Name: Alterações de perfil em Receptor Fosforilação da tirosina quinase utilizando matrizes de anticorpos - Publicidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprenda a analisar fosforilação de receptores tirosina quinase em linhagens de câncer usando matrizes de anticorpos multiplexadas. Este método permite avaliar inibidores seletivos e compreender dinâmicas de sinalização celular em oncologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pela R &amp; D Systems, Inc.

1. Preparação da Amostra <ol><li> Colete de lisados ​​não tratada, ligando tratada, inibidor ou ligante e células tratados seguindo as orientações na folha de dados matriz humana Phospho RTK. O tampão de lise foi otimizado para este kit. A substituição dos tampões de lise podem afectar o desempenho final da matriz. Para evitar a degradação proteolítica da amostra, adicionar 10 ug / ml de aprotinina, 10 ug / ml de leupeptina, pepstatina e 10 ug / ml de A para o volume de tampão de lise requerido para cada preparação de lisado de células fresca para cada utilização. </li><li> Lysate concentração deve ser medido utilizando um ácido bicinconínico (BCA) de ensaio. Concentração da amostra pode ser empiricamente ajustada para uma sensibilidade óptima e de fundo baixo. Uma gama de 100-300 ng de lisado é recomendado como um ponto de partida inicial. </li><li> Congelamento / descongelamento de amostras devem ser evitados e armazenamento adequado de lisados ​​é necessário para o desempenho ideal. Descongelar as amostras congeladas lisado em gelo. </li></ol><ol><li> Trazer todos os componentes do kit para a temperatura ambiente antes do uso. Para evitar contaminação, usar luvas durante a realização dos procedimentos. </li><li> Pipetar 2,0 ml de tampão de matriz 1 em cada poço do prato de 4 Bem-Multi a ser utilizado. Tampão de matriz 1 serve como um tampão de bloqueio. </li><li> Usando televisão de ponta pinça, remova cada membrana para ser usado por entre as folhas de protecção e coloque em um poço do 4-Bem prato Multi-. O número da matriz deve estar voltado para cima. </li><li> Em contacto com uma matriz de tampão, o corante azul das manchas desaparecerá, mas os anticorpos de captura são mantidas nos seus locais específicos. </li><li> Incubar durante 1 hora numa plataforma de agitação. Oriente a bandeja de modo que cada matriz final rochas para terminar em seu bem. A superfície da matriz deve ser completamente molhada e cobertos por tampão de bloqueio. </li><li> Enquanto as membranas são bloquear, dilui-se a quantidade desejada de lisado celular para um volume final de 1,5 ml com tampão de matriz 1. </li> &lt;li&gt; Tampão matriz Aspirar um dos poços da placa de 4 Bem-Multi e adicionar soluções diluídas lisado. Colocar a tampa no prato 4-Multi-Well. <li> Incubar durante a noite a 2-8 ° C numa plataforma oscilante. Um tempo de incubação mais curto pode ser utilizado se a sensibilidade óptima não é necessária. </li><li> Cuidadosamente remover cada membrana a partir da 4-Well prato múltipla e colocar nos recipientes individuais de plástico com 20 ml de tampão de lavagem 1X. O 4-Well prato múltipla não pode ser usada para completar os passos de lavagem. Lavar o 4-Bem-prato Multi com água deionizada ou destilada e seque bem. </li><li> Lavar cada membrana com 1X tampão de lavagem durante 10 minutos num agitador de plataforma oscilante. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens. </li><li> Diluir o anti-fosfo-tirosina-peroxidase de rábano tampão de detecção (HRP) em 1X tampão de matriz 2, utilizando o factor de diluição, no rótulo do frasco. Pipetar 2,0 ml de uma solução diluída para cada poço do prato de 4 Multi-Well. </li><li> Remova cuidadosamente cada membrana de seu recipiente de lavagem.Permitir tampão em excesso para drenar a partir da membrana e voltar a membrana para o 4-Well prato Multi-diluído contendo o anti-fosfo-tirosina-HRP. Cobrir os poços com tampa. </li><li> Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Lavar cada matriz, tal como descrito anteriormente. </li><li> Conclua as etapas restantes, sem interrupção. Remova cuidadosamente cada membrana de seu recipiente de lavagem. Permitir tampão para drenar o excesso da membrana por blotting da aresta inferior em papel absorvente. Colocar cada membrana em uma folha de plástico protector, com o número de identificação para cima. </li><li> Pipeta de 1 ml do reagente preparado Chemi Misturar uniformemente para cada membrana. Utilizando menos do que 1 ml de Reagente Mix Chemi por membrana pode resultar na cobertura incompleta da membrana. A substituição de alguns reagentes de alta intensidade quimioluminescentes para Chemi Reagentes 1 e 2 podem causar um fundo aumentado ou diminuído, dependendo do sinal do reagente. </li><li> Cuidadosamente cubra com um plásticoprotetor da folha. Gentilmente suavizar as bolhas de ar e garantir Chemi Mix Reagente é distribuído uniformemente a todos os cantos de cada membrana. Incubar durante 1 min. </li><li> Toalhas de papel de posição em