Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão de microRNA em micróglias. Isso é realizado primeiramente dissecando o cérebro e a medula espinhal e, em seguida, homogeneizando o tecido do sistema nervoso central ou SNC. Na segunda etapa, células mononucleares do SNC são isoladas por meio de um gradiente Percoll, e então a população de micróglias é identificada por citometria de fluxo.

Em seguida, o RNA microglial é isolado e a qualidade da amostra é analisada. Por fim, é realizada a PCR em tempo real para o microRNA específico de interesse. Em última instância, o método delta delta CT pode ser utilizado para demonstrar o nível relativo de expressão de um determinado microRNA em microglia.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não conseguem isolar um número suficiente de células mononucleares do SNC ou porque a amostra está contaminada com mielina e detritos celulares. Ambos os casos resultam em preparação de baixa qualidade, seja por baixa concentração de RNA ou contaminação com proteína, respectivamente. O procedimento será demonstrado por mim e por vir.

Dr.O colega Após a perfusão de todos os camundongos, dissecar os cérebros e medulas espinhais. Em seguida, colocar um cérebro e uma medula espinhal por vez em um homogeneizador de 15 mililitros, adicionando cinco mililitros de PBS aos tecidos a cada vez. Após realizar de 10 a 20 golpes suaves, passar o homogeneizado através de peneiras celulares de 70 mícrons para tubos cónicos individuais de 50 mililitros e centrifugar os tubos por cinco a sete minutos a 834 ×g e 4 °C.

Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o homogenato de cérebro e medula espinhal de dois a três camundongos em cinco a sete mililitros de Percoll a 70%. Em seguida, sobreponha sete mililitros de Percoll a 40% e centrifugue a solução de Percoll e células por 30 minutos a 850 × g a 20 °C sem freio. Descarte as células danificadas e o debris na parte superior do Percoll a 70%.

Em seguida, colete as células mononucleares na interface entre as soluções de 70% e 40% por célula e dilua as células coletadas em PBS, em uma proporção de pelo menos um para um. Após centrifugar as células, ressuspenda o pellet em meio mililitro de PBS e transfira-as para um tubo einor de 1,7 mililitro. Comece transferindo 50 microlitros das células separadas por gradiente de densidade para um novo tubo einor de 1,7 mililitro e adicione 350 microlitros de buffer fax ao tubo.

Em seguida, após adicionar de cinco a 10 microlitros de anticorpos anti-FCR ao tubo, incubar as células por 10 a 15 minutos no gelo. Dividir a amostra celular em dois tubos eppendorf, distribuindo para um dos tubos. Adicionar um microlitro de anticorpo anti-CD11b e dois microlitros de anticorpos anti-CD45.

Incubar as células por mais 10 a 15 minutos no gelo. Rotule o segundo tubo como controle negativo e coloque-o no gelo. Após a incubação com os anticorpos de marcação, adicione um mililitro de tampão fax a ambos os tubos e centrifugue as células em uma microcentrífuga por cinco minutos a 1200 vezes.

Em seguida, fixe os pellets em 400 microlitros de paraformaldeído 1% em PBS e vortexe os tubos para evitar agregação. Por fim, analise as células por citometria de fluxo utilizando a amostra de controle negativo de células e as microesferas BD Com. Comece imunizando subcutaneamente um grupo de cinco a dez camundongos C57BL/6, com idade entre oito e doze semanas, com 150 miligramas do peptídeo MOG35-55 em quatro miligramas por mililitro de adjuvante completo de Freund para induzir EAE. Em seguida, administre toxina pertussis por via intraperitoneal no dia zero e no dia dois após a imunização.

Após isolar e corar as células conforme mostrado anteriormente, suspenda os pellets em 400 microlitros de PBS em vez de fixador, logo antes da triagem. Em seguida, encha dois tubos einor de 1,7 mililitro com 300 microlitros de PBS suplementado com 10% de FBS para coletar as amostras. Por fim, triagem as populações de micróglias e macrófagos com alta pureza utilizando a estratégia de seleção ilustrada neste gráfico de densidade representativo.

Após a classificação, reanalise as populações de micróglias e macrófagos para determinar as purezas das amostras celulares isoladas. Após centrifugar as populações celulares classificadas a 1200 vezes G durante cinco a sete minutos em uma microcentrífuga, remova cuidadosamente o sobrenadante e congele os pellets celulares em gelo seco. Em seguida, transfira os pellets celulares congelados para gelo comum.

Para descongelar, adicione 300 microlitros de tampão de lise de um kit Nirvana e, em seguida, misture suavemente a solução celular pipetando de cinco a sete vezes. Em seguida, adicione 30 microlitros do aditivo homogeneizante, agite a suspensão celular em vórtex por 30 segundos e coloque os tubos no gelo por 10 minutos. Agora, adicione 300 microlitros do fenol ácido, clorofórmio, e agite o tubo em vórtex por mais 30 segundos.

Em seguida, após centrifugar as células por cinco minutos a 9.500 × g, transfira cuidadosamente os 300 microlitros superiores do sobrenadante contendo a fase aquosa para um novo tubo eppendorf de 1,7 mililitro. Misture a solução com 375 microlitros de etanol a 100%. Transfira todo o conteúdo do tubo para uma cartucho de filtração do kit Nirvana e centrifugue o cartucho por um minuto a 9.500 × g. Em seguida, descarte o tampão do fluxo passante.

