Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

O objetivo geral do experimento demonstrado neste vídeo é avaliar se o peptídeo antimicrobiano lisina desempenha um papel na melhora da colite induzida por sulfato de dextrano em camundongos. Isso é conseguido injetando medula óssea de camundongos selvagens em camundongos lícitos e knockout irradiados e medula óssea de camundongos knockout em camundongos selvagens irradiados. A medula óssea transplantada gerará novas células sanguíneas no genótipo do receptor do doador.

Os camundongos receptores são então expostos ao sulfato de dextrano para induzir colite após quatro semanas. O transplante bem-sucedido é validado por citometria de fluxo e o dano ao tecido colônico é avaliado por histologia. São obtidos resultados que mostram que a colite é melhorada quando a medula óssea do tipo selvagem é transplantada para camundongos knockout.

Por outro lado, a colite é agravada quando a medula óssea knockout é transplantada para camundongos do tipo selvagem. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na determinação das expressões gênicas de células derivadas da medula óssea ou células não derivadas da medula óssea na inflamação ou infecção. C 57, seis pretos, tipo selvagem e camundongos knockout induzidos por C são recomendados para este experimento para possibilitar o rastreamento dos camundongos do tipo selvagem e camundongos knockout.

Células doadoras após transplante de medula óssea. Use camundongos CD 45.1 para representar camundongos do tipo selvagem e CD 45.2 para camundongos knockout. O gráfico mostrado aqui descreve a configuração experimental que cinco camundongos doadores e 10 camundongos receptores são atribuídos para cada grupo.

Para os grupos A e B, a medula óssea será transplantada dos camundongos selvagens para os camundongos knockout. A colite será induzida no grupo A, mas não no grupo B.Para os grupos C e D.A medula óssea será transplantada dos camundongos knockout para o tipo selvagem e a colite será induzida no grupo C apenas para E e F.O transplante será do tipo selvagem para o tipo selvagem e para os grupos G e H, O transplante será de nocaute a nocaute. Para preparar a medula óssea do doador para transferência para camundongos irradiados, comece extraindo a medula óssea dos ossos de camundongos sacrificados em um gabinete de biossegurança.

Use instrumentos de dissecção estéreis para expor os ossos do úmero, fêmur, tíbia e fíbula livres de músculos e ligamentos e transferi-los para uma placa de Petri. Corte as duas extremidades dos ossos para mostrar a medula óssea vermelha. Em seguida, agarrando um dos ossos com uma pinça.

Lave a medula óssea vermelha com PBS frio com seringa de três mililitros e agulhas de calibre 25 para outra placa de Petri. Em seguida, lave o osso da outra extremidade para produzir mais células da medula óssea. Repita esse processo com cada um dos ossos.

Agrupe a medula óssea do tipo selvagem e nocauteie os ratos separadamente. Use uma seringa de seis mililitros com uma agulha de calibre 18 de meia polegada para quebrar os tampões vermelhos da medula óssea por aspiração e ejeção repetidas. Em seguida, use uma pipeta sorológica para transferir a medula óssea coletada para um tubo cônico de 50 mililitros.

Depois que toda a medula óssea for transferida, gire a medula óssea a 740 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento por vórtice durante cinco a 10 segundos. Ao pellet, adicione cinco mililitros de um tampão de lise XRBC por vórtice de camundongo doador novamente por cinco segundos e incube por exatamente três minutos em temperatura ambiente.

Após três minutos, adicione 20 mililitros de PBS frio a cada tubo e misture por inversão para interromper a lise. Em seguida, despeje o conteúdo através de um filtro de células de 40 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o tubo original com cinco mililitros de PBS e transfira a solução para o filtro de células.

Continuando a coletar o fluxo através do tubo cônico. Em seguida, aumente o volume para 50 mililitros com PBS e misture por inversão. Em seguida, determine a contagem de células viáveis por exclusão de trian blue usando um hemocitômetro.

Uma vez que a contagem de células tenha sido determinada, gire as células da medula óssea a 913 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante com base na contagem total de células. Resus suspende o pellet em PBS em uma vez 10 elevado a oitavo células por mililitro.

As células da medula óssea estão agora prontas para serem transferidas para camundongos receptores irradiados. Os camundongos receptores do tipo selvagem e knockout para este experimento foram irradiados com 1000 rad conforme descrito no documento anexo, os camundongos são criados e alojados em uma instalação livre de patógenos quatro a 24 horas após a irradiação aquecer os camundongos receptores em uma almofada de aquecimento sob uma lâmpada de aquecimento para injetar a medula óssea do doador. Coloque um camundongo receptor na contenção, limpe a cauda com etanol 70% para esterilizar o local da injeção e promover a vasodilatação local para facilitar a injeção.

Usando uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 28 e meio, injete uma vez 10 às sétimas células em um a 200 microlitros na veia da cauda de cada camundongo após a injeção. Coloque o camundongo em uma gaiola com até três outros camundongos injetados nas primeiras quatro semanas após a injeção. Mantenha os camundongos receptores injetados em gaiolas de autoclave com água contendo o antibiótico sulfa trim.

