O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

O objetivo geral deste procedimento é gerar linhagens de levedura contendo múltiplas deleções marcadas com um gene repórter de proteína verde fluorescente. Isso é realizado primeiramente preparando mutantes haploides simples denominados pro monstros, cada um dos quais possui um cassete de deleção GFP no lugar de um dos genes-alvo. O segundo passo consiste em combinar as deleções por meio do acasalamento e da esporulação de linhagens de levedura utilizando dois conjuntos de marcadores de seleção diploides e haploides denominados kit de ferramentas GM A e kit de ferramentas GM alfa, que também estão presentes nas linhagens pro monstro.

Em seguida, células altamente fluorescentes são selecionadas a partir da população miótica utilizando citometria de fluxo para enriquecer cepas portadoras de duas deleções. O passo final consiste em confirmar os genótipos das cepas classificadas. Eventualmente, rodadas repetidas de cruzamento e enriquecimento por citometria de fluxo, iniciando com as cepas resultantes, levam à geração de cepas com múltiplas deleções em maior número.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o método G para reutilização de marcadores e deleção sequencial de genes, é que múltiplas deleções podem ser obtidas por ciclo, resultando em uma montagem mais rápida de múltiplos mutantes. Após a geração de pro monstros conforme descrito no protocolo escrito que acompanha este vídeo, inicie o ciclo sexual preparando culturas das linhagens de deleção de pro monstro GFP estabelecidas em um tubo eppendorf de 1,6 mililitro para troca de ar. Prepare a linhagem de deleção do tipo de acasalamento A em 100 microlitros de meio sintético completo sem histidina, referido como meio sem his. Prepare também a linhagem de deleção do tipo de acasalamento alfa em 100 microlitros de meio sintético completo sem leucina, ou meio sem leu, em um tubo eppendorf de 1,6 mililitro para troca de ar.

Faça furos nas tampas dos tubos usando um alfinete tratado com etanol 70%. Incube os tubos em rotação horizontal a 30 graus Celsius durante a noite. O eixo da rotação deve ser paralelo ao eixo longitudinal do tubo.

Estimando pela densidade óptica, misture aproximadamente 250.000 células haploides a e 250.000 células haploides alfa de cepas com deleção de GFP em um tubo Eppendorf de 1,6 mililitro. Esse número de células geralmente corresponde a sete microlitros de cada cultura mantida durante a noite em agitação. Em seguida, proceda com o processamento dessas células centrifugando a 800 ×g por dois minutos.

Após remover o sobrenadante, faça um furo na tampa usando um alfinete tratado com etanol 70%. Para permitir a troca de ar, adicione 50 microlitros de meio YPDA após um breve vortex e centrifugue sua cultura a 800 G por cinco minutos. Em seguida, coloque o tubo em uma caixa úmida montada com uma caixa de ponteiras vazia, um suporte pequeno para ponteiras e uma toalha de papel úmida.

Incube a caixa durante a noite a 30 graus Celsius. Transfira 10 microlitros da mistura de acasalamento para 500 microlitros de meio GNA sem ágar contendo os antibióticos G418 e nat em um tubo de cultura de cinco mililitros com tampa afrouxada, a densidade óptica inicial a 600 nanômetros é aproximadamente 0,1. Agite a cultura a 30 graus Celsius por 24 horas.

Isso permite a seleção de diplóides porque apenas os diplóides que contêm tanto o MX quatro no kit GM A quanto o nat MX quatro podem crescer na presença de G quatro 18 e Nat. Transfira 20 microlitros de uma cultura de um dia para 500 microlitros de meio GN fresco contendo G quatro 18 e Nat. A densidade óptica inicial em 600 nanômetros é aproximadamente 0,2.

Rotacione o tubo a 30 graus Celsius por cinco horas para levar as células à fase logarítmica. Em seguida, corrija os diploides e isole os esporos. Siga o procedimento descrito no protocolo escrito.

Prossiga dividindo a suspensão de células relacionadas a SPO em duas partes de 300 microlitros e coloque cada uma em um tubo eppendorf de 1,5 mililitro separado. Centrifugue os tubos a 800 ×g por cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante S, faça um orifício na tampa de cada tubo.

Usando um pino de fixação, adicione 100 microlitros de meio menos his ao pellet de um tubo. Para selecionar haploides a na PT do outro tubo, adicione 100 microlitros de meio menos loo. Para selecionar haploides alfa.

Incube os tubos a 30 graus Celsius durante a noite. A densidade óptica final a 600 nanômetros deve ser inferior a 0,5. Se a densidade óptica a 600 nanômetros tender a ser muito alta, triol à temperatura ambiente.

Para induzir a GFP, adicione 100 microlitros de meio fresco sem hiss ou sem LU contendo 20 microgramas por mililitro de doxiciclina às diferentes cepas. A concentração final de doxiciclina é de 10 microgramas por mililitro. Agite o tubo em vórtex e incube em rotação a 30 graus Celsius por dois dias.