Adicione 700 microlitros da solução de lavagem um do kit Nirvana e centrifugue por mais um minuto a 9.500 ×g após lavar a cartela. Repita mais duas vezes com 500 microlitros da solução de lavagem dois do kit Nirvana. Elua o RNA da cartela com 60 microlitros de água livre de nucleases pré-aquecida.

Por fim, utilize um espectrofotômetro NanoDrop para avaliar a pureza e a quantidade do RNA após a realização da Q-R-T-P-C-R em tempo real para detectar micro-RNA nas amostras de micróglia e macrófagos. Curvas de P-R-T-P-C-R para produtos de PCR de mer 1 24 e snow RNA 55 marcados com fluorescência podem ser criadas como mostrado aqui no primeiro gráfico. Curvas típicas para a quantidade de produtos de PCR específicos marcados com fluorescência para amostras de controle de RNA de snow RNA 55 isoladas de micróglia ou macrófagos derivados de medula óssea, em comparação com o número de ciclos de PCR, são apresentadas.

Observe como os valores de CT para a análise da expressão de RNA snow 55 nas diferentes populações celulares são determinados no ponto de interseção da linha de base com a parte inferior do intervalo linear das curvas de Q-R-T-P-C-R, conforme indicado no gráfico pelas linhas verticais verde e azul. Neste segundo gráfico, mostra-se a quantidade de produtos específicos de PCR marcados com fluorescência para as amostras experimentais de RNA mere 1 24 de microglia ou macrófagos derivados de medula óssea em comparação com o número de ciclos de PCR. Observe como os valores de CT para a análise da expressão de mere 1 24 nas diferentes populações celulares são novamente determinados no ponto de interseção da linha de base com a parte inferior do intervalo linear das curvas de Q-R-T-P-C-R, conforme indicado no gráfico pelas linhas verticais verde e azul.

Após determinar os valores de CT para cada uma das amostras, conforme a expressão de snow RNA 55 e mere 1 24 em micróglias e BM dms de camundongos normais e EAE mostrada nesta tabela, subtraia o valor de CT da amostra controle snow RNA 55 do valor de CT da amostra experimental mere 1 24 para calcular os valores de delta CT para cada duplicata de cada amostra. Em seguida, subtraia o delta CT da amostra de referência dos valores de delta CT das demais amostras para calcular os valores de delta delta CT. Por fim, o nível relativo de expressão para cada amostra é calculado como dois elevado à potência de menos delta delta CT, conforme visto neste gráfico de densidade.

No caso de um bom isolamento de micróglia do SNC normal, 95 a 98% das células representarão micróglia CD11B positiva CD45 baixa, com duas a 5% da suspensão celular compostas por macrófagos perivasculares CD11B positivos CD45 altos, e menos de 1% de linfócitos CD11B negativos CD45 altos ou astróglia CD11B negativa CD45 negativa ou células gliais oligodendrocitárias ou fragmentos celulares estarão presentes. Em comparação, em um preparo ruim, há uma contaminação significativa de células ou fragmentos celulares CD11B negativos CD45 negativos, como astróglia ou partículas de mielina, tornando as células inadequadas para isolamento de RNA e análises posteriores. Além disso, células CD11B negativas CD45 altas também podem estar presentes, indicando contaminação por linfócitos sanguíneos devido à perfusão insuficiente. Neste gráfico de densidade, as três populações celulares presentes no SNC durante a neuroinflamação — micróglia CD11B positiva CD45 baixa, macrófagos CD11B positivos CD45 altos e linfócitos CD11B negativos CD45 altos — são mostradas nesta figura.

A qualidade do RNA, determinada por eletroforese em gel após um isolamento bom versus ruim, é mostrada. Quando o RNA é isolado de maneira limpa, uma escada de RNA e o RNA ribossômico são evidentes; quando o processo de isolamento é realizado de forma inadequada, aparecem borras e produtos de degradação de baixo peso molecular. Esses dados finais demonstram a expressão de meras 1 24 em microglia normal de adultos, microglia de camundongos com EAE e microglia isolada de camundongos durante estágios iniciais do desenvolvimento.

Neste primeiro gráfico de barras, a expressão relativa de mere 1 24 é muito maior em microglia do SNC normal em comparação com a observada em macrófagos derivados da medula óssea. Da mesma forma, embora haja um aumento no RNA de mere 1 24 em macrófagos do SNC de camundongos com EAE, a microglia ainda expressa cinco vezes a quantidade de RNA de mere 1 24. Este último gráfico de barras demonstra como as alterações no nível de expressão de mere 1 24 em microglia durante o desenvolvimento de camundongos de uma, duas e quatro semanas de idade, em comparação com camundongos adultos de oito semanas, também podem ser avaliadas utilizando este método durante a tentativa do procedimento.

É importante lembrar de ter uma quantidade suficiente e de boa qualidade de células isoladas, o que garantirá bons resultados para todo o experimento.