Heterotípica tridimensional In Vitro Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar modelos típicos tridimensionais do desenvolvimento do câncer de ovário em estágio inicial. Primeiro, gere linhagens celulares imortalizadas H turt derivadas de tecidos epiteliais e fibroblastos ovarianos primários e normais. Em seguida, para recriar a arquitetura in vivo e as complexas interações celulares presentes na co-cultura de ovários, as linhagens celulares epiteliais e estromais em modelos tridimensionais de esferóides S procedem à fixação e coloração das culturas organoides e analisam a expressão de marcadores específicos para estudar as características moleculares das interações epiteliais estromais.

Os resultados obtidos mostram como alterações no compartimento de células estromais de modelos típicos 3D podem influenciar o fenótipo de células epiteliais cocultivadas. Modelos típicos tridimensionais podem ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa do câncer de ovário, como explorar as origens dessa doença e elucidar o papel do microambiente estromal na iniciação e desenvolvimento do tumor. As aplicações dessas técnicas se estendem ao diagnóstico e terapia de doenças em comparação com outros métodos de cultura 3D.

Essa técnica pode ser aplicada a uma ampla gama de volumes de cultura de células e aplicações a jusante. Por exemplo, culturas 3D homo e típicas podem ser usadas para testes de drogas in vitro. Essa abordagem também pode ser aplicada a outros sistemas modelo, como no estudo de outros tipos de tumores sólidos ou em doenças benignas.

Transporte o tecido ovariano fresco para o laboratório de cultura de células em meio de crescimento de fibroblastos ovarianos normais imortalizado, suplementado com antibióticos e travessuras extras. Lave a amostra três vezes com cinco mililitros de PBS para remover quaisquer células epiteliais que permaneçam frouxamente presas ao tecido. Em seguida, transfira a amostra mais PBS para uma placa de cultura P 100 limpa Usando instrumentos estéreis, transfira o tecido para uma segunda placa de cultura limpa P 100 seca.

Corte o tecido em pedaços de 0,5 centímetro quadrado e transfira cada pedaço para um prato P 100 separado. Continue a cortar o tecido em pedaços com menos de um milímetro quadrado de tamanho. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio INOF GM e monitor de cultura para crescimento celular usando microscopia de fase.

Confirme se as células aderem ao prato dentro de 24 horas. Monitore o crescimento celular usando microscopia de fase As células geralmente aderem ao prato dentro de 24 horas após uma semana. Remover qualquer tecido não aderente por aspiração, reabastecer o meio e, em seguida, realimentar as culturas duas vezes por semana dentro de uma a três semanas, quando as colónias celulares tiverem cerca de 500 mícrons de tamanho.

Isole os clones usando trips e discos de clonagem revestidos. A fim de confirmar 100% de células fibroblásticas. Coloque uma amostra da linhagem celular em lamínulas de vidro e faça a coloração imunofluorescente para um marcador fibroblástico, um marcador epitelial e um marcador de células endoteliais.

Um dia antes da transdução retroviral da passagem de H Turt, a célula de fibroblastos ovarianos normais se isola de uma única placa P 100 em três placas P 100. O suporte viral pré-fabricado pode ser adquirido ou produzido internamente usando protocolos padrão para transfecção de células T HEC 2 9 3. Para preparar a solução de poli Hema, pese 1,5 gramas de poli hema e coloque em um frasco estéril.

Adicione 95 mililitros de biologia molecular, grau, etanol absoluto e cinco mililitros de água destilada de grau de cultura de células. Coloque a solução de poli Hema em banho-maria a 65 graus Celsius até dissolver completamente. Cubra as placas de cultura de tecidos com solução de poli Hema recém-feita.

Seque ao ar as placas de cultura de células dentro da capela de fluxo laminar. O balanço suave em uma plataforma de balanço pode ser usado para garantir um revestimento uniforme de pratos ou frascos de tamanho maior. Se a solução de polius secar muito rapidamente, a superfície não ficará lisa.

Se desejar, pré-trate os fibroblastos antes da cultura 3D, por exemplo, para indução de senescência, pré-trate as células com doses subletais de peróxido de hidrogênio. Recuperar e expandir o INOF e as culturas de células epiteliais in vitro para preparar células suficientes para o estabelecimento de esteróides heterotópicos 3D. Após uma lavagem PBS de cinco minutos, adicione 15 mililitros de meio à placa de poli hema.

Enquanto isso, adicione tripsina às células de fibroblastos ovarianos normais imortalizadas para separá-las da placa de cultura. Após três a cinco minutos, neutralizar a tripsina com um volume igual de meios de cultura e colher as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros médios e misture bem pipetando para cima e para baixo ou vórtice suavemente.

