Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal
11 de setembro de 2012
Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.
O objetivo geral dos experimentos a seguir é realizar uma manipulação intestinal para estudar o desenvolvimento e a resolução do íleo pós-operatório em um modelo roedor, o que é alcançado por meio da manipulação padronizada do intestino delgado entre dois aplicadores de algodão umedecidos. Em seguida, a transição gastrointestinal e colônica é analisada para medir a motilidade pós-operatória. Então, realiza-se a análise histoquímica e o cultivo de órgãos da camada muscular da parede do intestino delgado, a túnica muscularis externa ou me, para examinar os níveis de inflamação.
São obtidos resultados que mostram uma forte infiltração de granulócitos neutrófilos na ME e produção excessiva de óxido nítrico em culturas de ME, resultando em atrasos nos tempos de trânsito gastrointestinal e colônico. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento e a solução de íleo pós-operatório, bem como na investigação de possíveis estratégias de profilaxia ou terapia. O procedimento será demonstrado por Mario Lewison, um técnico do nosso laboratório. Após administrar 0,8 a 1% de isoflurano em oxigênio a um camundongo macho, posicione o animal em posição supina e utilize fita adesiva para fixar as extremidades.
Utilize um estímulo doloroso leve para testar a sedação profunda. Em seguida, realize uma laparotomia mediana, com dois centímetros de comprimento. A seguir, insira dois retratores estéreis para manter o abdômen aberto e exteriorize cuidadosamente o intestino delgado para o lado esquerdo, colocando-o sobre gaze úmida.
Usando dois aplicadores de algodão umedecidos, remova o conteúdo luminal de todo o intestino delgado rolando simultaneamente os aplicadores do piloro até o ceco. Devolva o intestino à cavidade peritoneal sem torção, para prevenir isquemia ou obstrução mecânica, e feche com duas camadas de suturas contínuas de poliamida 5,0 não absorvíveis. Feche a incisão abdominal.
Coloque o animal sob uma lâmpada de aquecimento e monitore-o até que se recupere da anestesia. Em seguida, devolva o camundongo à sua gaiola e permita acesso a alimento e água. No dia seguinte.
Após anestesiar completamente o camundongo, estenda cuidadosamente sua cabeça e use pinças rombas para puxar a língua para fora, preencha uma seringa de um mililitro com pelo menos 100 microlitros de dextrana marcada com fluoresceína. Conecte-a a um cateter arterial e insira cuidadosamente o cateter como uma sonda gástrica no estômago. Injete rapidamente 100 microlitros de dextrana FITC e remova o cateter.
Permita que o animal recupere a consciência e aguarde 90 minutos. Após os 90 minutos, eutanazie o camundongo e remova todo o trato gastrointestinal, do estômago até o reto. Coloque o intestino sobre uma placa de poliestireno e evite esticá-lo.
Em seguida, meça o comprimento total do intestino delgado e do intestino grosso. Use cânulas para fixar o intestino sobre a placa de poliestireno. Divida o intestino delgado em 10 segmentos iguais e o intestino grosso em três segmentos iguais.
Após seccionar o intestino nas posições indicadas, lave as seções uma vez com um mililitro de tampão Krebs-bicarbonato, ou KHB. Transfira as seções para tubos de dois mililitros rotulados consecutivamente e vortexe vigorosamente, em seguida centrifugue as amostras. Em seguida, transfira o sobrenadante para tubos limpos de 1,5 mililitro numerados.
Armazenar a quatro graus Celsius no escuro até a análise. Em seguida, pipete. Duplicar alíquotas de cem microlitros de cada sobrenadante em uma placa preta de 96 poços e utilizar um leitor de fluorescência para ler a placa e verificar o tempo de trânsito colônico após anestesiar semanalmente o animal.
Examine cuidadosamente a patência do cólon inserindo uma fístula. Sonda através do ânus até o cólon usando a sonda. Insira uma bola de vidro de dois milímetros, a três centímetros dentro do cólon, e remova a sonda.
Inicie imediatamente um cronômetro. Coloque o camundongo em uma gaiola transparente e monitore-o pelo período de tempo necessário para a expulsão da bola. Para análise histoquímica de amostras médias totais.
Após cortar segmentos de tecido do intestino e imergi-los em KHB frio em uma placa contendo silicone, use agulhas de insetos para fixar o mesentério à placa. Abra os segmentos ao longo da borda mesentérica e estique o tecido até 120% de seu comprimento e largura. Prenda o tecido com agulhas começando pelo mesentério. Mecanicamente.
