Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando In utero Eletroporação

O objetivo deste procedimento é usar no útero, eletroporação, visualizar e manipular geneticamente dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo de camundongos. Isso é feito injetando primeiro o plasmídeo desejado, solução de DNA no ventrículo lateral dos embriões no útero. Em seguida, usando diferentes posições dos eletrodos Palo.

De acordo com a injeção de DNA, o córtex cerebral ou o hipocampo é eletroporado, então um estágio pós-natal ou adulto desejado. Os ratos são perfundidos e os cérebros são coletados. Finalmente, os cérebros são seccionados com um vibram.

Em última análise, dendritos e espinhos podem ser visualizados usando microscopia confocal. A técnica de eletroporação unitária apresenta várias vantagens em relação aos métodos de estudo não direito e da coluna vertebral. De fato, esta técnica permite primeiro estudar este aspecto diretamente in vivo.

Além disso, em comparação com a geração de camundongos knockout em operação elétrica é uma abordagem rápida para estudar o efeito da supressão gênica ou expressão gênica e don branco e espinha, não apenas na estrutura celular específica, mas também em um ponto específico de desenvolvimento. O uso de sistemas induzíveis na operação interelétrica também é uma ferramenta útil para identificar a interação funcional entre genes envolvidos na escrita e no desenvolvimento da coluna vertebral. De fato, ao contrário dos vírus, por exemplo, é difícil combinarmos vários genes HNA ou várias toneladas na mesma população de células Para começar a diluir o DNA até as concentrações desejadas em água e adicionar corante verde rápido a uma concentração final de 0,05%Use um micro extrator de perpet para puxar agulhas de vidro para injeção.

Coloque um camundongo prenhe em uma câmara de indução anestésica usando isde flúor e abra o oxigênio até dois litros por minuto. Quando o animal perder o reflexo de escrita, transfira-o para uma máscara pré-cirúrgica. Coloque uma gota de IGEL em cada olho e use um barbeador elétrico para raspar os pelos do abdômen.

Limpe a área raspada uma vez com clorexidina para coletar cabelos voadores. Transfira o animal para uma segunda máscara na área cirúrgica com as costas na almofada de aquecimento. Comece a cirurgia quando o reflexo da pétala for perdido.

Coloque uma máscara e luvas estéreis e cubra o animal com uma cortina estéril. Limpe a área raspada pelo menos três vezes com clorexidina. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical ao longo da linha média através da pele.

Usando uma tesoura. Faça uma incisão semelhante no músculo do abdômen ao longo do cotovelo linear. Escolhendo os embriões mais acessíveis.

Coloque uma pinça de anel entre dois embriões e puxe cuidadosamente a cadeia embrionária para fora da cavidade abdominal. Deste ponto em diante, mantenha os embriões hidratados com PBS pré-quente estéril. Usando pinça de anel.

Manipule suavemente a posição do embrião dentro do saco amniótico e estabilize a cabeça entre os anéis. Aperte suavemente para empurrar o embrião para mais perto da parede uterina. Com a outra mão, pegue o suporte capilar e insira cuidadosamente a agulha no meio do hemisfério para atingir o ventrículo lateral.

Tomando cuidado para minimizar o movimento da agulha na superfície da parede uterina e evitando perfurar os vasos sanguíneos, pressione o pedal para injetar cerca de 0,5 microlitros de solução de DNA verde. Coloque os eletrodos nas laterais da cabeça do embrião com o pedal positivo no mesmo lado do ventrículo injetado para eletroporação do córtex, ou no lado oposto do ventrículo injetado, a eletroporação do hipocampo. Em seguida, aplique cinco pulsos elétricos de 30 volts com duração de 50 milissegundos em intervalos de um segundo.

Evite aplicar corrente através da placenta, pois isso resultará na morte do embrião Para aumentar as chances de sobrevivência, injete e opere eletro todos os embriões em menos de 30 minutos quando concluídos no PBS, a cavidade abdominal, e use a pinça de anel para substituir o corno uterino em seu local original. Use suturas absorvíveis de vicryl para fechar o abdômen, a parede e a pele. Coloque o animal em uma câmara de recuperação até que ele acorde.

Em seguida, transfira-o para uma gaiola em uma almofada de aquecimento 24 e 48 horas após a cirurgia. Verifique o comportamento do camundongo para avaliar a dor, o sofrimento ou a angústia e pese o animal para analisar os cérebros. Nos estágios pós-natais, use um vibrador para seccionar previamente perfundido e pós-fixar cérebros montem as seções em aqua poly mount para visualizar dendritos e espinhos.

Esta figura mostra exemplos de células eletroporadas no córtex cerebral, o ca um e o giro dentado do hipocampo, enquanto os camundongos do tipo foram eletroporados em E 14.5, onde a construção GFP e os cérebros foram colhidos no dia 14 pós-natal. Ao injetar um pequeno volume de solução de DNA, algumas células são marcadas, o que permite a visualização da arborização dendrítica de células GFP positivas isoladas, bem como de seus espinhos em maior ampliação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de injetar um pequeno volume de DNA para atingir apenas algumas células e ser capaz de visualizar e quantificar o não escrever na coluna vertebral ou nos eletroneuros.