Isso dá tempo para os animais recuperarem a imunidade, trocarem as gaiolas, água tratada com antibióticos e alimentos a cada quatro dias para manter a higiene. Quatro semanas após a irradiação e o transplante de medula óssea, mude para água normal sem antibióticos e mantenha os camundongos por mais duas semanas para recuperar sua microflora intestinal normal. Seis semanas após a injeção na medula óssea, meça o peso corporal inicial para induzir a colite.

Dê aos camundongos do grupo experimental de colite 5% de sulfato de dextrano na água potável. Cinco dias depois, junte o sangue periférico de quatro camundongos em tubos revestidos de heparina vacutainer e coloque-o no gelo. Em seguida, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, combine 300 microlitros de sangue com 300 microlitros de coloração celular, tampone e alíquota do sangue em cinco tubos de ensaio de citometria de fluxo rotulados de um a cinco, cada um com 100 microlitros no gelo.

Depois de sacrificar os ratos, meça o peso corporal novamente e calcule a mudança. Disseque os tecidos do cólon e passe-os em formalina para coloração h e d. Em seguida, obtenha células da medula óssea como antes.

Divida a medula óssea ressuspensa em cinco tubos de microcentrífuga rotulados de um a cinco, cada um com 100 mililitros. Na preparação para análise por citometria de fluxo, prepare a mistura de anticorpos para cada tubo respectivo no escuro, conforme descrito no documento anexo, amostras de sangue e medula óssea rotuladas como número um servirão como controles e não serão amostras de sangue e medula óssea coradas. O número dois rotulado será corado com controle de isotipo fitzy, controle de isotipo PE e solução de bloqueio CD 16 barra 32.

Esses controles de isotipo são usados para confirmar a especificidade das amostras primárias de ligação de anticorpos. O número três rotulado será corado com FZ CD 45.1 e CD 16 barra 32. As amostras de solução de bloqueio rotuladas como número quatro serão coradas com CD 45.2 e CD 16 barra 32.

Solução de bloqueio. A rotulagem de uma única cor pode revelar a presença de células doadoras ou receptoras no sangue ou na medula óssea. Claramente, as amostras rotuladas como número cinco serão coradas para CD 45.1, CD 45.2 e CD 16 barra 32.

Bloqueando aqui, a rotulagem de duas cores mostra a proporção relativa de células doadoras e receptoras no sangue ou na medula óssea. Adicione cinco microlitros da mistura de anticorpos dois e cinco aos seus respectivos tubos de amostra. Em seguida, adicione três microlitros da mistura de anticorpos três e quatro aos seus respectivos tubos de amostra.

Incube todos os tubos no gelo por 30 minutos. Após a incubação, adicione dois mililitros, um tampão de lise XRBC a cada tubo. Em seguida, incube as amostras por mais 15 minutos no gelo no escuro.

Gire as células a 350 vezes G, cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante ressuspendendo o pellet com tampão de coloração celular de 500 microlitros no escuro. Em seguida, vórtice brevemente.

Em seguida, realize citometria de fluxo nas amostras de sangue e medula óssea da coloração imunológica. Selecione FZ para representar o tipo wild CD 45.1 e PE para representar o CD 45.2 nocauteado. Analise os resultados da citometria de fluxo usando o software de Flo Joe.

Calcule a proporção de ajuste E para PE ou proporção de PE para ajuste e para determinar se o genótipo do doador é o genótipo dominante no sangue e na medula óssea. Esta imagem mostra amostras de imagens h e e de cólon com histologia normal e colite DSS. As imagens histológicas são pontuadas com base no dano ao tecido mucoso e na infiltração de neutrófilos nos tecidos mucosos e submucosos.

Assim, uma pontuação histológica mais alta indica colite mais grave para testar se a lyin desempenha um papel na prevenção da colite. A medula óssea foi trocada entre camundongos selvagens e nocautes, conforme descrito neste vídeo. A histologia foi então avaliada e pontuada conforme mostrado aqui.

Os escores histológicos aumentaram significativamente quando a medula óssea de camundongo knockout foi introduzida em camundongos do tipo selvagem irradiados. Por outro lado, as pontuações diminuíram significativamente quando a medula óssea do tipo selvagem foi introduzida em camundongos knockout. Esses dados indicam que o C endógeno de células derivadas da medula óssea tem efeitos anti-inflamatórios e melhora a colite para verificar se o transplante foi bem-sucedido nesses camundongos.

A citometria de fluxo também foi realizada na medula óssea e no sangue dos camundongos após o transplante. A medula óssea do tipo selvagem cora fortemente para Fitz CD 45.1, mas não pe, CD 45.2 como mostrado aqui, nocaute de medula óssea cora fortemente para PE, mas não Fitz como mostrado aqui. Após o transplante, no entanto, tanto a medula óssea quanto o sangue de camundongos do tipo selvagem que receberam medula óssea nocaute coraram fortemente para EP, mas não Fitz, indicando que a população predominante de células coradas era do doador.

Da mesma forma, a medula óssea e o sangue de camundongos knockout que receberam medula óssea do tipo selvagem coraram fortemente para fitzy, mas não pe novamente, confirmando que as populações coradas predominantes eram de origem doadora. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de realizar o experimento de transplante de medula óssea e deve ser capaz de modificar a colite por meio de células derivadas da medula óssea.