Seccione a túnica muscular da túnica mucosa. Fixe e cora as amostras de acordo com a parte escrita deste protocolo para cultivo. A túnica muscular.
24 horas após o procedimento de manipulação intestinal, resseque todo o intestino delgado e coloque-o em KHB frio contendo penicilina, G e estreptomicina. Corte o intestino em segmentos de três centímetros de comprimento e fixe cada um deles em um recipiente de vidro revestido com silicone usando uma tesoura fina. Remova o mesentério e deslize o intestino para uma agulha oscilante com pinça fina.
Corte suavemente a mucosa e, usando um aplicador de algodão úmido, desprenda-a da submucosa e coloque-a em KHB frio acrescido de Ps. Em seguida, corte as tiras de mucosa em pedaços de dois a quatro milímetros de comprimento e incube-as em KHB gelado com PS durante 30 minutos, lavando a amostra várias vezes.
Em seguida, transfira aproximadamente 50 a 60 miligramas de mim para uma placa estéril de 24 poços contendo 500 microlitros de DMEM. Incube o tecido a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 24 horas. Colete o sobrenadante e centrifugue a 1000 RCF por cinco minutos.
Em seguida, quebre rapidamente e congele em nitrogênio líquido para medições de citocinas ou óxido nítrico. Por fim, utilizando um papel toalha limpo, seque o tecido muscular por 30 segundos e então pese-o. O parâmetro mais importante para avaliar a gravidade do íleo pós-operatório é o exame do trânsito gastrointestinal ou TGI in vivo.
Esta figura demonstra uma distribuição típica do dextrano-FITC ao longo do trato gastrointestinal em controles não tratados e em camundongos submetidos a manipulação intestinal 24 horas após a cirurgia. Como mostrado aqui, animais submetidos a cirurgia simulada apresentaram trânsito gastrointestinal normal, com centro geométrico calculado no ceco. Enquanto a manipulação intestinal (Im) levou a um atraso significativo no trânsito gastrointestinal no jejuno proximal, na análise da motilidade colônica utilizando uma esfera de vidro, camundongos submetidos à cirurgia simulada eliminaram a esfera entre 48 e 200 segundos, e a Im prolongou o tempo de eliminação para entre 470 e 775 segundos para medir a inflamação.
Dentro do ME, os níveis de leucócitos foram analisados usando histoquímica ou imunohistoquímica, conforme visto aqui. Poucos neutrófilos polimorfonucleares foram observados em camundongos controle; no entanto, a inflamação do intestino delgado levou à sua forte infiltração. Muitos mediadores inflamatórios liberados pelas células são difíceis de detectar no tecido.
Os cultivos de lisados de órgãos permitem a detecção de marcadores inflamatórios no cultivo. O sobrenadante, um mediador representativo na IOI, é o óxido nítrico, ou NO, que é um importante neurotransmissor inibitório no trato gastrointestinal. Esta figura mostra que o NO não pôde ser detectado no ME.
Cultura de órgãos, nos sobrenadantes de controle, animais em camundongos submetidos a procedimento simulado, foram observados níveis basais de nno. No entanto, as culturas de camundongos com intestino manipulado produzem significativamente mais nno após uma incubação de 24 horas. Uma vez dominada, esta técnica de manipulação intestinal pode ser realizada em menos de 15 minutos, se for executada corretamente.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir o íleo pós-operatório em camundongos e como analisar sua gravidade.
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Visão Geral
Este artigo demonstra um modelo padronizado em roedor para o estudo do íleo pós-operatório (POI) por meio da manipulação intestinal (IM), com foco na inflamação da muscularis externa (ME) e seu impacto na motilidade gastrointestinal. O protocolo inclui a avaliação in vivo do trânsito gastrointestinal e colônico, bem como métodos para separar e analisar a ME, a fim de distinguir as respostas inflamatórias em diferentes compartimentos da parede intestinal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia gastrointestinal
- Imunologia
- Modelos animais de doenças
Contexto
- A inflamação do trato gastrointestinal está implicada em diversas doenças humanas.
- A muscularis externa (ME) é uma camada altamente imunocompetente da parede intestinal, que abriga imunócitos residentes.
- O íleo pós-operatório (POI) é uma complicação comum após cirurgia abdominal, caracterizado por dismotilidade intestinal prolongada devido à inflamação, especialmente na ME.
- Mediadores inflamatórios, como IL-6, IL-1β e óxido nítrico (NO), estão envolvidos na patogênese do POI.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer e demonstrar um modelo reprodutível em roedores de IOP por meio da manipulação intestinal.
- Avaliar o trânsito gastrointestinal e colônico como medidas da motilidade pós-operatória.
