Name: Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprenda a avaliar força, potência e fadiga em músculos esqueléticos isolados de camundongos usando estimulação de campo. Este método permite analisar propriedades contráteis e manuseio de cálcio in vitro.

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Este trabalho foi financiado pela AHA SDG 10SDG2630086 de Zhao X, RO1-AR061385 a Ma J e Grant GO RC2AR05896 para Brotto M.

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<li>Brotto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+maintenance+of+intracellular+Ca2%2B+homeostasis+is+linked+to+increased+muscle+fatigability+in+the+MG29+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Defective maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis is linked to increased muscle fatigability in the MG29 null mice.</a> Cell Res. 14, 373-378 (2004).</li>
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<li>Ringer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+contribution+regarding+the+influence+of+the+different+constituents+of+the+blood+on+the+contraction+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A further contribution regarding the influence of the different constituents of the blood on the contraction of the heart.</a> J. Physiol. 4, 29-42.3 Forthcoming.</li>
<li>Ringer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+experiments+regarding+the+influence+of+small+quantities+of+lime%2C+and+other+salts+on+muscular+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Further experiments regarding the influence of small quantities of lime, and other salts on muscular tissue.</a> J. Physiol. 7, 291-308 Forthcoming.</li>
<li>Ringer, S., Buxton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerning+the+action+of+calcium%2C+potassium+and+sodium+salts+upon+the+eel%27s+heart+and+upon+the+skeletal+muscles+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concerning the action of calcium, potassium and sodium salts upon the eel's heart and upon the skeletal muscles of the frog.</a> J. Physiol. 8, 15-19 Forthcoming.</li>
<li>Ringer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regarding+the+action+of+lime%2C+potassium+and+sodium+salts+on+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regarding the action of lime, potassium and sodium salts on skeletal muscle.</a> J. Physiol. 8, 20-24 (1887).</li>
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<li>Brotto, M. A., Nosek, T. M., Kolbeck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ageing+on+the+fatigability+of+isolated+mouse+skeletal+muscles+from+mature+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of ageing on the fatigability of isolated mouse skeletal muscles from mature and aged mice.</a> Exp. Physiol. 87, 77-82 (2002).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+store-operated+Ca2%2B+entry+in+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Compromised store-operated Ca2+ entry in aged skeletal muscle.</a> Aging Cell. 7, 561-568 (2008).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
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<li>Brotto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+fatigue-induced+modification+of+function+and+proteins+in+intact+and+skinned+murine+diaphragm+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and fatigue-induced modification of function and proteins in intact and skinned murine diaphragm muscle.</a> Pflugers Arch. 440, 727-734 (2000).</li>
<li>Smith, M. A., Reid, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+modulation+of+contractile+function+in+respiratory+and+limb+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Redox modulation of contractile function in respiratory and limb skeletal muscle.</a> Respir Physiol Neurobiol. 151, 229-241 (2006).</li>
<li>Bagni, M. A., Cecchi, G., Colomo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofilament+spacing+and+force+generation+in+intact+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myofilament spacing and force generation in intact frog muscle fibres.</a> J. Physiol. 430, 61-75 (1990).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Medição da força contráctil e fatigabilidade é importante para a avaliação global da função do músculo esquelético. O principal objetivo deste ensaio é identificar alterações na força muscular e propriedades fatigantes sob certas condições patológicas, como sarcopenia e fadiga muscular, e para testar o efeito de drogas / reagentes sobre a contratilidade muscular. Desde que a força muscular está intimamente relacionada com o Ca 2 + intracelular lançamento, extracelular Ca 2 + e entrada do crosstalk ...