Para iniciar a citometria de fluxo, adicione 900 microlitros de tampão TE pré-filtrado a um tubo de polipropileno de cinco mililitros com a tampa substituída por uma tampa com peneira de um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Tubos de polipropileno são adequados para citometria de fluxo. A tampa com peneira é desejada para remover partículas grandes.

Coloque suavemente 75 microlitros do tampão na tampa do filtro celular. Adicione 25 microlitros das células induzidas à solução na tampa, pressionando a ponta do perpe contra a malha. Passe toda a solução combinada através do filtro.

Pressione a tampa do funil e vorte o tubo. Prepare os tubos de coleta, tubos fendor de 1,6 mililitro preenchidos com 200 microlitros de meio menos hiss ou menos lubrificante. Inicie o classificador de células e ajuste as configurações de acordo com o manual do fabricante.

Vortexe os tubos de coleta para revestir a parede com o meio. Também vortexe o tubo contendo as células antes de carregá-las no classificador de células. Adquira os dados de citometria de fluxo da amostra.

Uma linhagem sem GFP pode ser um controle negativo. Desenhe portas para separação a fim de evitar agregados celulares, que poderiam exibir alta intensidade de GFP. Descarte eventos fora da norma com largura de pulso ou área desproporcionalmente grandes para dispersão para frente, abreviada como FSC, utilizando um gráfico de largura de pulso versus altura de pulso, ou um gráfico de área de FSC versus altura de FSC.

Como uma FSC elevada é esperada apenas para agregados celulares, selecione apenas células presentes nos 20% inferiores da FSC. Evite regiões com os valores mais baixos de FSC e dispersão lateral ou SSC, onde frequentemente se encontra debris celular. O sinal de SSC e GFP frequentemente apresenta correlação positiva.

Para evitar o enriquecimento das células com valor mais alto de SSC, desenhe um portão ao longo da periferia da população utilizando um gráfico da intensidade de GFP e SSC para selecionar um percentual semelhante das células mais brilhantes de cada ponto ao longo do eixo SSC no conjunto. Deve-se marcar 0,1 a 1% da subpopulação selecionada usando os portões de FSC e SSC antes desta etapa para ordenação na tubo de coleta. Agite o tubo de coleta em vórtex para cobrir as células ordenadas com o meio do placa.

Um subconjunto de células na placa A-Y-P-D-A para genotipagem. Incubar a placa a 30 graus Celsius por dois dias após a incubação. Preparar um lisado de aproximadamente 12 colônias.

Após seguir as etapas descritas no protocolo escrito para genotipagem. Analise um microlitro de um lisado diluído utilizando uma reação de PCR de 10 microlitros com um iniciador direto. Esse iniciador se liga à região flanqueadora a montante de cada gene deletado, emparelhado com um iniciador comum que se liga a todos os locos de deleção.

A PCR pode ser realizada em formato de 96 ou 384 poços após a amplificação. Analise os produtos da PCR utilizando eletroforese.

Identifique os haplóides que provavelmente possuem os genótipos desejados. Estabeleça essas linhagens em uma placa fresca. Além disso, congele-as em glicerol a 25% a menos 80 graus Celsius.

Testes adicionais, como a confirmação da ausência de sequências do tipo selvagem para genes deletados e a eletroforese em gel pós-campo, são recomendados. Repita o ciclo sexual com cepas úteis. Progênies haploides provenientes de um cruzamento entre duas cepas foram induzidas a expressar GFP.

Cada deleção gênica possuía um cassete GFP analisado por meio de portas em um citômetro de fluxo, e uma população das células resultantes foi selecionada. É improvável que essa população contenha detritos ou agregados celulares. As 1% das células mais brilhantes foram separadas e retidas por meio do direcionamento de células com base na área de dispersão para a frente e na altura da dispersão para a frente.

Agregados celulares, que tendem a apresentar uma área de dispersão para frente desproporcionalmente grande, ou células excluídas por meio do "gating" com base na dispersão para frente e na dispersão lateral, sendo aceitas apenas as células nos 20% inferiores de dispersão para frente, enquanto se excluía debris com os valores mais baixos de dispersão para frente e dispersão lateral, realizando-se o "gating" com base na dispersão lateral e no sinal de GFP; as células mais fluorescentes entre aquelas dentro de uma faixa determinada de dispersão lateral foram selecionadas para permitir a comparação entre a mistura miótica e a amostra controle negativo que não expressa GFP. Um GA idêntico ao utilizado para selecionar a população P três é mostrado no diagrama. Para células igualmente selecionadas do controle negativo em um haplóide separado, realizou-se análise por PCR após indução da expressão de GFP e separação com base na fluorescência. O número esperado de deleções em uma célula não ordenada resultante da segregação aleatória era de 7,5.

Neste experimento específico, as células classificadas tinham um número médio de deleções de 8,8 mais ou menos 0,3, incluindo cinco células contendo 10 deleções. Genótipo DO. O PCL das linhagens classificadas foi realizado utilizando um primer reverso.

Esse 10 se liga à região flanqueadora a jusante, emparelhado com um primer direto. Esse 10 se liga à extremidade do cassete. A presença de uma banda indica a presença do cassete GFP.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o método verde Monster para criar deleções em leveduras.