Name: De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a purificar proteínas recombinantes com tag His em alta vazão usando robótica de manipulação líquida. Este método automatizado minimiza erros humanos e garante reprodutibilidade na purificação de múltiplas amostras.

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Este trabalho foi financiado por um Projeto Wellcome Grant (078043/Z/05/Z) para ROJW

PARTE A: High-throughput crescimento de culturas bacterianas. 1. As bactérias crescem durante a noite, em 2 ml de Meio autoindução Usando placas de 24 poços <ol><li> Esterilizar as placas de 24 poços por microondas. </li><li> Inocular 1,5 ml de meio de auto-indução (Medium Overnight Express) com recém-cultivadas colônias de bactérias ou ações de glicerol congelados. Nós normalmente inocular três poços para cada mutante, com três colónias individuais clonados. Reservar seis poços para controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos que crescem em três clones de tipo selvagem e para os controlos negativos que crescem dois clones que foram transformadas com um plasmídeo não expressar. Verificar para esterilização suficiente da placa, deixando uma cavidade em branco para o controlo do meio-only. </li><li> Cultivar as células durante 18 horas a 37 ° C e agitação a 250 rpm. Usamos lac induzível BL21 (DE3) Rosetta 2 células. Meio de auto-indução contém uma mistura de glucose e lactose. A bactéria inicialmentealimentar de glucose e em seguida começar a utilizar a lactose, o qual também induz a expressão das proteínas recombinantes. </li><li> Remover a tampa e colocar a placa na plataforma robótica. </li></ol> PARTE B: purificação de proteínas recombinantes Robótica. 2. Prepare a plataforma robótica <ol><li> Tornar-se o tampão de lavagem consistindo em 20 mM de imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glicerol a 10%, e o tampão de eluição constituído de imidazol 0,5 M, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% de glicerol. Estas memórias intermédias será usado para lavar as esferas após as proteínas marcadas foram ligados a eles, ou para eluir as proteínas a partir dos grânulos, respectivamente. </li><li> Tornar-se o diluente bacteriana (100 ml de água destilada, com 15 ul de reagente anti-espuma). Esta solução será usadapara fazer diluições das culturas bacterianas durante a noite para a densidade óptica (A600) medições. A presença de anti-espuma no diluente evita a formação de bolhas de ar que possam interferir com as medições de leitor de placa. </li><li> O volume da solução de lise composta por reagente fastbreak 10x, 2 lysonase ul por cada amostra e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contém uma mistura de detergentes e sais que quebrar as paredes celulares de bactérias e facilitar a liberação de proteínas intracelulares. Lysonase é uma mistura patenteada de lisozima e uma nuclease. Lisozima auxilia na ruptura da parede celular e a nuclease digere os ácidos nucleicos bacterianos libertados. </li><li> Opcional: Faça-se uma solução de cloridrato de 6 M de guanidina. Algumas proteínas recombinantes tendem a ficar com as agulhas com teflon de pipetagem. A guanidina desnatura as proteínas e solução de cloridrato de lava-los de forma mais eficaz do que a água que é rotineiramente usado para lavar as laváveis ​​robóticos dicas de pipetagem após cada ªep. </li><li> Prepare o BCA (ácido bicinconínico) reagente quantificação de proteínas por mistura de solução de ácido bicinconínico (reagente A) e da solução de sulfato de cobre (reagente B): ligações peptídicas reduzir Cu 2 + a partir do CuSO4 componente presente no reagente BCA de Cu em que 1 + a quantidade de Cu + 1 é proporcional ao número de ligações peptídicas presentes na solução. Num segundo passo, duas moléculas de ácido bicinconínico quelato de Cu 1 + resultando numa mudança de absorvância a 562 nm, o que resulta numa cor púrpura. A reação de cor é dependente do tempo e, geralmente, precisa de várias horas para ser definitiva. Depois que a cor é estável durante várias horas. </li><li> Preencha calhas ou placas do tamanho certo e colocá-los em suas posições pré-alocados na plataforma robótica. </li><li> Coloque uma placa de 24 cavidades para os resíduos de cloridrato de guanidina, duas claras placas de 96 cavidades para a OD 600 e medições de absorvância e um azul placa de 96 poços para poe proteínas purificadas sobre as suas posições sobre a plataforma. Coloque uma placa de 96 deepwell no stand magnético. </li><li> Diluir MagneHis Ni-partículas de proteínas que se ligam através da