Os músculos esqueléticos anexar a ossos do esqueleto e gerar forças contrácteis sob o controlo do sistema nervoso central. Acoplamento excitação-contração (ECC) refere-se ao processo de conversão de um estímulo eléctrico a uma resposta mecânica. Ca 2 + de sinalização é um componente essencial da função contráctil do músculo esquelético. Eficaz a mobilização de Ca 2 + do retículo sarcoplasmático (RS) é um componente importante para ECC em células musculares 1, 2, e mudanças no Ca 2 + intracelular de sinalização estão subjacentes à disfunção contráctil correspondente numa série de doenças musculares 3-5. Avaliação adequada da contratilidade muscular é essencial e complementar ao Ca 2 + de imagem e outros ensaios para obter insights sobre a função do músculo esquelético, não apenas no nível de contração, mas também ao nível cinética. Força e velocidade também pode ser obtido a informar a propriedade importante deforça muscular e do estado do processo de ECC em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas. Este campo fecundo de pesquisa tem uma história muito rica e muitas teorias de contração muscular apareceu mais de dois milênios 6. Pesquisa muscular moderna provavelmente começa em 1674-1682 com a observação microscópica de cross-estrias e miofibrilas nas fibras musculares por Leeuwenhoek 6. Quase um século depois, Luigi Galvani observou que os contratos musculares sapo vigorosamente quando seu nervo é tocado com bisturi durante uma descarga de centelha de uma máquina elétrica distante 7-9. Contracção pode também ser produzida através da ligação do nervo para o músculo da perna por meio de um condutor metálico. Os detalhes do mecanismo de sinalização elétrica complexa defendidas por Galvani foram eventualmente formulado por Hodgkin, Huxley e Katz em sua famosa equação 10, 11, que se tornou a base de eletrofisiologia. As observações notáveis ​​de Ringer sobre os efeitos do Ca 2 + extracelular sobre a contractilidade do coração e músculos esqueléticos rã 12-15 representam o primeiro passo importante no reconhecimento de Ca 2 + como um regulador chave da contractilidade do músculo 16, 17. A partir da década de 1980 até os dias atuais uma explosão de descobertas no campo da contratilidade muscular foi realizado devido à introdução de contratilidade muscular e protocolos fatigabilidade em murinos músculos esqueléticos 18. Jones e Edwards foram os primeiros a sugerir que a fadiga de baixa freqüência intermitente (induzida pelo exercício diminuição da força) 19 foi associado a alterações no maquinário ECC e não o aparato contrátil. No final dos anos 1980 e início de 1990, Kolkeck et al 20, Kolbeck e Nosek 21, e Reid 22 foram usar o músculo diafragma de modelos de roedores para estudar os efeitos da teofilinas, cortiosterone, e radicais livres sobre a contratilidade muscular, enquanto Brooks e Faulkner foram os primeiros a informar sobre as medidas de força repetida e medições de potência em fast-e-lento músculos de ratos 22. Além disso, Lannegren, Westerblad, Cordeiro e Westerblad foram os primeiros a ligar diretamente contratilidade ex vivo com Ca 2 + intracelular regulação e começou a questionar o papel da acidose em fadiga muscular 23, 24. Nossos laboratórios têm contribuído significativamente desde o início de 2000 para a compreensão de novos genes com modulador e funções de regulação no músculo ECC com papéis críticos da contratilidade muscular, cansaço e envelhecimento, usando uma combinação de intactas rato estudos de contratilidade muscular, intracelular de Ca 2 monitoramento + em intactas e sem pele fibras musculares e molecular-genéticos manipulações 3-5, 25-29. Aqui nós mostramos o protocolo experimental para medir a contratilidade de murinos sóleo isolados e longus extensor dos dedos (EDL) dos músculos, o que corresponde a uma maior parte slow-oxidativo (tipo I e IIa fibras musculares) e um músculo principalmente fast-glyocolytic (tipo IIb e fibras musculares IIx) com distintas propriedades contrácteis. Neste protocolo, intactas músculo-tendão complexos foram isolados e banhado numa Radnotti PowerLab ADI sistema de câmara fornecido com ou oxigénio puro ou uma mistura de oxigénio (95%) e CO2 (5%). Forças contrácteis foram gerados por estímulos eléctricos a partir de um estimulador Grass e detectado utilizando um transdutor de força que foi integrado com um sistema de PowerLab/400 ADI, o que permite a personalização de rotinas de macro para controlar