- Permitir a análise imunológica da ME e da túnica mucosa, distinguindo suas respectivas respostas inflamatórias.
Métodos Utilizados
- Manipulação padronizada do intestino delgado em camundongos anestesiados utilizando aplicadores de algodão umedecidos.
- Avaliação do trânsito gastrointestinal pela administração oral de dextrana-FITC e subsequente análise segmentar do trato gastrointestinal.
- Trânsito colônico medido pela inserção e excreção cronometrada de uma bola de vidro.
- Separacão da ME da túnica mucosa para análises histoquímicas, imunohistoquímicas e de cultura de órgãos.
- Medição de marcadores inflamatórios, incluindo infiltração de leucócitos e produção de óxido nítrico, em culturas de ME.
Resultados Principais
- A manipulação intestinal provocou atrasos significativos tanto no trânsito gastrointestinal quanto no trânsito colônico em comparação com os controles.
- Uma forte infiltração de granulócitos neutrófilos foi observada na ME após a MI.
- Culturas de órgãos da ME de camundongos manipulados produziram níveis significativamente mais elevados de óxido nítrico após 24 horas em comparação com os controles e animais submetidos a operação simulada.
- Esses achados confirmam o papel da inflamação da ME no desenvolvimento e na manutenção da IPO.
Conclusões
- O modelo descrito induz de forma confiável a IOP e permite a análise detalhada dos processos inflamatórios na parede intestinal.
- A separação e análise da ME são cruciais para compreender as respostas imunes específicas a cada compartimento.
- Este protocolo é transferível para outros modelos de pesquisa que investigam a função gastrointestinal e a inflamação.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos padronizados de roedores com manipulação intestinal permitem a avaliação rigorosa da motilidade intestinal e da inflamação específica por compartimento, fornecendo diretamente subsídios para a validação precoce de alvos em casos de íleo pós-operatório e outras doenças gastrointestinais relacionadas. A avaliação quantitativa do trânsito gastrointestinal e colônico, juntamente com o perfil imunológico da camada muscularis externa, reforça a confiança preditiva em hipóteses mecanicistas e a continuidade translacional na pesquisa pré-clínica. Essa abordagem fortalece a tomada de decisões em portfólios ao esclarecer os riscos biológicos e os pontos finais funcionais na descoberta de fármacos gastrointestinais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de vias inflamatórias e mecanismos neuromoduladores subjacentes à íleo pós-operatório.
- Apoia a validação funcional de alvos mediante a quantificação da infiltração de células imunes e da liberação de mediadores na camada muscular externa.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da medição direta da disfunção da motilidade e das respostas inflamatórias.
- Oferece uma plataforma reprodutível para avaliação orientada por hipóteses de intervenções candidatas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras validadas in vivo para o trânsito gastrointestinal e colônico, apoiando fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Permite a padronização de ensaios quantitativos de motilidade e pontos finais imunológicos para reprodutibilidade.
- Prepara sistemas biológicos para avaliação escalonável de compostos direcionados à motilidade intestinal e inflamação.
- Apoia a prontidão dos ensaios para comparação cruzada de intervenções farmacológicas e genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos com mecanismos relevantes para a doença observados no íleo pós-operatório e na inflamação intestinal.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo análise de biomarcadores específica por compartimento.
- Subsedia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos de motilidade e inflamação.
- Fortalece estratégias translacionais de biomarcadores ao distinguir as respostas da mucosa e da muscularis externa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao fornecer desfechos funcionais e imunológicos in vivo robustos para pesquisas gastrointestinais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre vias inflamatórias e neuromoduladoras em distúrbios da motilidade intestinal.
- Triagem: Oferece ensaios quantitativos e reprodutíveis de trânsito e inflamação para avaliação de candidatos.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, como o centro geométrico da distribuição de dextrano-FITC e a quantificação de óxido nítrico.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhar achados pré-clínicos com características clínicas do íleo pós-operatório.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma transferível para diversos estudos de função gastrointestinal e inflamação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de motilidade intestinal.
- Valor Operacional: Promove a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios in vivo e ex vivo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao esclarecer riscos biológicos precocemente.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas terapêuticos gastrointestinais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em modelos cirúrgicos em roedores e fisiologia gastrointestinal.
- Exige acesso a leitores de fluorescência e infraestrutura para histoquímica e imuno-histoquímica.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de motilidade e ensaios imunológicos.
- Adaptável a diversas linhagens de roedores e modelos de doenças gastrointestinais mediante otimização do protocolo.
- Depende da separação precisa dos compartimentos da parede intestinal para análise específica por compartimento.