formação de quelatos com os seus His-Tag de 5 vezes em água destilada e enchê-los para a unidade de pérolas em agitação. Desligue o agitador para manter os grânulos em suspensão. </li><li> Ligue a plataforma robótica e lave as agulhas de pipetagem por vários minutos para remover as bolhas de ar que, de outra forma interferir com a precisão de pipetagem. As agulhas reutilizáveis ​​pipetagem são lavadas entre os passos de pipetagem individuais. Alternativamente, pontas descartáveis ​​podem ser utilizados. Todos os passos subsequentes são realizadas roboticamente. O protocolo de robótica está disponível mediante pedido. </li></ol> 3. Crescimento das células é verificada por medição da OD600 <ol><li> 10 ul da cultura durante a noite dilui-se em 90 ul de uma solução diluente. </li><li> Medir a OD 600 para assegurar que as bactérias cresceram até densidades semelhantes(Figura 1). </li></ol> 4. As células são quebradas para liberar as proteínas e para permitir Bead vinculativo <ol><li> 100 ul de suspensão de Ni-esfera magnética é distribuído em cada cavidade de uma placa de 24 cavidades segundo. </li><li> 900 uL de cada cultura em pequena escala bacteriano é transferido para a placa de 24 poços contendo os grânulos. Adicionar 100 ul da mistura fastbreak / lysonase 10x. </li><li> A placa de 24 poços é transferido para a plataforma de agitação para agitação rápida (800 rpm) durante 30 min à temperatura ambiente. As paredes das células bacterianas são interrompidas por uma combinação de forças mecânicas e acção química e as proteínas produzidas de forma recombinante são libertados para a solução. Com tags sua afinidade imediatamente ligar as esferas paramagnéticas de níquel quelantes. </li></ol> 5. As esferas são lavadas <ol><li> Os lisados ​​de células contendo-os grânulos em suspensão magnética são transferidos para uma placa de 96 deepwell que é posicionado sobre um suporte com mhastes agnetic que deslizam entre os poços. As placas de 96 cavidades têm uma parte inferior em forma de cone largo, que facilita a remoção do sobrenadante. As cavidades podem conter volumes de até 2,1 ml, mas são preenchidos com volumes muito pequenos. Isto permite-nos realizar vigorosos passos agitação sem amostra de contaminação cruzada por salpicos. </li><li> As pontas das pipetas são lavadas entre cada passos de pipetagem com 6 M de guanidina-HCl. Este passo é crucial para a depuração de TFIIB e outras proteínas &quot;pegajosos&quot;, para evitar a contaminação cruzada. Com outras proteínas pode ser suficiente para enxaguar as agulhas extensivamente com água, entre os passos de pipetagem. </li><li> As hastes magnéticas do suporte magnético atrair as esferas paramagnéticas, puxando-os para fora a partir dos centros dos poços e permitir que as agulhas de pipetagem livre acesso ao sobrenadante. O sobrenadante é descartado. </li><li> 500 ul de tampão de lavagem é adicionado à placa de 24 poços e subsequentemente transferido para a placa de 96 poços e paraNsure a transferência completa dos grânulos. A placa de 24 cavidades é removido do agitador. </li><li> Outra ul 500 de tampão de lavagem é adicionado directamente à placa de 96 poços, a placa foi transferida para o agitador e agitado vigorosamente durante 1 minuto. A placa é movida de volta para o suporte magnético e o tampão de lavagem descartada. </li><li> Este passo é repetido mais duas vezes e o procedimento de lavagem é terminada através da remoção de quaisquer vestígios de tampão da placa. </li></ol> 6. Eluir as proteínas em tampão de eluição <ol><li> 100 ul de tampão de eluição é adicionado aos grânulos, a placa é movida para o agitador e agitado vigorosamente durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> A placa é movida de volta para o agitador e o eluato contendo a proteína recombinante purificada, é transferida para uma nova placa. </li></ol> 7. Medir as concentrações das proteínas purificadas <ol><li> 190 ul de reagente BCA mistura é transferida para uma placa de 96 poços clara e 10 ul da protein solução adicionada. </li><li> Após várias horas de incubação (normalmente 5-6 ou durante a noite), medir a absorvância e compará-lo com os padrões de BSA para determinar as concentrações de cada uma das preparações de proteína purificada (Figura 2). </li><li> As proteínas purificadas podem agora ser usados ​​para aplicações a jusante, nas concentrações apropriadas (Figura 3). </li></ol> 8. Resultados representativos O protocolo de purificação oferece duas etapas de controlo de qualidade, exemplos dos quais são mostrados. Nós somos capazes de identificar