Em seguida, use uma amostra de 10 microlitros para enumerar células viáveis usando azul trian. Agora adicione 4 milhões de células INOF ao meio já dispensado na placa revestida com poli hema. Aumente o volume do meio de cultura em 20 mililitros e incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.

Monitore a agregação celular em esteróides multicelulares por microscopia de fase para realimentar as culturas de esferóides S a cada dois ou três dias. Apoie as placas em ângulo em uma pipeta. Deixe os esferóides assentarem e remova cuidadosamente cerca de 16 mililitros do meio esgotado com uma pipeta de cinco mililitros.

Adicione 16 mililitros de meio fresco à cultura e retorne à incubadora No sétimo dia. Crie culturas heterotípicas adicionando células epiteliais aos fibroblastos phe. Primeiro, prepare suspensões de células epiteliais ovarianas por tripsina, conforme descrito anteriormente, após enumerar as células.

Lave uma vez em meio INOF GM para evitar que quaisquer fatores de crescimento sejam transferidos do meio de crescimento epitelial. Após reabastecer o meio das culturas de OID de fibroblastos, adicione as células epiteliais em uma proporção de quatro para um fibroblastos à cultura de células epiteliais. Os OIDs heterotópicos em INOF GM realimentam culturas típicas a cada dois a três dias por mais 14 dias.

Para imuno-histoquímica, fixe o PHE com formina tamponada neutra, peletize o PHE e substitua a formalina por etanol a 70%. Prossiga para o processamento em parafina usando protocolos padrão usados para tecidos humanos. Os esteróides embebidos em parafina podem ser seccionados e corados com h e e de marcadores moleculares específicos usando química imunohística.

Alternativamente, lave os esteróides em PBS e fixe em 4% de formaldeído para. Em seguida, embutir as amostras em meio OCT e congelar por pressão para seccionamento de criostato e coloração imunofluorescente para análise por citometria de fluxo. Lave os esteróides em PBS e dissocie por tripsina ou digestão Accutane a 37 graus Celsius.

A dissociação completa de esteróides em uma única suspensão celular pode ser promovida pipetando a solução para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de um mililitro. Tome cuidado para não superdimensionar as células, neutralize a reação com um volume igual de meio de cultura e remova os aglomerados de células passando a suspensão por um filtro de células de 40 a 70 mícrons. Em seguida, pelete as células e lave com PBS e enumere, ressuspenda o número desejado de células em fatos, tampone e core de acordo com as instruções do fabricante Em nosso laboratório, transformamos parcialmente as células epiteliais ovarianas e cocultivamos essas células com fibroblastos ovarianos normais e senescentes para imitar o desenvolvimento do câncer de ovário em estágio inicial.

Em um ovário pré-menopausa A coloração imunofluorescente de fibroblastos ovarianos normais imortalizados mostra que tanto os fibroblastos ovarianos normais primários quanto os fibroblastos ovarianos normais imortalizados expressam proteína específica de fibroblastos, mas não expressam citoqueratina sete e expressam menton. Células de fibroblastos ovarianos normais cultivadas isoladamente na forma 3D PHE exibem uma morfologia espigionada e matriz extracelular abundante. Aqui, fibroblastos ovarianos normais foram expostos a peróxido de hidrogênio para induzir senescência por sete dias e, em seguida, cultivados com células epiteliais ovarianas parcialmente transformadas por 14 dias.

Para distinguir os dois tipos de células, os esteróides resultantes foram imunocorados para mim um como marcador de proliferação e pan citoqueratina como marcador epitelial. A quantificação dos dados sugere que o microambiente envelhecido promove características neoplásicas de células epiteliais parcialmente transformadas, enquanto um microambiente normal inibe a progressão neoplásica, características histológicas de células normais e malignas que não são detectáveis quando as células são cultivadas à medida que as monocamadas são restauradas. Quando as células são transferidas para cultura esferoide, por exemplo, características histológicas de câncer de ovário de células claras podem ser detectadas em culturas 3D de linhas de células de câncer de ovário de células claras, mas não em culturas de monocamada das mesmas células.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar culturas típicas tridimensionais para estudar as interações entre células epiteliais e estromais. Durante a gênese inicial do tumor. Ao configurar uma cultura 3D, é importante ajustar o número de células de acordo com a aplicação a jusante, permitindo alguma perda de material durante o processamento.

Uma vez dominadas, as culturas 3D podem ser configuradas em uma hora após este procedimento. Outros métodos, como citometria de fluxo combinada com perfil de microraios de expressão gênica, podem ser realizados para analisar as alterações globais da expressão gênica que ocorrem em culturas típicas 3D, mas não são detectadas em condições de cultura de monocamada. Isso permitirá a dissecação das vias de sinalização bidirecionais que ocorrem especificamente sob uma cultura de núcleo 3D. Microambiente.