Uma avaliação quantitativa da migração celular pelo ensaio Phagokinetic faixa Motilidade

O objetivo geral deste procedimento é ser capaz de medir quantitativamente a motilidade celular ao longo do tempo usando um ensaio de motilidade celular baseado em nanopartículas de ouro. Isso é feito preparando primeiro lamínulas de vidro para um revestimento de nanopartículas de ouro. Especificamente, as lamínulas livres de endotoxinas são revestidas com gelatina e depois assadas.

O segundo passo é reduzir o ácido cloroúrico, que criará nanopartículas de ouro e revestir as lamínulas revestidas de gelatina uniformemente com a solução. Em seguida, as células são colocadas nas lamínulas de revestimento de nanopartículas de ouro para o período de tempo desejado das células do experimento. Seguindo em frente, a gelatina deslocará as nanopartículas de ouro criando trilhas.

A etapa final é o monitoramento e quantificação da motilidade celular usando microscopia para obter imagens dos rastros criados pelas células em movimento. Em última análise, as medições de área dos trilhos são realizadas usando software disponível gratuitamente. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a imagem de lapso de tempo, é que esse ensaio requer apenas um microscópio de luz padrão, uma câmera padrão e usa software de imagem disponível gratuitamente.

Além disso, o ensaio também permite facilmente a análise e comparação de várias amostras usando um metodista capaz de triagem de alto rendimento. Embora esse método possa fornecer informações sobre a influência de diferentes fatores fisiológicos e movimento celular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os estudos sobre os efeitos que os patógenos têm na motilidade das células infectadas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque os métodos exigem que se siga rigorosamente os volumes e temperaturas indicados no protocolo.

Neste protocolo, a ênfase é colocada na avaliação da cor da solução final de nanopartículas de ouro precipitadas para garantir o sucesso. A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas do ensaio de motilidade cinética da trilha FGO são difíceis de aprender.

Eles contêm vários procedimentos não comumente usados em laboratórios de biologia celular e molecular. Para preparar lamínulas revestidas de gelatina, primeiro Resus suspenda a gelatina e a água deionizada para fazer a solução com uma concentração final de 0,5 gramas por 300 mililitros e, em seguida, autoclave a mistura por 15 a 30 minutos. É importante fazer isso dentro de duas horas após a adição da gelatina em uma capa de cultura de tecidos.

Prepare as lamínulas para o revestimento transferindo primeiro oito a nove lamínulas lavadas com ácido para um prato de plástico de 100 milímetros. Certifique-se de que as lamínulas não estejam tocando umas nas outras ou nas laterais do prato. Pipete cuidadosamente duas a três gotas de gelatina em cada lamínula, evitando transbordar para o prato.

Em seguida, coloque o prato contendo as lamínulas revestidas de gelatina em um forno e leve ao forno a 90 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, retire o prato do forno e coloque-o de volta no lenço de papel. Capuz de cultura.

Pipete suavemente o excesso de gelatina. Retorne o prato ao forno e seque as lamínulas a 70 graus Celsius por 45 minutos. Assim que as lamínulas estiverem secas, retire o prato do forno e coloque-o de volta na capa de cultura de tecidos.

Usando uma agulha estéril delicadamente, levante um lado da lamínula. Em seguida, use uma pinça estéril para remover as lamínulas revestidas de gelatina do prato e coloque-as em poços separados de uma placa de 24 poços. O próximo passo é preparar lamínulas revestidas de ouro coloidal.

Comece preparando 10 mililitros de solução de citrato de sódio a 0,5% trabalhando em uma capa de cultura de tecidos combinada com 1,5 mililitros da solução de ácido cloro ORIC 14,5 milimolar e 13,5 mililitros de água deionizada em autoclave em um frasco erlenmeyer livre de endotoxinas estéreis Para cada oito a nove lamínulas, o resultado deve produzir uma solução amarela fraca. O ácido cloro ORIC é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Também é sensível à luz, portanto, a etapa de fervura deve ser realizada em um ambiente com pouca luz.

Quando a solução atingir o ponto de ebulição, retirar o balão da placa de aquecimento e transferi-lo para uma placa de agitação. Para formar as partículas de ouro coloidal em solução, adicione 0,7 mililitros da solução de citrato de sódio a 0,5% por 15 mililitros da solução de ácido cloro ORIC enquanto agita, continue mexendo por aproximadamente dois minutos. Durante esse tempo, a solução mudará de um amarelo fraco para claro, cinza, roxo e roxo profundo.