e documentar os potenciais problemas na fase de crescimento bacteriano (Figura 1) e, mais tarde, mediante a avaliação dos rendimentos das proteínas purificadas (Figura 2). Nós normalmente purificar proteínas e testá-los em triplicado. Isto, em combinação com as duas etapas de controlo de qualidade, dá-nos a certeza de que qualquer variação foi observada nos nossos ensaios funcionais devem-se ao mutante phenotype (Figura 3) e não é causada por variações experimentais ou purificações falhadas. Os rendimentos obtidos variam tipicamente 50-200 ug e são mais do que suficientes para vários ensaios funcionais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figura 1. Histograma das medições de OD de uma placa de 24 poços com culturas durante a noite. Três clones de seis TFIIB variantes mutantes, assim como do tipo selvagem TFIIB foram cultivadas. Dois clones que transportam um plasmídeo não expressar e um poço com meio apenas servem como controlos negativos. As medições de OD mostram que existem pequenas variações nas taxas de crescimento entre as diferentes culturas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figura 2. Rendimentos proteicos obtidos a partir destas culturas, conforme determinado por um ensaio de BCA e confirmada por SDS-PAGE. Uma das variantes não é expresso em níveis elevados. Em comcombinação com a Figura 1, pode-se concluir que esta não era devida ao crescimento celular diferencial, mas, devido à expressão da proteína não ser induzido adequadamente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figura 3. Resultado representativo de um ensaio de transcrição. Medimos a actividade de estimulação de variantes TFIIB sobre a produção de pequenas transcritos abortivos por RNAP. Aqui, os efeitos de estimulação de uma biblioteca completa de substituições de um único aminoácido de TFIIB resíduo K87 são mostrados. O elevado grau de reprodutibilidade é confirmada por pequenas taxas de erro. Um gel de exemplo mostrando o desempenho de três mutantes em relação ao tipo selvagem (wt), controlos negativos (NC) e tampão de eluição apenas controla é descrito abaixo.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de purificação da proteína recombinante automatizado aqui descrito permite a produção e purificação de um grande número de proteínas mutantes em um formato de pequena escala sob condições altamente reprodutíveis com uma intervenção humana mínima. Figuras 1 e 2 mostram os resultados dos controlos de qualidade-sistemáticos e exemplos do proteínas purificadas. Figura 3 mostra que os factores de transcrição purificados usados ​​neste exemplo realizar de uma maneira altamente reprodutíveis em ensaios funcionais. Mesmo que o processo foi desenvolvido para a purificação de arquea TFIIB, ele é amplamente aplicável para a purificação de proteínas marcadas com afinidade. A utilização de tais protocolos de purificação automatizados, assim, facilitar consideravelmente a análise bioquímica de proteínas recombinantes e, assim, ainda mais a nossa compreensão de interacções proteína-proteína em uma escala que é difícil de conseguir manualmente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Overnight Express Médio TB Instantânea </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71.491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega Ltd. </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Lysonase Bioprocessing / 1 ml </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Partículas </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Base Trizma </td><td> Sigma-Aldrich Compqualquer Ltd. </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Determinação de proteína do ácido bicinconínico Ácido </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Poço Profundo Placa 2,2 ml Praça Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca MicroWell 96 de poliestireno de fundo bem plana não tratada 12 mangas de cinco placas de 0,4 ml de volume bem claro 128 milímetros x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd. </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Azul </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Bem RB blocos (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Agulha lavável para TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente para a cremalheira esferas magnéticas </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma robótica TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Shaker Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços Tipo Um ímã </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

