Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

O objetivo deste vídeo é descrever um procedimento para caracterizar a transição da permeabilidade mitocondrial. Má abertura nas mitocôndrias, isoladas do coração do camundongo. Primeiro, as mitocôndrias são isoladas dos corações dos camundongos.

Usando o método de centrifugação diferencial, a qualidade das mitocôndrias isoladas é então avaliada usando um eletrodo de oxigênio oxitérmico conectado a um computador para medir a taxa de controle respiratório e avaliar a integridade da membrana mitocondrial. Em seguida, usando instrumentação espectrométrica, medição simultânea de manuseio de cálcio, potencial de membrana mitocondrial e volume mitocondrial são usados para determinar a transição de permeabilidade. Má abertura.

Os dados resultantes mostraram diferenças na capacidade de retenção de cálcio e na transição da permeabilidade mitocondrial. Baixa sensibilidade das mitocôndrias isoladas, Abertura da transição de permeabilidade mitocondrial. O poro é um fenômeno complexo que envolve alterações em vários níveis na fisiologia e anatomia mitocondrial.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que a medição de vários parâmetros ao mesmo tempo oferece uma imagem mais abrangente do fenômeno do que a medição de parâmetros individuais sozinhos, como cálcio, mobilização ou inchaço Antes de iniciar o procedimento, descongele o tampão de isolamento mitocondrial e verifique o pH, que deve ser 7,4. Em seguida, coloque todos os tampões, pratos e tubos que serão usados no gelo. Observe que todas as etapas do protocolo de isolamento das mitocôndrias devem ser realizadas no gelo.

Coloque os corações de camundongos sacrificados em uma placa de Petri e enxágue o sangue com mitocôndrias frias. Buffer de isolamento. Em seguida, transfira os corações para uma nova placa de Petri usando uma lâmina, remova a gordura e os átrios e pique os corações até obter um produto homogêneo.

Transfira os corações picados para um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias com 0,1 miligrama por mililitro de tripsina e deixe a amostra digerir no gelo por 10 minutos. Observe que o uso de tripsina aumenta o rendimento das mitocôndrias isoladas e deve ser mantido constante entre a preparação mitocondrial.

No entanto, recomendamos testar a funcionalidade de mitocôndrias isoladas em preparações obtidas na ausência de tripsina para garantir que a enzima não interfira em seus íons. Após a incubação, adicione 10 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias contendo 0,1% de inibidor de tripsina livre de ácidos graxos, BS, a e cinco miligramas e misture invertendo o tubo várias vezes Para neutralizar a tripsina, recupere o tecido digerido em velocidade baixa a média. Centrifugação por um minuto de quatro graus Celsius.

Após a rotação Resus, suspenda o tecido em oito mililitros de tampão de isolamento mitocondrial com 0,1% de BSA livre de ácidos graxos, mantendo a amostra no gelo. Use um homogeneizador de dança motorizado com um pilão de Teflon para homogeneizar a amostra com quatro a seis passagens a 1.200 a 1.400 RPM. Transferir o homogeneizado para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 800 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Para peletar os núcleos e detritos teciduais. Após a centrifugação, recuperar o supinato contendo as mitocôndrias em tubos de microcentrífuga e centrifugá-los a 8.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o pellet terá uma camada branca em cima.

Use um sistema de vácuo para aspirar e remover cuidadosamente a camada branca no topo do pellet mitocondrial. Em seguida, ressuspenda novamente o pellet mais escuro restante, que contém as mitocôndrias em um mililitro de mitocôndrias. Buffer de isolamento.

Em seguida, centrifugue as mitocôndrias a 8.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supinado e ressuspenda o pellet mitocondrial. Em 150 microlitros de mitocôndrias, tampão de isolamento, mantenha as mitocôndrias no gelo.

A respiração das mitocôndrias isoladas é medida com um eletrodo de oxigênio oxitérmico conectado a um computador e controlado por oxi. O software plus, o eletrodo de oxigênio deve ser calibrado no dia do experimento. Adicione dois mililitros de tampão respiratório mitocondrial contendo uma concentração final de uma rotenona micromolar ao oxi da câmara, sele a câmara e comece a registrar o sinal de oxigênio.

O sinal registrado pelo sistema e exibido na tela do computador é proporcional à concentração de oxigênio na câmara oxitérmica. Quando o sinal de oxigênio estiver estável, adicione 250 microgramas de mitocôndrias e registre a respiração basal por um minuto. A respiração neste ponto deve ser muito baixa, pois as mitocôndrias aspiram em substratos endógenos.

Esta é a respiração do estado um. Adicione succinato a uma concentração final de cinco milimolares para iniciar a respiração mitocondrial no complexo dois e registre o sinal por um minuto. O consumo de oxigênio deve aumentar durante a respiração do estado dois.

Para induzir a respiração do estado, adicione um DP a uma concentração final de 150 micromolares. Nesse ponto, o consumo de oxigênio deve aumentar devido a uma síntese de TP por meio da fosforilação oxidativa. Registre o sinal até que a respiração diminua, indicando um consumo de DP e transição para o registro de respiração do estado quatro.

Estado quatro, respiração por pelo menos um minuto. Adicionar o CCCP a uma concentração final de um micromolar e registar o sinal durante um minuto. Neste ponto, a respiração desacoplada deve ser máxima.

Calcule a taxa de controle respiratório dividindo a taxa de consumo de oxigênio durante o estado três. Respiração pela taxa de consumo de oxigênio durante o estado quatro, respiração um RCR alvo deve ser maior que quatro. Em seguida, para avaliar a integridade da membrana mitocondrial, induza a respiração do estado três em uma nova amostra de mitocôndrias, adicionando um DP a uma concentração final de um milimolar.

