Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando

O objetivo deste procedimento é utilizar a eletroporação in utero para visualizar e manipular geneticamente dendritos e espinhas no córtex cerebral e no hipocampo de camundongos. Isso é realizado primeiramente injetando a solução de DNA/plasmídeo desejado no ventrículo lateral de embriões in utero. Em seguida, utilizando diferentes posições dos eletrodos Palo.

De acordo com a injeção de DNA, o córtex cerebral ou o hipocampo é eletroporado, em seguida, em estágios pós-natais ou adultos desejados. Os camundongos são perfundidos e os cérebros são coletados. Por fim, os cérebros são seccionados com um vibrosserrote.

Por fim, os dendritos e espinhos podem ser visualizados utilizando microscopia confocal. A técnica de eletroporação unitária apresenta várias vantagens em comparação com os métodos para estudar neuritos e espinhos. De fato, esta técnica permite, em primeiro lugar, estudar este aspecto diretamente in vivo.

Além disso, em comparação com a geração de camundongos knockout, a eletroporação é uma abordagem rápida para estudar o efeito da supressão ou expressão gênica em neurônios e espinhas dendríticas, não apenas em estruturas celulares específicas, mas também em um ponto específico do desenvolvimento. O uso de um sistema indutível na eletroporação in utero é também uma ferramenta útil para identificar interações funcionais entre genes envolvidos no desenvolvimento de neurônios e espinhas dendríticas. De fato, em contraste com vírus, por exemplo, é mais fácil para nós combinar múltiplos RNAs ou múltiplos genes em uma mesma população de células. Para começar, dilua o DNA até as concentrações desejadas em água e adicione corante azul de fenol a uma concentração final de 0,05%. Utilize um puxador de microeletrodos para puxar capilares de vidro para injeção.

Coloque um camundongo prenhe em uma câmara de indução anestésica usando isoflurano e abra o oxigênio até dois litros por minuto. Quando o animal perder o reflexo de escrita, transfira-o para uma máscara de pré-cirurgia. Coloque uma gota de IGEL em cada olho e use uma máquina de barbear elétrica para remover os pelos do abdômen.

Limpe a área raspada uma vez com clorexidina para recolher os pelos soltos. Transfira o animal para uma segunda máscara na área cirúrgica com seu dorso sobre a placa aquecida. Inicie a cirurgia quando o reflexo da pálpebra tiver desaparecido.

Coloque uma máscara e luvas estéreis e cubra o animal com um campo estéril. Limpe a área depilada pelo menos três vezes com clorexidina. Utilize um bisturi para fazer uma incisão vertical ao longo da linha média através da pele.

Usando tesoura, faça uma incisão semelhante no músculo do abdômen ao longo do cotovelo linear. Escolha os embriões mais acessíveis.

Coloque a pinça anelar entre dois embriões e retire cuidadosamente a cadeia embrionária da cavidade abdominal. A partir deste momento, mantenha os embriões hidratados com PBS pré-aquecido e estéril. Utilizando a pinça anelar.

Manipule suavemente a posição do embrião dentro do saco amniótico e estabilize a cabeça entre os anéis. Aperte levemente para empurrar o embrião para cima, aproximando-o da parede uterina. Com a outra mão, pegue o suporte do capilar e insira cuidadosamente a agulha no meio do hemisfério, visando o ventrículo lateral.

Tendo cuidado para minimizar o movimento da agulha na superfície da parede uterina e evitando perfurar vasos sanguíneos, pressione o pedal para injetar cerca de 0,5 microlitros de solução verde de DNA. Coloque os eletrodos nos lados da cabeça do embrião, com o pedal positivo no mesmo lado do ventrículo injetado para eletroporação do córtex, ou no lado oposto ao ventrículo injetado, para eletroporação do hipocampo. Em seguida, aplique cinco pulsos elétricos de 30 volts com duração de 50 milissegundos em intervalos de um segundo.

Evite aplicar corrente elétrica através da placenta, pois isso resultará na morte do embrião. Para aumentar as chances de sobrevivência, injete e eletropore todos os embriões em menos de 30 minutos. Após a conclusão no PBS, a cavidade abdominal e use a pinça em forma de anel para reposicionar o corno uterino em sua localização original. Utilize suturas absorvíveis de vicryl para fechar a parede abdominal e a pele. Coloque o animal em uma câmara de recuperação até que acorde.

Em seguida, transfira-o para uma gaiola sobre uma almofada aquecida 24 e 48 horas após a cirurgia. Verifique o comportamento do camundongo para avaliar dor, sofrimento ou estresse, e pese o animal para analisar os cérebros. Em estágios pós-natais, use um vibratomo para seccionar cérebros previamente perfundidos e pós-fixados, monte os cortes em aqua poly mount para imagens de dendritos e espinhos.

Esta figura mostra exemplos de células eletroporadas no córtex cerebral, no córtex entorrinal e no giro denteado do hipocampo, enquanto camundongos do tipo selvagem foram eletroporados no dia E14,5, momento em que o construto GFP e os cérebros foram coletados no 14º dia pós-natal. Ao injetar um pequeno volume de solução de DNA, poucas células são marcadas, o que permite a visualização da arborização dendrítica de células isoladas positivas para GFP, bem como de seus espinhos em maior aumento. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de injetar um pequeno volume de DNA para direcionar apenas algumas poucas células, e para poder visualizar e quantificar os espinhos dendríticos ou os neurônios eletroporados.