de alto rendimento de purificação de afinidade com tag proteínas recombinantes

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Cristalografia de raios X é o método de escolha para a obtenção de uma visão detalhada da estrutura das proteínas. Tais estudos devem ser complementadas por outras análises bioquímicas para obter insights detalhados em estrutura / função relacionamentos. Avanços no oligonucleótido e tecnologia de síntese de gene tornar estratégias de mutagénese em larga escala cada vez mais viável, incluindo a substituição de resíduos alvo por todos os outros 19 aminoácidos. Ganho ou perda de função de fenótipos então permitir conclusões sistemáticas para ser elaborados, tais como a contribuição dos resíduos específicos a actividade catalítica a estabilidade da proteína, e / ou proteína-proteína especificidade interacção. De modo a atribuir diferentes fenótipos à natureza da mutação -, em vez de a variação das condições experimentais, - é vital para purificar e analisar as proteínas de uma forma controlada e reprodutível. Alto rendimento estratégias ea automação de protocolos manuais emrobóticos líquido de manipulação de plataformas criaram oportunidades para realizar tais procedimentos complexos moleculares biológicos com pouca intervenção humana e as taxas de erro mínimo de 1-5. Aqui, nós apresentamos um método geral para a purificação da His-tag proteínas recombinantes de um modo de alto rendimento. Num estudo recente, foi aplicado o método de uma investigação detalhada estrutura-função de TFIIB, um componente da maquinaria de transcrição basal. TFIIB é indispensável para o promotor da transcrição dirigida in vitro e é essencial para o recrutamento de polimerase de ARN em um complexo de pré-iniciação 6-8. TFIIB contém um domínio de ligação flexível que penetra na fenda do local activo da polimerase de ARN 9-11. Este domínio ligante confere dois bioquimicamente actividades quantificáveis ​​em TFIIB, a saber, (i) a estimulação da actividade catalítica durante a fase de &#39;abortivo&#39; de iniciação transcrição, e (ii) uma contribuição adicional para orecrutamento específica da polimerase de RNA para o pré-iniciação complexo 4,5,12. Nós explorada o método de purificação de alto rendimento para gerar substituição única, dupla e tripla e mutações deleções dentro do linker TFIIB e para posteriormente analisá-las em ensaios funcionais para o seu efeito de estimulação sobre a actividade catalítica da RNA polimerase 4. Ao todo, foram geradas, purificados e analisados ​​381 mutantes - uma tarefa que teria sido demorada e trabalhosa para executar manualmente. Nós produzimos e ensaiadas as proteínas em multiplicates que nos permitiu apreciar quaisquer variações experimentais e nos deu uma idéia clara da reprodutibilidade dos nossos resultados. Este método serve como um protocolo genérico para a purificação de proteínas marcadas com His-e tem sido utilizado com sucesso para purificar outras proteínas recombinantes. Actualmente, é optimizada para a purificação de proteínas de 24, mas pode ser adaptado para purificar até 96 proteínas.

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

A cristalografia de raios X é o método de escolha para a obtenção de uma visão detalhada da estrutura de proteínas. Tais estudos precisam ser complementados por...