a aquisição, a recolha, a digitalização e armazenamento de dados. Esta configuração pode medir a força muscular, força muscular, assim como a relação força versus frequência, fadiga muscular, a recuperação da fadiga muscular, velocidade e propriedades cinéticas totais de contração muscular. Além disso, os efeitos de drogas sobre a contração do músculo pode ser monitorado através destas experiências. </p&gt; As vantagens deste método reside na remoção dos componentes neuronais e vasculares de distância a partir do músculo esquelético, o que permite avaliar directamente as propriedades intrínsecas de contrair o músculo. Além disso, os ensaios de contratilidade ex vivo permite que a manipulação do meio extracelular em torno dos músculos isolados, o que permite o uso de manipulações farmacológicas de vários canais de iões e transportadores de permeação, de modo a definir os seus papéis fisiológicos para a função do músculo esquelético. Este sistema ex vivo nos permitiu descobrir recentemente um comportamento distinto alternano em certas preparações de músculo mutantes, que estavam ligados a alteração do Ca 2 + intracelular manipulação propriedades 4. Alternans são definidos como episódios de ruptura flutuação de força contrátil durante a fase de declínio do perfil fatigante. Durante esses eventos forças contráteis aumentar momentaneamente acima de seu nível anterior de força durante estimulação cansativo, talvez porque seja mais Ca 2 + está sendo lançado ou a maquinaria contrátil tornou-se mais sensível ao Ca + 30 2. Tratamento de ciclopiazônico ácido (CPA), um bloqueador reversível da sarcoplasmático-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), cafeína, um agonista de rianodina canal (RYR) e repetiu fatigante estímulos podem induzir a alternância mecânica 4, sugerindo que a alternância estão diretamente relacionados à modulação do processo de acoplamento CE. Demonstração do método de induzir e gravar alternância mecânico in vitro configuração contratilidade serve como um exemplo para mostrar os parâmetros diversificados experimentais que poderiam ser obtidos com este sistema ou similares, com base em interesses de pesquisa individuais. Este método pode ser de interesse para os investigadores que estudam a fisiologia muscular. Configuração similar pode também ser usado para os complexos isolados de outros muscle-tendon/ligament esqueléticoslocalizações anatómicas, assim como para as fibras individuais e as tiras musculares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> 2-APB </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td> Bloqueador de um certo número de canais de Ca 2 + e de entrada, incluindo TRP, etc SOC </td></tr><tr><td> SKF96365 </td><td> Sigma </td><td> SKF-96365 </td><td> Bloqueador de um certo número de canais de Ca 2 + de entrada incluindo SOC e mediada pelo receptor de entrada de Ca 2 +, etc </td></tr><tr><td> BTP-2 </td><td> Millipore </td><td> 203.890-5mg </td><td> Relativamente específica bloqueador SOC </td></tr><tr><td> CPA </td><td> Sigma </td><td> C1530 </td><td> SERCA bloqueador reversível </td></tr><tr><td> cafeína </td><td> Sigma </td><td> C0750 </td><td> Agonista RYR ação rápida </td></tr><tr><td> Quatro Radnoti Unidade Tissue Organ Sistema Bath </td><td> Radnoti </td><td> 159920 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte combinação tecido / Eletrodo Estimular </td><td> Radnoti </td><td> 160151 </td><td> Vertical Tipo Zig Zag com suporte de tecido </td></tr><tr><td> Quad Ponte Amp </td><td> ADInstruments </td><td> FE224 </td><td></td></tr><tr><td> PowerLab/400 </td><td> ADInstruments </td><td></td><td> Este produto não está mais disponível. Escolha outra versão do sistema de aquisição de dados. </td></tr><tr><td> Os transdutores de força (5 mg - 25 g) </td><td> ADInstruments </td><td> MLT0201/RAD </td><td></td></tr><tr><td> Gráfico v4.02 </td><td> ADInstruments </td&gt; <td></td><td> LabChart 7.3 é a versão mais recente do software gráfico. </td></tr><tr><td> S8800 dupla Pulso Digital Estimulador </td><td> TECNOLOGIAS DE GRAMA </td><td></td><td> Este produto não está mais disponível. S88X dupla saída de pulso quadrado Stimulator é um novo estimulador. </td></tr><tr><td> RF Unidade Transformador de isolamento </td><td> TECNOLOGIAS DE GRAMA </td><td> Modelo SIU5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação ex vivo de fatigabilidade contratilidade e alternans em músculos esqueléticos isolados