cima e dos lados do protetor da folha de plástico contendo as membranas e cuidadosamente esprema o excesso de reagente Mix Chemi. </li><li> Retire o protetor da folha superior de plástico e cuidadosamente colocar um laboratório absorvente sobre o topo das membranas para apagar de desconto em qualquer misturar reagentes restantes Chemi. </li><li> Deixando de membranas no protetor inferior da folha de plástico, cobrir as membranas com filme plástico com cuidado para delicadamente eliminar possíveis bolhas de ar. Envolver o envoltório excesso de plástico em torno da parte de trás da folha de protector a fim de que as membranas e protetor folha está completamente enrolada. </li><li> Coloque as membranas com os números de identificação voltadas para cima, de uma cassete de película auto-radiografia que não é utilizado com detecção de isótopos radioactivos. </li><li> Expor a película Kodak Luz BioMax para min 1-10. Várias exposições são Recomterminou. Alternativamente, as imagens podem ser coletados por meio de um gerador de imagens de quimiluminescência compatível, como a Carestream Health Imagem Estação 4000mm PRO. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Sinais positivos observados em filme desenvolvido podem ser rapidamente identificados através da colocação da camada de transparência sobre a imagem da matriz e alinhando-a com os pares de pontos de referência impressos nos cantos para esta finalidade. O número de identificação estampado sobre a matriz deve ser colocado no lado esquerdo tinha. A localização dos controles e anticorpos de captura está listada no apêndice da folha de dados matriz humana Phospho RTK. </li><li> Densidades de pixel em filme desenvolvido pode ser coletado usando um scanner de transmissão modo como o Epson Perfection V750 PRO. </li><li> Criar um modelo para analisar a densidade de pixels em cada ponto da matriz utilizando um adequado programa de imaginação software de análise. Programas compatíveis incluem software ImageQuant ou ArrayVision da GE, Western sof Visãotware com modelos específicos para proteoma Matrizes Profiler, BioRad Quantidade One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, e Alphaview proteína simples. </li><li> Exportar valores de sinal para um arquivo de planilha para a manipulação de um programa como o Microsoft Excel. </li><li> Determinar o sinal de média (densidade de pixels) do par de pontos duplicados representam cada RTK. </li><li> Subtrair um sinal de fundo em média a partir de cada ponto. Usar um sinal a partir de uma área livre de matriz ou pontos de controlo negativo como valor de fundo. </li><li> Comparar os sinais correspondentes em diferentes matrizes para determinar a variação relativa dos níveis de fosforilação de RTK entre as amostras. </li></ol> 4. Resultados representativos Este protocolo demonstra como a matriz Phospho RTK-humano pode ser utilizado para rastrear os efeitos da estimulação do ligando e inibidores da fosforilação RTK. Na Figura 1, os dados são apresentados para MDA-MB-453 de células que foram tratados, tratados com 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1), durante 5 minutos, ou pré-tratados com inibidores conhecidos da família ErbB 8-11 antes HRGβ1 tratamento. Para as experiências de inibidor, as células foram incubadas com 1 uM HDS 029, 200 nM de PD 153035 ou PD 158780 200 nM em SFM durante três horas. Cada matriz foi incubado com 100 | ig de lisado. Um aumento da fosforilação é observado para ErbB2, ErbB3, ErbB4 e pontos de captura quando comparando células não tratadas com HRG-β1 tratado MDA-MB-453 células. O tratamento das células com os três inibidores da família ErbB selectivas antes da HRG-β1 incubação causou reduções na ErbB2, ErbB3, ErbB4 e fosforilação. Na Figura 2, os dados são apresentados para as células Kato III conhecidos para superexpressar a RTK R2 FGF. Neste conjunto de experiências, as células Kato III foram tratados, tratados com 100 ng / ml rhFGF ácido (FGF) e heparina 1 ug / ml, ou pré-tratados com inibidores selectivos R FGF 12-15 antes do tratamento comFGF e heparina. O inibidores PD173074, PD 161570, PD 166285 e foram utilizados a uma concentração de 1 uM e foram incubadas com as células Kato III para 3 horas em meio isento de soro. Embora não haja a fosforilação constitutiva de ambos EGF R e R2 FGF em células não tratadas KATO III, um aumento na fosforilação do FGF R2 foi observada após tratamento com FGF. Incubar as células com PD 173074, PD 161570, PD 166285 ou resultou em diminuição FGF e EGF R2 fosforilação R. Embora esses inibidores são conhecidos afectar a fosforilação dos membros da família FGF R, estes resultados demonstram a utilidade da matriz Phospho RTK-humano para monitorizar o efeito de uma concentração específica de inibidor pode ter sobre outros RTKs, tais como EGF R neste caso. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indução e inibição da recepfosforilação da cinase da tirosina tor em células de câncer de mama. imagens matriz de Proteome Profiler Humanos Phospho RTK-matrizes e os perfis de histograma correspondentes são mostrados. MDA-MB-453 de células não tratadas ou foram tratadas com inibidores de RTK, seguido por tratamento com NRG-β1/HRG-β1. A matriz foi utilizada para monitorar os efeitos de inibidores da quinase na fosforilação em MDA-MB-453 células. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imagens de matriz de indução e de inibição da fosforilação do receptor de tirosina-quinase em células de cancro gástrico. Partir de uma matriz de perfis Proteome Phospho RTK-humano e os perfis correspondentes de histograma são mostrados. Células Kato III foram untreated ou tratados com inibidores de RTK, seguido de tratamento com ácido FGF e heparina. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . Referências <ol><li> Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., &amp; Palmqvist, as células cancerosas R. colorretais ativar os fibroblastos adjacentes resultantes em FGF1/FGFR3 sinalização e invasão aumentada. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011). </li><li> Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., &amp; Masaki, T. A utilização de proteínas de matriz para identificar receptores cinases de tirosina direccionáveis ​​para o tratamento de cancro do cólon humano. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010). </li><li> Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., &amp; Antonescu, caracterização CR Molecular pediátricos de tumores do estroma gastrointestinal. Clin. Câncer Res. 14, 3204-3215 (2008). </li><li> Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., &amp; DePinho, RA coativação de tirosina-quinases receptoras afecta a resposta das células tumorais para terapias específicas. Science. 318, 287-290 (2007). </li><li> Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, e Stern, DF Association of constitutivamente activada do receptor do factor de crescimento de hepatócitos (Met) com resistência a um inibidor EGFR/Her2 dupla em não-pequenas células do cancro do pulmão de células. Br. J. Câncer. 100, 941-949 (2009). </li><li> Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., &amp; Debiec-Rychter, M. Co-activated PDGFRA e EGFR são potenciais alvos terapêuticos sarcoma intimal. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010). </li><li> Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, &amp; Kim, TY Combinação de EGFR e MEK1 / 2 inibidor mostra efeitos sinérgicos por EGFR/HER3-dependent suprimindo AKT ativação em células cancerosas gástricas. Mol. Ther câncer. 8, 2526-2536 (2009). </li><li> Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., &amp; Bridges, propriedades bioquímicas e AJ antiproliferativa de 4 - [Ar (Alq) ilamino] piridopirimidinas, uma classe nova de produtos químicos potentes e específicos do factor de crescimento epidérmico receptor inibidor da tirosina quinase. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997). </li><li> Bos,M., Mendelsohn, J., Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, e Baselga, J. PD153035, um inibidor da tirosina quinase, impede a activação do receptor de crescimento epidérmico e factor de inibição do crescimento de células cancerosas em um número de receptores- forma dependente. Clin. Câncer Res. 3, 2099-2106 (1997). </li><li> Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, &amp; Neoplasia Elder, JT utilização diferencial e localização de quinases de tirosina receptores ErbB na pele em comparação com os queratinócitos normais e malignas.. 3, 339-350 (2001). </li><li> Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Pontes, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., smaill, JB, Denny, WA, e Showalter, inibidores da quinase de tirosina de HD. 19. 6-alknyamides de 4-anilinoquinazolinas e 4-anilinopyrido [3,4-d] pirimidinas como inibidores irreversíveis da família ErbB de receptores tirosina-quinase. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006). </li><li> Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., &amp; Lutterbach, B. FGFR2-amplificados linhas de células gástricas cancerosas necessitam de FGFR2 ErbB3 e sinalização para o crescimento e sobrevivência. Câncer Res. 68, 2340-2348 (2008). </li><li> Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Silva, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . &amp; Gray, NS Uma abordagem orientada-estrutura para a criação de inibidores FGFR covalentes. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010). </li><li> Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., &amp; Panek Inibição RL de FGF-1, a actividade de cinase de tirosina receptora de PD 161570 , uma proteína nova-Tirosina-quinase inibidor. Life Sei. 62 143-150 (1998). </li><li> Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, e Keiser, JA In vitro caracterização farmacológica de PD 166285, um novo potente nanomolar e amplamente activo inibidor da proteína tirosina quinase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997). </li></ol>