O objetivo deste procedimento é purificar proteínas recombinantes com marcação his de forma de alto rendimento, utilizando um protocolo automatizado em uma plataforma robótica. Isso é realizado primeiramente pela superexpressão das proteínas em culturas de pequeno volume em *E. coli*. Em seguida, as células são lisadas quimicamente para liberar as proteínas, que então se ligam a esferas magnéticas de níquel.Em seguida, as microesferas são lavadas para remover proteínas contaminantes e aumentar a pureza das proteínas desejadas. Por fim, as proteínas são purificadas das microesferas magnéticas. Como resultado, podem ser obtidos dados que demonstram a concentração e pureza das proteínas por meio de ensaios BCA e eletroforese SDS-PAGE, além de ensaios funcionais adicionais para determinar a atividade das proteínas.A principal vantagem desta técnica é que agora podemos purificar um grande número de proteínas em condições idênticas com mínima intervenção. Isso nos permite obter um alto grau de reprodutibilidade e também minimiza erros humanos. Este método é particularmente útil para estudar grandes quantidades de mutantes pontuais de uma proteína específica, pois assegura que a variabilidade na atividade da proteína é realmente devida à mutação e não às diferenças no preparo das amostras.Para preparar culturas bacterianas de crescimento noturno, comece enchendo placas de 24 poços com água e aquecendo-as no micro-ondas por dois minutos para esterilizá-las. Descarte a água e aqueça novamente as placas no micro-ondas por dois minutos. Usando colônias bacterianas recém-cultivadas, induzíveis por lactose, BL21 Rosetta2, ou estoques congelados em glicerol, inocular 1,5 mililitro de meio de indução automática contendo uma mistura de glicose e lactose. Utilize três poços para os controles positivos e três poços para os controles negativos, além de um poço contendo apenas meio como controle.Cultive as células a 250 RPM por 18 horas a 37 graus Celsius. Remova a tampa e coloque a placa na plataforma robótica. A plataforma contém um braço com garra para mover objetos de uma posição para outra, um braço de pipetagem e várias posições para as placas e reservatórios, incluindo uma plataforma de agitação, um agitador de microesferas magnéticas e uma plataforma magnética.Para placas de 96 poços, prepare os tampões de lavagem e diluição para o procedimento de purificação de acordo com o protocolo escrito, utilizando 100 mililitros de água destilada e 15 microlitros de um reagente antiespuma. Prepare uma solução para diluir culturas mantidas durante a noite para medições de densidade óptica. Faça uma solução de lise contendo o reagente de ruptura rápida, lisase e acetato de magnésio, e prepare a solução para o ensaio proteico BCA.Como o TF dois B tende a aderir às ponteiras de pipetagem, prepare uma solução de cloreto de guanidina seis M para lavá-las. Encha placas ou canais do tamanho adequado com os tampões apropriados e coloque-os nas posições previamente designadas na plataforma robótica, em suas posições na plataforma. Coloque uma placa de 24 poços para o resíduo de cloreto de guanidina, duas placas claras de 96 poços para as medidas de OD 600 e absorbância, e uma placa azul de 96 poços para as proteínas purificadas.Coloque 1 placa de fundo profundo de 96 poços no suporte magnético. Use água para diluir as partículas de níquel magnéticas e adicione-as à unidade de partículas. Ligue o agitador para manter as partículas em suspensão.Ligue a plataforma robótica e faça a lavagem das agulhas de pipetagem por vários minutos. Para remover bolhas de ar, coloque a placa em uma plataforma agitadora para verificar o crescimento das culturas celulares de overnight. Dilua 10 microlitros de cultura em 90 microlitros de solução diluente, lavando as pipetas entre as adições.Em seguida, meça a densidade em OD 600 quando as culturas atingirem densidades semelhantes. Transfira 100 microlitros de suspensão de microesferas magnéticas de níquel para os poços de uma placa de 24 poços e transfira 900 microlitros de cada cultura para os poços, lavando as pipetas entre os passos. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura de Fast Break Lyase.Coloque a placa na plataforma agitadora a 800 RPM por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir a lise celular e a ligação das proteínas com marcação His às esferas para lavar as esferas. Transfira-as para uma placa de 96 poços sobre um suporte com hastes magnéticas que afastam as esferas dos centros dos poços, descarte o sobrenadante e utilize seis mo iGuide cloreto de hidrogênio para lavar as ponteiras de pipeta. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem aos poços do 24.Placa de poços e transfira as amostras para a placa de 96 poços. Em seguida, remova o sobrenadante. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem à placa de 96 poços.Placa de poços. Transfira a placa para o agitador e agite vigorosamente por um minuto. Em seguida, retorne a placa à base magnética e remova o tampão de lavagem.Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de tampão de eluição às esferas e agite vigorosamente por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o eluato para uma nova placa. Para quantificar as amostras de proteína, adicione 190 microlitros do reagente BCA aos poços de uma placa clara de 96 poços e adicione 10 microlitros das amostras de proteína aos poços.Incube as amostras por pelo menos cinco horas e meça a absorbância com um conjunto de padrões de BSA. As proteínas são então armazenadas a menos 80 graus Celsius. O protocolo de purificação oferece duas etapas de controle de qualidade.Inicialmente na fase de crescimento bacteriano e posteriormente ao avaliar os rendimentos proteicos. Ao purificar as proteínas em triplicata, é possível determinar que quaisquer variações nos ensaios funcionais são devidas aos fenótipos mutantes e não causadas por variações experimentais ou falhas nas purificações. Os rendimentos normalmente variam de 50 a 200 microgramas e são mais do que suficientes para ensaios funcionais. Embora exija experiência inicial, a técnica leva apenas cerca de três horas, e além de preparar a plataforma, montar os cultivos e coletar as proteínas purificadas, não há mais nada que precise ser feito.Após este procedimento, podem ser realizados ensaios funcionais. No nosso caso, seriam uma série de ensaios de transcrição com o objetivo de investigar como a mutação do fator de transcrição dois B altera seu efeito sobre a atividade catalítica da polimerase ar.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução...

 Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Neste vídeo, demonstramos a técnica de cromatografia de afinidade de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinase marcadas com histidina da bactéria Clostridium difficile.

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

No presente protocolo, demonstramos um método altamente eficiente e de baixo custo purificação de proteínas em pequena escala, que permite a purificação de proteínas recombinantes, combinando de forma única um GST-tag quebrável e uma pequena His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Um adaptador de placa de várias colunas permite que as colunas de cromatografia sejam interfaceadas com placas de coleta multi-poços para afinidade paralela ou purificação de troca de íons, proporcionando um método econômico de purificação de proteínas de alto rendimento. Pode ser usado sob gravidade ou vácuo produzindo quantidades de miligramas de proteína através de instrumentação acessível.

Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificar proteínas recombinantes com tag His em alta vazão usando robótica de manipulação líquida. Este método automatizado minimiza erros humanos e garante reprodutibilidade na purificação de múltiplas amostras.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

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