Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

O objetivo geral deste procedimento é isolar músculos saudáveis e intactos para estudar a função contrátil in vitro. Isso é realizado primeiramente isolando-se o extensor digitorum longus ou EDL e o músculo sóleo ou sóleo do camundongo. O segundo passo é amarrar os ligamentos e tendões dos músculos EDL e sóleo com fio cirúrgico.

Em seguida, monte os músculos isolados no transdutor de força e na câmara contrátil. O passo final é estimular o músculo com pulsos elétricos de campo para induzir contrações. Por fim, as forças resultantes são transmitidas ao transdutor de força e registradas; diversas manipulações fisiológicas e farmacológicas podem ser realizadas para comparar seus efeitos sobre a contratilidade muscular.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para avaliar a função muscular, como a medição da contratilidade in situ, o desempenho masculino, entre outros, é que este método remove os componentes neuronais e vasculares do músculo esquelético, permitindo a avaliação direta da propriedade intrínseca do músculo contrátil. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois a dissecação de músculos epiteliais intactos exige destreza manual e paciência demonstradas. Este procedimento será realizado por um técnico em meu laboratório e por Keyhole Park, pesquisador pós-doutorando no laboratório do Dr. Jma.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a dissecação muscular e a montagem na câmara contrátil são difíceis de realizar. Assim, este vídeo auxilia na compreensão da estrutura anatômica do músculo e na apreciação da escala necessária para a montagem do músculo isolado. Neste procedimento, sacrifique um camundongo selvagem C57 black six ou um modelo de camundongo de doença por dislocação cervical e posicione-o em posição lateral.

Para dissecar o EDL, faça uma incisão superficial na pele. Corte a fáscia entre a tíbia anterior e o grupo muscular posterior. Localize a origem proximal onde o ligamento está conectado ao côndilo lateral da tíbia e à superfície anterior da fíbula, nos três quartos superiores.

Em seguida, corte o ligamento com tesoura oftálmica delicada o mais distante possível do músculo para liberar a origem proximal do músculo EDL. Depois disso, segure o ligamento com um par de pinças rombas e puxe-o lentamente para soltar o EDL. Pode ser necessário cortar parte do paramecium ao redor do EDL e de outros músculos próximos ao EDL.

Esta etapa deve ser realizada com delicadeza para evitar danos ao músculo EDL. Em seguida, na região de inserção onde os quatro tendões distais se inserem nas falanges médias e distais dos dedos dois a cinco, corte os tendões o mais distante possível dos músculos. Transfira o músculo EDL isolado para um recipiente de dissecação contendo solução de Tyro isotônica sem cálcio.

O músculo EDL é um músculo rápido e glicolítico, com cor branca rósea pálida, comprimento de cerca de 10 a 13 milímetros e peso de oito a 11 miligramas. Em seguida, amarre um nó cirúrgico firmemente em ambas as extremidades do músculo EDL isolado com sutura número seis, o mais distante possível do músculo e ligeiramente acima do ponto médio ao longo do comprimento do ligamento ou tendão. Depois, transfira o músculo EDL para a câmara do banho tecidual saturada com oxigênio.

Monte o músculo no sulco da amostra do transdutor de força e no gancho fixo na parte inferior da câmara de banho. Repita o processo de isolamento e montagem para o músculo EDL da outra perna para dissecar o sóleo na face lateral posterior da perna. Afaste o músculo gastrocnêmico que normalmente o recobre.

O sóleo é um músculo oxidativo lento com coloração vermelho-escura, cerca de um milímetro mais curto que o EDL, mas pesa ligeiramente mais que o EDL. Na origem proximal, corte o ligamento que se conecta à metade proximal da tíbia posterior ao longo da linha do sóleo e ao terço proximal da fíbula posterior.

A seguir, no local de inserção distal, corte o tendão calcâneo que se insere no calcâneo posterior. Libere cuidadosamente o músculo sóleo posteriormente. Monte adequadamente o músculo sóleo na câmara do banho.

Uma vez que os músculos estejam montados em câmaras individuais de banho tecidual, inicie o registro dos dados. Lembre-se de zerar a linha de base do transdutor de força. Isso facilitará a observação das alterações na linha de base e simplificará a comparação das contrações musculares entre diferentes condições experimentais.

Em seguida, estimule os músculos isolados com pulsos de onda quadrada. Utilize correntes elétricas variando de 60 a 300 miliampères, durações individuais do pulso de onda quadrada entre 0,3 e um milissegundo e durações do trem de estímulos de 350, 500 ou 1000 milissegundos. O próximo passo é selecionar uma frequência de estimulação capaz de produzir força tética máxima quando o músculo isolado estiver esticado em seu comprimento ótimo à temperatura ambiente.