Em seguida, registre o consumo de oxigênio por um minuto, adicione 10 micromolares do citocromo C e registre o consumo de oxigênio por dois a três minutos. Como o citocromo C é impermeável às membranas mitocondriais intactas em uma boa preparação mitocondrial, não haverá aumento ou aumento muito pequeno na respiração. Um aumento na respiração indica membranas mitocondriais quebradas ou danificadas.

A instrumentação para a medição multiparâmetro da abertura da porta de transição de permeabilidade mitocondrial consiste em um computador de espectrofluorímetro de emissão dupla mestre quântico controlado pelo programa Felix GX. Usando o programa Felix GX, crie um protocolo de aquisição multidi e insira os parâmetros para a medição do potencial de membrana mitocondrial de cálcio e inchaço para os corantes métricos de razão, Forer e JC um geram os traços derivados para uma proporção e JC uma proporção em um tampão de ensaio de mitocôndrias ACRL vete de quatro lados descartável com uma concentração final de uma rotenona micromolar, cinco milimolares succinato e 800 nanomolares. Para um FF, adicionar 250 microgramas de mitocôndrias e colocar a amostra no compartimento de amostras do espectrofluorímetro.

Comece a gravar os sinais fluorescentes após um minuto, pause a aquisição, adicione 500 nanomolares JC um e reinicie a aquisição. O sinal de proporção JC de uma deve aumentar, indicando a absorção da matriz pelas mitocôndrias ativas. Continue gravando até que um sinal JC atinja um platô.

Normalmente, dentro de cinco minutos, adicione cloreto de cálcio a uma concentração final de 20 micromolares. Um aumento instantâneo no sinal da razão Fluor FF deve ser observado, representando aumento da presença de cálcio no tampão do ensaio, seguido por diminuição gradual devido à captação de cálcio mitocondrial. O sinal de razão JC one deve exibir uma breve diminuição transitória indicativa de leve despolarização da membrana mitocondrial.

Quando o sinal da razão ER FF retorna ao nível basal, geralmente dentro de um a 1.5 minutos em outros 20 micromolares de cloreto de cálcio, continue pulsando em intervalos fixos até que as mitocôndrias não possam acumular cálcio e comece a liberar cálcio no tampão do ensaio. A abertura da porta de transição da permeabilidade mitocondrial é visualizada pelo aumento simultâneo do sinal da razão URA FF devido à liberação de cálcio. Uma diminuição na razão de sinal JC um devido ao colapso do potencial de membrana e uma diminuição no espalhamento de luz devido ao inchaço mitocondrial mitocondrial enquanto isolado de C 56 camundongos Black Six J.

Conforme mostrado neste vídeo, o consumo de oxigênio foi medido durante a respiração do estado três na presença de succinato e um DP e durante a respiração do estado quatro após um consumo de DP, conforme mostrado aqui, uma adição de DP aumenta o consumo de oxigênio devido à fosforilação oxidativa e o consumo de oxigênio diminui. Uma vez que todo o DP tenha sido consumido, a resposta das mitocôndrias isoladas ao desacoplamento é medida pela adição de CCCP na presença de CCCP. A taxa de consumo de oxigênio é maior do que durante a respiração do estado três para avaliar a integridade da membrana das mitocôndrias isoladas.

O consumo de oxigênio foi medido na presença de succinato e um DP e após a adição de citocromo C.As visto aqui, a adição de citocromo C não aumenta significativamente o consumo de oxigênio em relação a um DP e succinato, indicando que membranas mitocondriais intactas não são permeáveis ao citocromo C para avaliar a transição de permeabilidade mitocondrial, má abertura em mitocôndrias cardíacas isoladas como um indicador da capacidade de retenção de cálcio mitocondrial. Transição de permeabilidade mitocondrial. A má abertura foi desencadeada por adições sequenciais de 20 micromolares.

Cloreto de cálcio, cálcio extra mitocondrial e potencial de membrana foram medidos com os indicadores métricos de razão. URA FF mostrado como o traço verde e JC um mostrado como o traço vermelho inchaço das mitocôndrias foi medido registrando o espalhamento de luz a 525 nanômetros mostrado pelo traço preto. A especificidade do JC um e os sinais de inchaço foram testados com um micromolar, CCCP e cinco microgramas por mililitro da toxina microbiana etina como pode ser visto aqui, a captação de cálcio pelas mitocôndrias é acompanhada por uma ligeira despolarização da membrana mitocondrial.

Após quatro pulsos de cálcio, a abertura da piscina de transição de permeabilidade mitocondrial é vista como um aumento na URA FF, indicando liberação de cálcio. Uma diminuição no JC um indicando colapso do potencial de membrana e um aumento no volume da matriz mitocondrial, que é visto como uma redução no espalhamento de luz como um marcador de inchaço para verificar a especificidade da abertura da porta de transição de permeabilidade mitocondrial. As mesmas medições foram realizadas na presença de ciclosporina A, que se liga ao componente de transição de permeabilidade mitocondrial PO ciclofillin D.As mostrado nesta figura, a presença de um ciclista micromolar perfurando A aumenta o número de pulsos de cloreto de cálcio necessários para abrir a transição de permeabilidade mitocondrial PO versus a amostra controle.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a abertura da porta de transição de permeabilidade mitocondrial em mitocôndrias cardíacas isoladas. O aspecto mais difícil deste procedimento é a obtenção de mitocôndrias isoladas de boa qualidade. Portanto, é importante realizar medições de controle de qualidade antes de usar as mitocôndrias para experimentos futuros.