Antes de finalmente chegar a um vinho tinto ou de preferência cor de ferrugem, retire a solução de ouro coloidal em uma pipeta de 10 mililitros e deixe a solução esfriar na pipeta por um a dois minutos até atingir a temperatura ambiente. Em seguida, adicione 0,5 a um mililitro em cima das lamínulas revestidas de gelatina na placa de 24 poços Coloque a placa de 24 poços contendo as lamínulas cobertas de ouro coloidal em uma incubadora a 37 graus Celsius e incube por 30 minutos. Depois que as partículas tiverem tempo de se depositar nas lamínulas revestidas de gelatina, verifique sua densidade em um microscópio óptico.

A distribuição apropriada de nanopartículas de ouro ajuda a distinguir de forma fácil e eficiente as bordas dos caminhões solares. A densidade ideal varia com o tamanho da célula. Uma concentração de partículas de ouro muito alta dificulta a capacidade das células de se moverem, enquanto uma concentração de partículas de ouro e ouro muito baixa limita a capacidade de delinear uma faixa precisa de motilidade.

Por esta razão, apenas lamínulas feitas no mesmo lote ou que tenham a mesma densidade devem ser usadas em conjunto em experimentos individuais. Se a concentração de partículas de ouro for insuficiente, adicione mais 0,5 a um mililitro da solução de ouro coloidal às lamínulas revestidas de gelatina. Se, no entanto, a concentração de partículas de ouro for muito alta, como no caso mostrado aqui, a única opção eficaz é refazer a solução de ouro coloidal e revestir novas lamínulas.

Se a densidade das partículas estiver correta, retorne a placa à incubadora a 37 graus Celsius e incube por uma hora para enxaguar durante a noite as partículas de ouro não ligadas, mergulhando as lamínulas três vezes em solução salina tamponada com fosfato estéril. Em seguida, armazene as lamínulas revestidas de ouro coloidal em poços preenchidos com PBS de uma placa limpa de 12 poços a quatro graus Celsius até que estejam prontas para serem usadas. As lamínulas não devem secar e devem ser usadas dentro de dois a três meses a partir da data em que foram feitas.

O próximo passo é preparar as lamínulas revestidas de ouro coloidal para cultura de células. Comece colocando-os em poços individuais de uma placa de 24 poços que tiveram aproximadamente 0,3 mililitros de meios de cultura adicionados antes da adição das lamínulas de cobertura transferem aproximadamente 5.000 a 50.000 células para cada lamínula revestida de ouro coloidal. O número de células varia de acordo com o tipo de célula, mas a densidade celular deve ser baixa o suficiente para evitar a sobreposição de trilhas de células de várias células na mesma área.

Cubra a placa e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis a 24 horas Com base na motilidade do tipo de célula, o prazo ideal deve ser determinado experimentalmente para cada tipo de célula após a incubação, corrija quaisquer lamínulas que não serão analisadas imediatamente, mergulhando-as primeiro duas vezes em PBS seguidas de incubação em 3% para formaldeído por 15 minutos em temperatura ambiente usando um imagens de captura de luz dos trilhos criados por uma única célula móvel em lamínulas fixas ou não fixas. A ampliação usada para tirar fotos de rastros celulares varia dependendo do tipo de célula. No entanto, a mesma ampliação deve ser usada para cada estudo para poder comparar os resultados.

Para monócitos, a ampliação de 40 x funciona bem usando o software disponível gratuitamente, como imagem, imagem JNIH ou ferramenta de imagem, determine a área média de ouro coloidal limpa por 10 a 20 ou mais células para cada amostra das imagens capturadas mostradas aqui é o caminho limpo de partículas de ouro coloidal por um único monócito não estimulado tirado com uma objetiva de 40 x. As células imóveis criam pequenas trilhas ovais ou circulares características ao seu redor, o que indica um baixo nível de movimento vassalo. Em contraste, as células altamente móveis são caracterizadas por um movimento direcional como tratos alongados e áreas gerais maiores devido às suas formas irregulares.

As trilhas de células são melhor analisadas usando a ferramenta à mão livre no software Image J para delinear seu volume. As medições quantitativas da área podem ser realizadas usando a ferramenta de medição no menu de análise da Imagem J. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir rigorosamente os volumes e temperaturas indicados no protocolo, pois os desvios podem influenciar fortemente os resultados finais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar lamínulas revestidas com gelatina, como preparar nanopartículas de ouro e lamínulas revestidas com nanopartículas de ouro e como monitorar e avaliar quantitativamente o movimento celular usando uma microscopia de luz.

Não se esqueça de que trabalhar com as soluções de ebulição em uma placa quente, especialmente os vapores da solução de ebulição de flúor, ácido AIC e citrato de sódio, podem ser precauções perigosas, como trabalhar no exaustor e usar o bom senso, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.