The Human Phospho-RTK é uma alternativa econômica e rápida de métodos tradicionais, tais como imunoprecipitação (IP) ocidental para mudanças de triagem na fosforilação de TKU. Usando este método, os níveis relativos de 42 fosfo-RTKs foram rastreados simultaneamente utilizando uma única amostra de MDA-MB-453 ou de lisado de células Kato III. Além disso, este ensaio matriz exigido 2,5 horas de hands-on do tempo, tornando este método muito mais eficaz do que o tempo de realização de múltiplas IP-Westerns. Ao empregar um método de detecção por quimioluminescência, nenhum equipamento especializado para além do que é normalmente utilizado para a recolha de dados foi necessário ocidentais. Arrays são sensíveis e podem ser utilizadas para comparar mudanças na fosforilação causadas por ambos ligando e tratamento inibidor. Este método também permite a avaliação da selectividade inibidor para fora do alvo RTKs. Acertos positivos podem ser ainda avaliados utilizando um ensaio quantitativo tal como um ELISA. Para efetivamente empregar matrizes para o rastreio de alteraçõesna fosforilação, algumas diretrizes fundamentais experimentais devem ser seguidas. Em primeiro lugar, as experiências devem incluir amostras de controlo adequadas. Por exemplo, nestas experiências o efeito de inibidores em MDA-MB-453 ou III Kato lisados ​​foram medidos em amostras de lisados ​​preparados no mesmo dia. Apenas os dados de matriz, que são recolhidos dentro da mesma experiência devem ser analisados ​​para minimizar variações de sinal, devido a diferenças no manuseamento das amostras, o tempo de incubação, a técnica de pipeta, ou a técnica de lavagem. Intensidades de sinal comparando entre dois analitos na mesma membrana não é recomendada, uma vez que os anticorpos de captura não foram seleccionadas para ter afinidades paralelas.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank">Kit de matriz Phospho-RTK humano</a></td><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> R&amp; D Sytems</a></td><td>ARY001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Tocris</td><td>1167</td><td></td></tr><tr><td>Pepestatina A</td><td>Tocris</td><td>1190</td><td></td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td></td><td>MDA-MB-453</td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kato III<a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=396-hb" target="_blank">Domínio EGF NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 humano recombinante</a></td><td>R&amp; D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa" target="_blank">FGF humano recombinante ácido (aa 16-155)</a></td><td>R&amp; D Systems</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>HDS 029</td><td>Tocris</td><td>2646</td><td></td></tr><tr><td>PD 153035</td><td>Tocris</td><td>1037</td><td></td></tr><tr><td>PD 158780</td><td>Tocris</td><td>2615</td><td></td></tr><tr><td>PD 173074</td><td>Tocris</td><td>3044</td><td></td></tr><tr><td>PD 161570</td><td>Tocris</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>PD 166285</td><td>Ensaio Tocris</td><td>3785</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas e pontas de</td><td></td><td></td><td></td>pipeta</tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>deionizada ou destilada</tr><tr><td>Pinças de ponta plana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de balanço agitador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipientes de plástico com capacidade para 50 ml</td><td></td><td></td><td>Para matrizes de lavagem Protetor</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de folha transparente de plástico</td></tr><tr><td>Filme</td><td></td><td></td><td></td>plástico</tr><tr><td>Lenços</td><td></td><td></td><td></td>absorventes de laboratório</tr><tr><td>Toalhas de papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de autorradiografia</td></tr>: <tr><td>Revelador</td><td></td><td></td><td></td>de filme</tr><tr><td>Kodak BioMax, Light Film</td><td>Carestream Health</td><td>, 178 8207</td><td></td></tr><tr><td>Revelador</td><td></td><td></td><td></td>de filme</tr>, <tr><td>Image Station 4000MM PRO</td><td>Carestream Health</td><td></td><td>Quimiluminescência, compatível com a coleta de dados ocidentais, pode ser usado em vez de filme e um filme revelador.</td></tr><tr><td>Scanner de Perfeição</td><td>Epson Epson</td><td>V750 PRO</td><td>Scanner de mesa com adaptador de transparência capaz de modo de transmissão</td></tr><tr><td>Software de Análise de Imagem</td><td>GE, WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc</td><td></td><td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView ou outro programa compatível</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computador capaz de executar software de análise de imagem e Microsoft Excel.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alterações de perfil em receptor fosforilação da tirosina quinase utilizando matrizes de anticorpos - publicidade

