Name: Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprenda a detectar microRNAs em microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante neuroinflamação. Este método utiliza gradiente de percoll e citometria de fluxo para isolar células e analisar expressão gênica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O trabalho foi suportado pelo NIH R01 NS071039-01A1 bolsa de investigação.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Recentemente interesse significativo foi dado a microglia e envolvimento destas células em muitas patologias associadas com neuroinflamação e neurodegeneração. Além disso, o papel de microRNAs na diferenciação de células imunes e cancro dramaticamente aumentado ao longo dos últimos 5,10 vários anos. Nós previamente relatado o papel de miR-124 na manutenção do fenótipo não-activado ou de repouso da microglia no CNS normais 7, mas o papel dos outros tipos de microRNAs em microglia fenótipo e estado d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Pode ser preparado a partir de componentes secos em laboratório, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Pode ser preparado a partir de componentes secos em laboratório, pH: 7,2-7,4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965; 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml de Percoll 100% é preparada misturando 10 ml de PBS 10X e 90 ml de Percoll a partir de Sigma. 50 ml de Percoll 70% épreparada por mistura de 35 ml de Percoll 100% e 15 ml de DMEM 50 ml de Percoll 40% é preparada por mistura de 20 ml de Percoll 100% e 30 ml de PBS 1X </td></tr><tr><td> MOG 35-55 peptídeo </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> CFA </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Toxina Pertussis </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR anticorpos bloqueadores </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE mAb </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Pode ser usado com fluoróforos diferentes (por exemplo AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs </td><td> Biolegend </td><td> 103116 </td><td> Pode ser usado com fluoróforos diferentes (por exemplo APC) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (16%) </td><td> EMS Inc </td><td> 15710 </td><td> Diluir 1:15 em PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% Gel TBE-uréia </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA TaqMan Kit Transcrição Reversa </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Ensaios TaqMan mmu microRNA-miR-124a </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> Ensaios de microRNA TaqMan snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Livre de nuclease água </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Livre de nuclease água </td></tr><tr><td> 384-placa de reação bem claro óptica </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Pode ser substituído com outras placas (por exemplo, placa de 96 poços) em diferentes instrumentos de PCR em tempo real </td></tr><tr><td> Dounce homogeneizador (15 ml) </td><td> Produtos Wheaton Ciência. </td><td> 358044 </td><td> Teflon / vidro </td></tr><tr><td> 40 μ filtro célula nylon </td><td> Falcão </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Big centrífuga </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Rotor diâmetro 18,5 centímetros </td></tr><tr><td> Centrífuga Pequeno </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Rotor diâmetro 6,5 centímetros </td></tr><tr><td> Real-time PCR Instrumento </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Pode ser substituído com outros instrumentos </td></tr><tr><td> Citômetro de fluxo </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Pode ser substituído com outros instrumentos </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Pode ser substituído com outros instrumentos </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de micrornas em microglia por pcr em tempo real no snc normal e durante neuroinflammation

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia são células da linhagem mielóide que residem no sistema nervoso central (CNS) 1. Estas células desempenham um papel importante na patologia de muitas doenças associadas com neuroinflamação tais como a esclerose múltipla (MS) 2. Microglia em um CNS normais expressar macrófagos CD11b marcador e exibem um fenótipo de repouso por expressar níveis baixos de marcadores de activação, tais como CD45. Durante os eventos patológicos no SNC, a microglia tornar-se activado, tal como determinado por supra-regulação de CD45 e outros marcadores 3. Os fatores que afetam microglia fenótipo e funções no sistema nervoso central não são bem estudadas. MicroRNAs (miRNAs) são uma família em crescimento de moléculas conservada (~ 22 nucleótidos de comprimento) que estão envolvidas em muitos processos fisiológicos normais tais como o crescimento e diferenciação celular 4 e patologias tais como a inflamação 5. MiRNAs regular negativamente a expressão de genes alvo determinados por ligação sequências complementares doIR mRNAs e desempenham um papel importante na activação de células imunes inatas incluindo macrófagos 6 e 7 microglia. A fim de investigar miRNA vias mediadas que definem o fenótipo microglial função biológica, e para distinguir microglia de outros tipos de macrófagos, é importante para avaliar quantitativamente a expressão de microRNAs particulares em subconjuntos distintos de CNS residente microglia. Os métodos comuns para medir a expressão de miRNAs no SNC incluem PCR quantitativo a partir de tecido neuronal geral e hibridação in situ. No entanto, PCR quantitativo a partir de homogeneizado de tecido inteiro não permite a avaliação da expressão de miRNA em microglia, que representam apenas 5-15% das células de tecido neuronal. A hibridação in situ permite a avaliação da expressão de microRNA em tipos de células específicos nas secções de tecido, mas este método não é inteiramente quantitativa. Neste relatório nós descrevemos um quantitativo e senstivo método para a detecção de miRNA por PCR em tempo real em microglia isolado a partir de CNS normais ou durante neuroinflamação utilizando encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de ratinho para a MS. O método descrito irá ser útil para medir o nível de expressão de microRNAs em microglia no SNC normais ou durante neuroinflamação associado com várias patologias, incluindo esclerose múltipla, lesão, acidente vascular cerebral traumática, doença de Alzheimer e tumores cerebrais.

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

As microglia são células da linhagem mieloide que residem no sistema nervoso central (SNC)1. Estas células desempenham um papel importante em patologias de muitos...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão de microRNA em micróglias. Isso é realizado primeiramente dissecando o cérebro e a medula espinhal e, em seguida, homogeneizando o tecido do sistema nervoso central ou SNC. Na segunda etapa, células mononucleares do SNC são isoladas por meio de um gradiente Percoll, e então a população de micróglias é identificada por citometria de fluxo.Em seguida, o RNA microglial é isolado e a qualidade da amostra é analisada. Por fim, é realizada a PCR em tempo real para o microRNA específico de interesse. Em última instância, o método delta delta CT pode ser utilizado para demonstrar o nível relativo de expressão de um determinado microRNA em microglia.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem isolar um número suficiente de células mononucleares do SNC ou porque a amostra está contaminada com mielina e detritos celulares. Ambos os casos resultam em preparação de baixa qualidade, seja por baixa concentração de RNA ou contaminação com proteína, respectivamente. O procedimento será demonstrado por mim e por vir.Dr.O colega Após a perfusão de todos os camundongos, dissecar os cérebros e medulas espinha

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia (células imunes do cérebro), são usadas como um biossensor substituto para determinar como as nanopartículas influenciam a neurotoxicidade. Descrevemos uma série de experimentos projetados para testar a resposta microglial a nanopartículas e a exposição de neurônios hipotalâmicos ao sobrenadante da micróglia ativada para determinar a neurotoxicidade.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Este artigo demonstra um método para visualizar e quantificar a motilidade e o contato da microglia com pontos pós-sinápticos na retina usando microscopia confocal de disco giratório.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

O Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS) é uma pipeline de análise amigável que não requer conhecimento em codificação e semiautomatiza a análise de morfologia microglial de célula única a partir de imagens de imunofluorescência. Validado em um modelo de neuroinflamação induzido por lipopolissacarídeos de roedores, o MMPS detecta reprodutivamente alterações morfológicas associadas à ativação e possibilita a fenotipagem microglial padronizada e escalável.

Software de Mapeamento de Parâmetros Microgliais (MMPS): Uma ferramenta de código aberto e fácil de usar para análise quantitativa de morfologia da microglia

Aprenda a detectar microRNAs em microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante neuroinflamação. Este método utiliza gradiente de percoll e citometria de fluxo para isolar células e analisar expressão gênica.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Explorar mais vídeos