Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

O objetivo deste procedimento é monitorar como a proteólise da ciclina B regula o início da anáfase e a saída da mitose. Isso é realizado primeiramente semeando células repórter da ciclina B em lâminas de microscopia. O segundo passo é marcar a molécula quimérica repórter da ciclina B com o substrato fluorescente TMR star.

Em seguida, as séries de imagens são adquiridas em uma estação de microscopia. O passo final é analisar as células e calcular a intensidade da fluorescência do TMR star ao longo do tempo, o que reflete a proteólise da ciclina B. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência de células vivas marcadoras revela a cinética da proteólise da ciclina B que ocorre durante a mitose.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o monitoramento do BGFP ciclônico, é que o SNAP ciclônico B permite o monitoramento da degradação do ciclônico B em vez da expressão total da proteína. As células repórter SNAP para este experimento são inicialmente cultivadas de forma assíncrona na fase logarítmica por pelo menos 48 horas. Para iniciar, o procedimento para semeadura da tripsina consiste na semeadura de células repórter SNAP em subconfluência em câmaras microscópicas de oito poços, com distribuição constante em toda a superfície da centrífuga da câmara.

10.000 células e o meio de ressuspensão em 350 microlitros de meio de crescimento normal sem vermelho de fenol. Transfira a suspensão celular para a câmara do microscópio para semeadura das células em câmaras microscópicas de oito poços com densidade máxima de células no centro da câmara. Primeiro, carregue a câmara com 300 microlitros de meio de crescimento normal sem vermelho de fenol.

Em seguida, adicione cuidadosamente 5.000 células ao centro da câmara do microscópio para semear as células em placas de 96 poços com óptica especial, garantindo uma distribuição constante em toda a superfície do poço. Centrifugue 5.000 células e re-suspenda em 300 microlitros de meio de crescimento normal sem vermelho de fenol, conforme o número total de poços contendo células necessário. Ajuste o número de células e o volume total do meio de suspensão.

Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de 96 poços para semeadura das células em placas de óptica especial de 96 poços, com densidade celular máxima no centro do poço. Adicione cuidadosamente 1.500 células em 15 microlitros de meio de crescimento normal sem vermelho de fenol em uma pequena gota no centro de cada poço.

Isso restringirá o crescimento celular ao centro do poço. Deixe todas as células semeadas crescerem por pelo menos 18 horas em condições padrão de cultura celular, 30 minutos antes do início do procedimento de coloração. Aqueça alíquotas do meio de crescimento normal sem vermelho de fenol a 37 graus Celsius.

O substrato reativo nesta demonstração é TMR star, para facilitar o manuseio do TMR star. Dissolva o TMR star em DMSO para obter uma solução estoque com concentração de 400 micromolar. Dilua 0,5 microlitro da solução estoque de TMR star em 200 microlitros de meio de crescimento normal sem fenol vermelho, aquecido, para obter uma concentração final de marcação de um micromolar. Em seguida, remova o meio de crescimento normal das células em crescimento assíncrono e substitua pelo meio de marcação. Incube as células no meio de marcação por 25 minutos em condições padrão de cultivo.

Após 25 minutos, remova o meio de marcação e lave as células quatro vezes com meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol aquecido. Após a última lavagem, incube as células em 300 microlitros de meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol aquecido por 30 minutos antes de transportá-las para o microscópio. Substitua o meio por meio de crescimento normal fresco e aquecido, livre de vermelho de fenol, para remover o substrato de snaps não ligado; transporte as células para o microscópio em uma caixa de isopor sobre um bloco de aquecimento pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Para minimizar a variação de temperatura, duas horas antes da medição da intensidade de fluorescência, ajuste a temperatura do ar na câmara climática para 37 graus Celsius no modo seco, a fim de levar o microscópio e todos os seus componentes à temperatura desejada. Para evitar condensação e danos subsequentes ao microscópio, é importante pré-aquecer antes de ajustar a umidade.

Quando todo o sistema do microscópio atingir 37 graus Celsius, ajuste a umidade do ar para 60% e o dióxido de carbono para 5%. Inicie o software de varredura ou aquisição e defina as configurações padrão. Defina as posições dos poços a serem analisados. Defina o delta T ou o tempo do ciclo de aquisição e o número absoluto de ciclos de aquisição.

Nesta demonstração, o foco automático de hardware é pré-selecionado para análise de um número maior de poços. Inicie a aquisição e supervise os dois primeiros ciclos de aquisição.

O microscópio irá focar no sinal de histona H2 GFP, adquirindo subsequentemente uma primeira imagem nesse canal antes de a troca do filtro e da aquisição da imagem correspondente de TMR star. Isso é então repetido para todas as posições dentro de um poço e para cada um dos poços a serem examinados antes de repetir o próximo ciclo. Novamente, para analisar perfis proteolíticos, inicie o software de análise Scan R.

Analise as imagens com os núcleos celulares visualizados pela histona H2 GFP, definidos como o objeto principal utilizando um limiar baseado na intensidade do sinal e um algoritmo de watershed para auxiliar na separação de células vizinhas. Um subobjeto consistindo de núcleo com citoplasma deve ser criado para a análise do TMR star. Propriedades importantes do objeto principal são as posições X e Y, o tempo e as intensidades máxima e média de GFP para o objeto principal, além da intensidade total dividida pela área.

Para o subobjeto da estrela TMR, altere para o modo de rastreamento para visualizar a intensidade média da fluorescência da estrela TMR ao longo do tempo ou os traços celulares atribuídos aos objetos principais analisados. Analisar um número maior de células permite uma primeira visão representativa e objetiva, mas a quantidade de células a ser examinada pode ser reduzida mediante seleção de medições que durem pelo menos 140 ciclos e que apresentem alta intensidade máxima de histona H dois GFP. Selecione um traço celular de interesse para visualizar simultaneamente a fluorescência da histona H dois GFP e da estrela TMR no nível individual de células.

Usando o botão direito do mouse, clique em uma célula de interesse e gere uma imagem exportável. Galeria para ilustração da histona H2 GFP e da ciclina B snap TMR star em cada ponto temporal. Altere para o modo de população do software de análise do scanner e delimite a região onde a célula de interesse está representada no dot blot.

Aplicar uma nova janela de gráfico de dispersão à região selecionada e visualizar a intensidade média da fluorescência da TMR star ao longo do tempo. Exportar os dados para o Microsoft Excel para cálculos adicionais. As figuras aqui apresentadas ilustram a cinética da Ciclina B, representada pela curva de intensidade de fluorescência da TMR star de uma célula que prossegue através de uma mitose regular, sem sinais de desalinhamento cromossômico após a compactação do citoplasma, seguindo a ruptura da membrana nuclear ou NEBD, conforme indicado pelo triângulo vermelho. A intensidade de fluorescência da TMR staph mostra um aumento abrupto até que a janela isomórfica seja alcançada.

Quando a célula entra na prometáfase, a intensidade da fluorescência permanece em um nível estável enquanto a célula avança pela prófase e metáfase, e então começa a diminuir rapidamente. Assim que todos os cromossomos estabelecem uma placa metafásica estável, essa diminuição precede a separação dos cromossomos. Durante a anáfase, indicada pelo ponto azul na curva no final da mitose, a cromatina começa a descondensar e a célula adota a morfologia da fase final.

Embora a curva da intensidade de fluorescência se aproxime de uma placaforma, que é mais baixa do que a placaforma anterior à mitose após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de mitose explorarem o equilíbrio preciso entre o ciclo celular, a degradação e a síntese que regula a progressão mitótica.