Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

O objetivo deste vídeo é descrever um procedimento para caracterizar a transição de permeabilidade mitocondrial. Abertura deficiente em mitocôndrias isoladas do coração de camundongo. Primeiro, as mitocôndrias são isoladas dos corações de camundongos.

Utilizando o método de centrifugação diferencial, a qualidade das mitocôndrias isoladas é então avaliada com um eletrodo térmico de oxigênio conectado a um computador para medir a razão de controle respiratório e avaliar a integridade da membrana mitocondrial. Em seguida, com o uso de instrumentação espectrofluorométrica, a medição simultânea do manuseio de cálcio, do potencial da membrana mitocondrial e do volume mitocondrial é utilizada para determinar a transição de permeabilidade. Abertura inadequada.

Os dados resultantes mostraram diferenças na capacidade de retenção de cálcio e na transição de permeabilidade mitocondrial. Baixa sensibilidade de mitocôndrias isoladas, abertura da transição de permeabilidade mitocondrial. O poro é um fenômeno complexo que envolve alterações em diversos níveis da fisiologia e anatomia mitocondrial.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a medição de múltiplos parâmetros ao mesmo tempo oferece uma visão mais abrangente do fenômeno do que a medição de parâmetros individuais isoladamente, como cálcio, mobilização ou inchaço. Antes de iniciar o procedimento, descongele o tampão de isolamento mitocondrial e verifique o pH, que deve ser 7,4. Em seguida, coloque todos os tampões, placas e tubos que serão utilizados sobre gelo. Observe que todas as etapas do protocolo de isolamento de mitocôndrias devem ser realizadas sobre gelo.

Coloque os corações de camundongos eutanasiados em uma placa de Petri e remova qualquer sangue com tampão de isolamento de mitocôndrias frio. Em seguida, transfira os corações para uma nova placa de Petri usando uma lâmina, remova a gordura e as aurículas, e pique os corações até obter um produto homogêneo.

Transfira os corações picados para um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 10 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias com tripsina a 0,1 miligrama por mililitro e deixe a amostra digerir no gelo por 10 minutos. Observe que o uso de tripsina aumenta o rendimento de mitocôndrias isoladas e deve ser mantido constante entre os preparos mitocondriais.

No entanto, recomendamos testar a funcionalidade das mitocôndrias isoladas em preparações obtidas na ausência de tripsina para garantir que a enzima não interfira em seus íons. Após a incubação, adicione 10 mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias contendo 0,1% de BSA livre de ácidos graxos e cinco miligramas de inibidor de tripsina e misture invertendo o tubo várias vezes para neutralizar a tripsina. Recupere o tecido digerido por centrifugação de baixa a média velocidade durante um minuto a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, suspenda o tecido em oito mililitros de tampão de isolamento de mitocôndrias com BSA livre de ácidos graxos a 0,1%, mantendo a amostra em gelo. Utilize um homogeneizador motorizado com pistilo de teflon para homogeneizar a amostra com quatro a seis passagens a 1.200 a 1.400 rpm. Transfira o homogeneizado para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 800 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Para sedimentar os núcleos e os detritos teciduais. Após a centrifugação, recupere o sobrenadante contendo as mitocôndrias em tubos de microcentrífuga e centrifugue-os a 8.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o pellet apresentará uma camada branca na sua superfície.

Utilize um sistema de vácuo para aspirar e remover cuidadosamente a camada branca localizada acima do pellet mitocondrial. Em seguida, re-suspenda o pellet mais escuro remanescente, que contém as mitocôndrias, em um mililitro de tampão de isolamento de mitocôndrias.

Em seguida, centrifugue as mitocôndrias a 8.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet mitocondrial em 150 microlitros de tampão de isolamento de mitocôndrias, mantendo as mitocôndrias em gelo.

A respiração de mitocôndrias isoladas é medida com um eletrodo térmico de oxigênio conectado a um computador e controlado pelo software Oxy. O eletrodo de oxigênio deve ser calibrado no dia do experimento. Adicione dois mililitros de tampão de respiração mitocondrial contendo uma concentração final de um micromolar de rotenona à câmara do oxigrafador, feche a câmara e inicie o registro do sinal de oxigênio.

O sinal registrado pelo sistema e exibido na tela do computador é proporcional à concentração de oxigênio na câmara do oxitermômetro. Uma vez que o sinal de oxigênio esteja estável, adicione 250 microgramas de mitocôndrias e registre a respiração basal durante um minuto. Neste ponto, a respiração deve ser muito baixa, pois as mitocôndrias estão respirando sobre substratos endógenos.

Esta é a respiração no estado um. Adicione succinato até uma concentração final de cinco milimolares para iniciar a respiração mitocondrial no complexo dois e registre o sinal durante um minuto. O consumo de oxigênio deve aumentar durante a respiração no estado dois.

Para induzir a respiração no estado ativo, adicione um DP a uma concentração final de 150 micromolar. Neste ponto, o consumo de oxigênio deve aumentar devido à síntese de TP por fosforilação oxidativa. Registre o sinal até que a respiração diminua, indicando o consumo de DP e a transição para o registro da respiração no estado quatro.

Estado quatro, respiração por pelo menos um minuto. Adicione CCCP até uma concentração final de um micromolar e registre o sinal por um minuto. Neste ponto, a respiração desacoplada deve ser máxima.

Calcule a razão de controle respiratório dividindo a taxa de consumo de oxigênio durante o estado três pela taxa de consumo de oxigênio durante a respiração do estado quatro; uma RCR alvo deve ser maior que quatro. Em seguida, para avaliar a integridade da membrana mitocondrial, induza a respiração no estado três em uma nova amostra de mitocôndrias adicionando ADP a uma concentração final de um milimolar.

