Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

O objetivo deste procedimento é monitorar como a proteólise do ciclo B governa o início da anáfase e a saída mitótica. Isso é feito pela primeira semeadura de células repórter de encaixe B cíclicas em lâminas de microscopia. O segundo passo é rotular a molécula quimérica do repórter instantâneo da ciclina B com a estrela TMR do substrato fluorescente.

Em seguida, as séries de imagens são adquiridas em uma estação de microscopia. A etapa final é analisar as células e calcular a intensidade da fluorescência da estrela TMR ao longo do tempo, o que reflete a proteólise B cíclica. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência de células repórteres vivas revela a cinética da proteólise B cíclica que ocorre durante a mitose.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o monitoramento do ciclone BGFP, é que o SNAP do ciclone B permite o monitoramento da degradação do ciclone B em vez da expressão de toda a proteína. As células repórter instantâneas para este experimento podem inicialmente crescer de forma assíncrona na fase logarítmica por pelo menos 48 horas. Para começar, o procedimento para semear tripsina é a subconfluência de células repórteres para semeadura de células em oito câmaras de microscópio de poços em uma distribuição constante por toda a superfície da centrífuga da câmara.

10.000 células e Resus gastam em 350 microlitros, um meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol. Transfira a suspensão celular para a câmara do microscópio para semeadura de células em câmaras de microscópio de oito poços com densidade máxima de células no centro da câmara. Primeiro carregue a câmara com 300 microlitros de meio de crescimento normal livre de feno-vermelho.

Em seguida, adicione 5.000 células cuidadosamente ao centro da câmara do microscópio para semear as células em 96. Placas óticas especiais de poço em uma distribuição constante em toda a superfície da centrífuga de poço, 5.000 células e ressuspendem em 300 microlitros de meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol, dependendo do número total de poços contendo células necessários. Ajuste o número da célula e o volume total do meio de suspensão.

Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de 96 poços para semeadura de células em 96. Placas ópticas especiais de poço com densidade celular máxima no centro do poço. Adicione cuidadosamente 1.500 células em 15 microlitros de meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol em uma pequena gota no centro de cada poço.

Isso restringirá o crescimento celular ao centro do poço. Deixar crescer todas as células germinadas durante, pelo menos, 18 horas em condições normais de cultura de células, 30 minutos antes do início do processo de coloração. Quats de aquecimento de meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol a 37 graus Celsius.

O substrato de encaixe nesta demonstração é a estrela TMR para facilitar o manuseio da estrela TMR dissolvida em DMSO para obter uma solução estoque com uma concentração de 400 micromolares diluídos 0,5 microlitros da solução estoque estrela TMR. Em 200 microlitros de meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol quente para obter uma concentração final de rotulagem de um micromolar. Em seguida, remova o meio de crescimento normal das células de crescimento assíncrono e substitua pelo meio de marcação incube as células no meio de marcação por 25 minutos sob condições de cultura padrão.

Após 25 minutos, remova o meio de marcação e lave as células quatro vezes com meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol quente. Após a lavagem final, incube as células em 300 microlitros de meio de crescimento normal quente livre de vermelho de fenol por 30 minutos antes de transportá-las para o microscópio. Substitua o meio por meio de crescimento normal livre de vermelho de fenol fresco e quente para remover células residuais de transporte de substrato de encaixes não ligados ao microscópio em uma caixa de isopor em um bloco de calor pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Minimizar a variação de temperatura duas horas antes da medição da intensidade de fluorescência. Ajuste a temperatura do ar da câmara climática para 37 graus Celsius no modo seco para levar o microscópio e todos os seus componentes à temperatura desejada. Para evitar condensação e danos subsequentes ao microscópio, é importante pré-aquecer antes de definir a umidade.

Quando todo o sistema de microscópio atingir 37 graus Celsius, ajuste a umidade do ar para 60% e o dióxido de carbono para 5% Inicie o software de varredura ou aquisição e defina as configurações padrão. Defina as posições dos poços a serem analisados. Defina o delta T ou o tempo do ciclo de aquisição e o número absoluto de ciclos de aquisição.

Nesta demonstração. O foco automático de hardware é pré-selecionado para análise de um número maior de poços. Inicie a aquisição e supervisione os dois primeiros ciclos de aquisição.

O microscópio focará no sinal de histona H dois GFP com subsequente aquisição de uma primeira imagem nesse canal antes que o filtro seja trocado e a imagem da estrela TMR correspondente seja adquirida. Isso é repetido para todas as posições dentro de um poço e para cada um dos poços a serem examinados antes de repetir o próximo ciclo. Outra vez. Para analisar perfis proteolíticos, inicie o software de análise de varredura R.

Analise as imagens com os núcleos celulares visualizados pela histona H e duas GFP, definidas como o objeto principal usando um limite baseado na intensidade do sinal e um algoritmo de bacia hidrográfica para auxiliar na separação das células vizinhas. Um subobjeto consistindo de núcleo com citoplasma deve ser criado para análise de estrelas TMR. Propriedades importantes do objeto principal são as posições X e Y, tempo e máximo, e intensidades médias de GFP para o objeto principal e a intensidade total dividida pela área.

Para o subobjeto estrela TMR, altere para o modo de rastreamento para visualizar a intensidade média de fluorescência estrela TMR do subobjeto ao longo do tempo ou traços de célula atribuídos aos objetos principais analisados. Observar um número maior de células permite uma primeira visão representativa e objetiva, mas o número de células a serem examinadas pode ser reduzido por meio de medições com duração de pelo menos 140 ciclos e contendo uma grande histona máxima H de duas intensidades de GFP. Selecione um traço celular de interesse para visualizar a histona H, duas estrelas GFP e TMR fluorescentes simultaneamente no nível de célula única.

Usando o botão direito do mouse, clique em uma célula de interesse e gere uma imagem exportável. Galeria para ilustração da histona H dois GFP e ciclismo B snap TMR estrela para cada vez. Aponte a mudança para o modo de população do software de análise do scanner e bloqueie a região onde a célula de interesse está representada no dot blot.

Aplique uma nova janela de gráfico de pontos à região fechada e visualize a intensidade média de fluorescência da estrela TMR ao longo do tempo. Exporte dados para o Microsoft Excel para cálculos adicionais. As figuras aqui mostram a cinética da ciclina B representada por uma curva de intensidade de fluorescência de estrela TMR de uma célula que prossegue através de uma mitose regular sem sinais de desalinhamento cromossômico após a compactação do citoplasma após a quebra do envelope nuclear ou NEBD, conforme indicado pelo triângulo vermelho A intensidade de fluorescência do estafilococo TMR mostra um aumento abrupto até que a janela isomórfica seja atingida.

Quando a célula entra na prometáfase, a intensidade da fluorescência permanece em um nível estável, desde que a célula prossiga através da prófase e da metáfase, e então começa a cair rapidamente. Uma vez que todos os cromossomos tenham estabelecido uma placa metafásica estável, essa queda precede a separação cromossômica. Durante a anáfase indicada pelo ponto azul na curva na mitose tardia, a cromatina começa a se condensar e a célula adota a morfologia de fase.

Enquanto a curva de intensidade de fluorescência se aproxima do platô, que é menor do que o platô antes da mitose Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da mitose explorarem o equilíbrio apertado entre ciclo, degradação e síntese que regula a progressão mitótica.