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Descrito aqui é um método para medir a contratilidade dos músculos esqueléticos isolados. Parâmetros, tais como a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis, fatigabilidade ea recuperação após a fadiga pode ser obtido para avaliar aspectos específicos do acoplamento excitação-contração (ECC) do processo, como a excitabilidade, máquinas contrátil e Ca 2 + capacidade de manipulação. Este método remove o suprimento nervoso e sangue e se concentra sobre o músculo esquelético isolado em si. Rotineiramente usar esse método para identificar os componentes genéticos que alteram a propriedade contrátil do músculo esquelético embora modulação Ca 2 + vias de sinalização. Aqui, nós descrevemos um fenótipo do músculo esquelético recentemente identificado, isto é, a alternância mecânico, como um exemplo de várias informações e rico que pode ser obtida utilizando o ensaio in vitro a contractilidade do músculo. Combinação deste ensaio com ensaios de célula única, as abordagens genéticas e bioquímicasensaios Stry pode fornecer importantes insights sobre os mecanismos de ECC no músculo esquelético.

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema usando estimulação campo. Informações valiosas sobre Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; As propriedades de manuseamento e maquinaria contrátil do músculo pode ser obtida utilizando-se diferentes protocolos de estimulação.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Descreve-se aqui um método para medir a contratilidade de músculos esqueléticos isolados. Parâmetros como a força muscular, a potência muscular, a cinética contrátil, ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar músculos saudáveis e intactos para estudar a função contrátil in vitro. Isso é realizado primeiramente isolando-se o extensor digitorum longus ou EDL e o músculo sóleo ou sóleo do camundongo. O segundo passo é amarrar os ligamentos e tendões dos músculos EDL e sóleo com fio cirúrgico.Em seguida, monte os músculos isolados no transdutor de força e na câmara contrátil. O passo final é estimular o músculo com pulsos elétricos de campo para induzir contrações. Por fim, as forças resultantes são transmitidas ao transdutor de força e registradas; diversas manipulações fisiológicas e farmacológicas podem ser realizadas para comparar seus efeitos sobre a contratilidade muscular.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes para avaliar a função muscular, como a medição da contratilidade in situ, o desempenho masculino, entre outros, é que este método remove os componentes neuronais e vasculares do músculo esquelético, permitindo a avaliação direta da propriedade intrínseca do músculo contrátil. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois a dissecação de músculos epiteliais intactos exige destrez

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

Nós descrevemos um método minimamente invasivo e indolor para medir a força muscular canina hindlimb e resposta muscular a repetidas contrações excêntricas.

Em função Assay Canine Muscle Vivo

Mudanças nos membros musculares contráteis e passiva propriedades mecânicas são biomarcadores importantes para doenças musculares. Este manuscrito descreve ensaios fisiológicos para medir estas propriedades no longus murino extensores dos dedos e tibial anterior.

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E músculo tibial anterior<em&gt; Em situ</em&gt; Em Ratos

Músculo papilar do ventrículo esquerdo de murino pode ser usado para investigar in vitro a contractilidade cardíaca. Este artigo descreve em detalhes o isolamento e protocolos experimentais para estudar características contráteis cardíacas.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Este trabalho descreve um protocolo que avalia as alterações da sensibilidade do miofilamento Ca2+ durante a contração em miócitos cardíacos isolados do coração de ratos. Juntamente com a eletrofisiologia cardíaca, os níveis sistólicos/diastólicos de citosol Ca2+ e a contração/relaxamento, essa medição é imperativa para sustentar os mecanismos que medeiam o acoplamento excitação-contração cardíaca em corações saudáveis e doentes.

Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Este protocolo visa descrever passo a passo a técnica de extração e avaliação da função cardíaca utilizando cardiomiócitos esfolados. Esta metodologia permite a medição e a sintomadulação aguda da função de miofilament usando pequenas biópsias congeladas que podem ser coletadas de diferentes locais cardíacos, de camundongos a homens.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca2+) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Este protocolo descreve como medir a contratilidade em cardiomiócitos primários humanos adultos de corações doados com o sistema MyoBLAZER, uma plataforma confiável para avaliar mudanças na contratilidade induzidas por drogas durante o desenvolvimento pré-clínico.

Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

A função muscular esquelética pode ser avaliada pela quantificação da contratilidade de fibras musculares isoladas, tradicionalmente utilizando abordagens trabalhosas e de baixo rendimento. Aqui, descrevemos um método óptico de alto rendimento para quantificar a contratilidade de fibras musculares emblocadas em hidrogel. Essa abordagem tem aplicações na triagem de fármacos e no desenvolvimento terapêutico.

Medidas contráteis de alto rendimento de fibras musculares intactas de camundongos embutidas em hidrogel usando um sistema baseado em óptica

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aprenda a avaliar força, potência e fadiga em músculos esqueléticos isolados de camundongos usando estimulação de campo. Este método permite analisar propriedades contráteis e manuseio de cálcio in vitro.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

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