Em seguida, registre o consumo de oxigênio por um minuto, adicione citocromo C a 10 micromolar e registre o consumo de oxigênio por dois a três minutos. Como o citocromo C é impermeável às membranas mitocondriais intactas em um bom preparo mitocondrial, não haverá aumento ou haverá apenas um pequeno aumento na respiração. Um aumento na respiração indica membranas mitocondriais rompidas ou danificadas.

O instrumento para a medição multiparamétrica da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial consiste em um espectrofluorímetro dual de emissão quântica controlado por computador pelo programa Felix GX. Usando o programa Felix GX, crie um protocolo de aquisição multidi e insira os parâmetros para a medição do potencial da membrana mitocondrial, inchaço e cálcio para corantes ratiométricos, Forer e JC-1, gerando os traços derivados para a razão e a razão JC-1 em uma cubeta descartável de quatro faces de metacrilato. Misture um mililitro de tampão de ensaio de mitocôndrias com uma concentração final de um micromolar de rotenona, cinco milimolares de succinato e 800 nanomolares de Fora FF, adicione 250 microgramas de mitocôndrias e coloque a amostra na câmara de amostras do espectrofluorímetro.

Inicie a gravação dos sinais fluorescentes após um minuto, pause a aquisição, adicione 500 nanomolares de JC-1 e, em seguida, reinicie a aquisição. O sinal da razão de JC-1 deve aumentar, indicando a captação pela mitocôndria ativa. Continue a gravação até que o sinal de JC-1 tenha atingido um platô.

Normalmente dentro de cinco minutos, adicione cloreto de cálcio até uma concentração final de 20 micromolares. Deve-se observar um aumento instantâneo no sinal da razão do Fluor FF, representando o aumento da presença de cálcio no tampão do ensaio, seguido por uma diminuição gradual devido à captação mitocondrial de cálcio. O sinal da razão JC um deve exibir uma breve diminuição transitória, indicativa de leve despolarização da membrana mitocondrial.

Quando o sinal da razão ER FF retornar ao nível basal, geralmente dentro de um a 1,5 minutos com mais 20 micromolar de cloreto de cálcio, continue aplicando pulsos em intervalos fixos até que as mitocôndrias não consigam mais acumular cálcio e comecem a liberá-lo no tampão do ensaio. A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial é visualizada pelo aumento simultâneo do sinal da razão URA FF devido à liberação de cálcio. Uma diminuição na razão do sinal JC um devido ao colapso do potencial de membrana e uma redução no espalhamento da luz devido ao inchaço mitocondrial ocorrem enquanto as mitocôndrias são isoladas de camundongos C 56 black six J.

Como mostrado neste vídeo, o consumo de oxigênio foi então medido durante a respiração no estado três na presença de succinato e ADP e durante a respiração no estado quatro após o consumo de ADP. Como mostrado aqui, a adição de ADP aumenta o consumo de oxigênio devido à fosforilação oxidativa e o consumo de oxigênio diminui. Uma vez que todo o ADP tenha sido consumido, a resposta de mitocôndrias isoladas ao desacoplamento é medida pela adição de CCCP. Na presença de CCCP, a taxa de consumo de oxigênio é maior do que durante a respiração no estado três, a fim de avaliar a integridade da membrana das mitocôndrias isoladas.

O consumo de oxigênio foi medido na presença de succinato e ADP e após a adição de citocromo C. Como visto aqui, a adição de citocromo C não aumenta significativamente o consumo de oxigênio em relação ao ADP e succinato, indicando que as membranas mitocondriais intactas não são permeáveis ao citocromo C. Para avaliar a transição de permeabilidade mitocondrial, a abertura da porosidade em mitocôndrias isoladas de coração foi utilizada como indicador da capacidade de retenção de cálcio mitocondrial. A transição de permeabilidade mitocondrial. A abertura da porosidade foi desencadeada por adições sequenciais de 20 micromolares.

O cloreto de cálcio, o cálcio extramitocondrial e o potencial de membrana foram medidos com indicadores ratiométricos. A URA FF mostrada como o traço verde e a JC-1 mostrada como o traço vermelho. A inchação das mitocôndrias foi medida registrando a dispersão da luz a 525 nanômetros, indicada pelo traço preto. A especificidade dos sinais de JC-1 e inchação foi testada com um micromolar de CCCP e cinco microgramas por mililitro da toxina microbiana etina. Como pode ser visto aqui, a captação de cálcio pelas mitocôndrias é acompanhada por uma leve despolarização da membrana mitocondrial.

Após quatro pulsos de cálcio, a abertura da poro de transição de permeabilidade mitocondrial é observada como um aumento na FF de URA, indicando a liberação de cálcio. Uma diminuição na JC-1 indica o colapso do potencial de membrana e um aumento no volume da matriz mitocondrial, o que é visto como uma redução no espalhamento da luz como marcador de inchaço, para verificar a especificidade da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. As mesmas medições foram realizadas na presença de ciclosporina A, que se liga ao componente ciclofilina D do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. Como mostrado nesta figura, a presença de um micromolar de ciclosporina A aumenta o número de pulsos de cloreto de cálcio necessários para abrir o poro de transição de permeabilidade mitocondrial em comparação com a amostra controle.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a abertura da porina de transição de permeabilidade mitocondrial em mitocôndrias cardíacas isoladas. O aspecto mais difícil deste procedimento é obter mitocôndrias isoladas de boa qualidade. Portanto, é importante realizar medições de controle de qualidade antes de utilizar as mitocôndrias em experimentos adicionais.