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

A desregulação da expressão de receptores de tirosina-quinase (RTK) e fosforilação está frequentemente associada com a propagação e o desenvolvimento metastático de células cancerosas. Esforço significativo 1-3 tem sido focada em desenvolver inibidores específicos para alvejar RTKs e interromper as vias de sinalização aberrantes associados com estados de doença . 4-7 O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de um seleto número de inibidores de fosforilação de TKU. Este estudo utilizou a matriz Phospho-RTK humanos, que é uma membrana de imunoensaio em sanduíche com base para monitorar aumentos ou diminuições na fosforilação de RTKs numerosas simultaneamente numa única amostra. Neste ensaio, as duas RTKs fosforiladas e não fosforilada presente em uma amostra de lisado são capturados por anticorpos discretos impressos em duplicado através de uma membrana de nitrocelulose, o tamanho de uma lâmina de microscópio. Após lavagem, as matrizes são incubadas com anti-fosfo-tirosina-peroxidase de rábano (HRP),que sanduíches com TKUs fosforilados capturados na matriz. Após um passo de lavagem em segundo lugar, as matrizes são incubados com reagentes quimioluminescentes. Sinal gerado em cada ponto da matriz é proporcional à quantidade de proteína fosfo-ligado por cada anticorpo de captura. Nestas experiências, as matrizes foram utilizadas para medir o aumento de fosforilação após a estimulação do ligando ou do cancro da mama MDA-MB-453 ou III KATO células de carcinoma gástrico, bem como para caracterizar diminuições na fosforilação associados com o tratamento de células com inibidores selectivos para ErbB ou família FGF membros R.

Matrizes de anticorpos proteoma Profiler são uma forma conveniente e eficiente para a tela para mudanças no receptor tirosina quinase (RTK) fosforilação sem a realização de numerosos imunoprecipitação (IP) Westerns. A matriz RTK ARY001 Human permite a medição qualitativa das RTK múltiplos numa única amostra usando detecção por quimioluminescência.

Alterações de perfil em Receptor Fosforilação da tirosina quinase utilizando matrizes de anticorpos - Publicidade

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

profiling-changes-receptor-tyrosine-kinase-phosphorylation-using

Without Section

Os aspectos técnicos do desempenho LIPS (Sistemas de imunoprecipitação luciferase) são descritos. A abordagem global envolve expressar genes quiméricos codificando antígenos fundido a Renilla luciferase (Ruc) em células de mamíferos. Crude Ruc-antígeno extratos são então preparadas e, sem a purificação, empregada em ensaios de imunoprecipitação para quantificar anticorpos.

Perfil de anticorpos por sistemas de imunoprecipitação luciferase (LIPS)

Western blotting é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Mutações no receptor kisspeptina (KISS1R) estão associados com distúrbios reprodutivos em pacientes. Aqui nós descrevemos como introduzir mutações de interesse na seqüência GC-rica de KISS1R, bem como o uso de construções KISS1R para caracterizar a via de degradação do receptor por imunoprecipitação e western...

Mutagênese e análise de mutações genéticas nos receptores de Seqüência GC-rica KISS1 identificados em humanos com distúrbios reprodutivos

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste...

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira...

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Aprenda a analisar fosforilação de receptores tirosina quinase em linhagens de câncer usando matrizes de anticorpos multiplexadas. Este método permite avaliar inibidores seletivos e compreender dinâmicas de sinalização celular em oncologia.

Alterações de perfil em Receptor Fosforilação da tirosina quinase utilizando matrizes de anticorpos - Publicidade

Explorar mais vídeos