma cápsula seca rasga facilmente. Uma vez que o tubo P 50 esteja sob a cápsula, Pavo avançará o pellet usando uma seringa Hamilton com acionamento por parafuso.E você pode ver o pellet entrando lentamente aqui, devagar. E você direciona a entrega da olhete com base no parafuso de acionamento. Depois que as olhetes são entregues, pego uma ponta de gaze seca, seco a área e, usando um ferro de cauterização, selo o corte e o rim.Usando fio de seda 5-0, agarrei o peritônio e o suturo. Faço um ponto contínuo para fechar o camundongo. Nós fechamos a pele com grampos cirúrgicos.Antes de acordar o camundongo, administro uma injeção subcutânea de bpro, amina e flu nixon (anti-inflamatórios) e um analgésico. Em seguida, o camundongo é devolvido à sua gaiola sobre uma placa aquecida. Acabei de mostrar como transplantar olhos sob a cápsula renal de camundongos.Este é um excelente modelo para investigar a tolerância à transplante ou abordagens para o tratamento da diabetes. Especificamente em nosso laboratório, utilizamos este modelo para analisar os efeitos das tregs no transplante de células insulares ou para induzir tolerância com diferentes moléculas bloqueadoras da costimulação.

transplantation-pancreatic-islets-into-kidney-capsule-diabetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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