Essa frequência é tipicamente de cerca de 100 hertz para o EDL e 60 hertz. Para o sóleo, estique o músculo lentamente e aguarde 30 segundos, depois o estime a 100 hertz ou 60 hertz. Após isso, estique-o novamente.

Aguarde mais 30 segundos e estimule novamente após o alongamento. Se a força não aumentar mais, normalmente significa que a força máxima foi atingida. Enquanto isso, ao longo de ciclos repetidos de alongamento e estimulação, a diminuição da força sugere que os músculos foram excessivamente alongados. Nessa situação, libere o músculo até o nível de alongamento anterior e estime o músculo novamente até que a força máxima seja observada.

Agora, obtenha a relação força versus frequência. Estimule o músculo com frequências de um a 140 hertz, com incrementos de cinco a 10 hertz e periodicidade de 30 a 60 segundos. Ao realizar os experimentos a 25 graus Celsius, quando os experimentos forem realizados a 37 graus Celsius, estenda a FF a frequências mais altas, até 300 hertz para o músculo diafragma, 180 a 200 hertz para sóleo e 220 a 250 hertz para EDL.

Em seguida, comparando a quantidade de força gerada por cada frequência de estimulação, identifique a frequência que gera força tética máxima e aproximadamente metade da força tética máxima. O Tmax fornece informações importantes sobre a modulação da maquinaria contrátil. Enquanto isso, o meio Tmax fornece informações mais pertinentes à regulação do cálcio e ao processo de ECC.

O músculo é então estimulado com frequência tmax em intervalos de um minuto durante 30 minutos, um processo denominado equilíbrio, para estudar a contribuição do retículo sarcoplasmático. A liberação de cálcio para a contratilidade muscular após a fadiga de equilíbrio é avaliada mediante estímulos de metade da Tmax em intervalos de dois segundos durante cinco minutos. Utilizamos aqui uma duração do trem de estímulos de 500 milissegundos, e portanto o ciclo de trabalho é de 25%. Em seguida, recupera-se o músculo com metade da Tmax em intervalos de um minuto.

Por 30 minutos ou até que a força esteja estável, pode-se realizar um protocolo adicional de fadiga. Atualmente, acredita-se que a fadiga com tmax em Tmax testa com precisão o estado da maquinaria contrátil. Em seguida, repita os procedimentos para obtenção de FF, de modo que as diferenças fenotípicas entre diferentes linhagens, modelos de doenças ou tratamentos com fármacos possam ser observadas.

Ao analisar a FF antes e após a fadiga para investigar a contribuição da entrada de cálcio extracelular na contratilidade muscular, a solução de banho pode ser substituída por uma solução sem cálcio, mas contendo 0,1 milimolar de EGTA. Alternativamente, diferentes bloqueadores de canais ativados por esvaziamento de reservatórios podem ser aplicados na solução de banho. Ao final do experimento, meça o comprimento experimental dos músculos, pese-os individualmente em uma balança analítica, congele-os rapidamente em nitrogênio líquido e armazene-os a menos 80 graus Celsius para análises bioquímicas.

Agora, calibre o transdutor de força. Converta a força muscular registrada em milivolts para força em gramas com base nos resultados da calibração. Em seguida, normalize-a à área fisiológica da seção transversal.

Esta figura mostra as forças contráteis induzidas por cinco hertz, 20 hertz e força titânica máxima; aqui se observa um traçado da força contrátil de um músculo lesionado. Este é um exemplo representativo que mostra as contrações individuais de uma relação força versus frequência no músculo EDL e a curva plotada resultante da ff. Este é um perfil típico de fadiga de declínio rápido do músculo EDL e um perfil de fadiga de declínio lento do músculo sóleo.

A estimulação fatigante leva ao aparecimento de alternâncias mecânicas em um músculo submetido a um procedimento de eliminação com propriedades alteradas no manuseio de cálcio. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas. Se for executada corretamente, todo o experimento terá uma duração maior e dependerá do número de intervenções realizadas. Enquanto você realiza este procedimento, é muito importante isolar e montar o músculo DL o mais rápido possível, pois o ambiente in vitro com baixo oxigênio pode causar danos irreversíveis ao músculo rápido.

Após este procedimento, análises genéticas, western blot, imuno-histoquímica e estudos estruturais podem ser realizados nos mesmos músculos experimentais para responder perguntas adicionais. Por exemplo, o nível de expressão e a localização de uma proteína específica ou de componentes das proteínas musculares que regulam a contratilidade ou a sinalização de cálcio, bem como alterações morfológicas ou ultraestruturais nos músculos resultantes de uma condição específica após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da fisiologia muscular explorarem defeitos genéticos que afetam a função do músculo esquelético em diversos modelos, incluindo camundongos, ratos e hamsters.