Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

Este vídeo descreverá um método prático e inovador para extrair DNA genômico de novo sistema de preservação de proteínas plasmáticas BDP 100, conhecido como tubos P 100 TNA. A extração a partir de tubos de soro e plasma tem sido um procedimento bastante comum no passado, mas a combinação deste novo tubo P 100 com o método de extração aqui apresentado oferece uma abordagem nova e mais simples para recuperar DNA de melhor qualidade com muito menos esforço. O interior do tubo P 100 é revestido com EDTA de potássio e inibidores de protease.

Isso impede a coagulação e estabiliza as proteínas plasmáticas. O sangue é coletado nestes tubos com o objetivo de obter plasma para testes após a centrifugação. O sangue contido em um P 100 se separará em camadas com base na densidade: parte plasmática na parte superior, hemácias na parte inferior e leucócitos.

A camada de buffy coat situa-se entre essas duas camadas. A recuperação do plasma é geralmente o uso principal desses tubos. Diversas medições são realizadas utilizando este plasma, como os níveis de anticorpos e proteínas.

A camada de buffy coat geralmente é descartada, mas, como será mostrado neste vídeo, contém DNA suficiente para diversas análises, incluindo sequenciamento, genotipagem, identificação de biomarcadores, entre outras. Os tubos P100 são compostos por três componentes principais: tampa, tubo e separador. O separador mecânico migra para logo acima da camada de buffy coat.

Para obter acesso à camada de leucócitos, é necessário aumentar a distância entre o separador e a camada de leucócitos. Isso é conseguido com a adição de sacarose a 17%. Normalmente, a camada de leucócitos é descartada junto com o P 102, mas, como será demonstrado neste vídeo, é possível recuperar facilmente quantidade suficiente de DNA dessa camada para realizar diversos testes analíticos antes de retirar os tubos P 100 do congelador a menos 80.

Pré-aqueça um banho-maria a 37 graus Celsius, coloque cada tubo P 100 no banho-maria quente e incube por cerca de cinco minutos para descongelar todas as amostras. Assim que todas as amostras estiverem completamente descongeladas, qualquer soro remanescente acima do separador deve ser removido. Em seguida, adicione cinco mililitros de sacarose a 17% acima do separador. Após a adição da sacarose, centrifugue todos os tubos por 20 minutos a 2.500 ×g. Agora que o separador está na parte superior do tubo e separado do buffy coat, pode ser removido facilmente.

Pulverize etanol a 70% sobre um lenço químico e esterilize um gancho de clipe de papel esfregando completamente toda a superfície. Segure o tubo P 100 em um ângulo de 45 graus com o clipe de papel estéril. Comece a retirar o separador do tubo puxando suavemente a borda do separador e direcionando-o para um saco de resíduos biológicos.

Com o separador removido, retire o máximo possível da camada de sacarose a 17%, sem perturbar a camada do coágulo branco ou a camada de hemácias; o coágulo branco deve agora ser a camada mais superior no tubo. Transfira esta camada para um novo tubo cônico de 15 mililitros devidamente identificado. O volume do coágulo branco removido de cada tubo pode variar, mas deve ser inferior a três mililitros.

Para normalizar o volume de todos os tubos, adicione quantidade suficiente de PBS (solução salina tamponada com fosfato) para ajustar o volume de cada tubo a três mililitros. Agora que todas as camadas de buffy coat estão suspensas em um volume igual, quaisquer hemácias remanescentes devem ser removidas pela adição de nove mililitros de solução de lise de hemácias (RBC).

Em seguida, inverta os tubos várias vezes durante uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente para separar as hemácias lisadas do buffy coat. Centrifugue por cinco minutos a 2.500 ×g; a centrifugação forma um pellet do qual o DNA será extraído. Despeje esse resíduo de cada tubo em um recipiente para líquidos biohazard, deixando um pequeno volume no qual o pellet será ressuspenso. Vortexe o tubo para desprender e ressuspender o pellet.

Adicione três mililitros de solução de lise celular e vortexie vigorosamente por pelo menos 10 segundos. Após a lise celular, as proteínas e o DNA estão agora livremente suspensos na solução e devem ser separados; comece precipitando as proteínas com um mililitro de solução de precipitação de proteínas, e VORTEXANDO em alta por pelo menos 15 segundos. Em seguida, centrifugue os tubos por cinco minutos a 2.500 ×g para formar o pellet das proteínas durante esta centrifugação.

Proceda adequadamente. Rotule um frasco cônico de 15 mililitros para cada amostra que estiver sendo processada em cada novo tubo. Transfira três mililitros de isopropanol a 100%.

Uma vez que as proteínas tenham sido precipitadas e centrifugadas, cada tubo deve apresentar um pellet relativamente grande e um sobrenadante transparente e quase isento de resíduos. Decante o sobrenadante contendo o DNA de cada tubo para o tubo correspondente de isopropanol preparado durante a última centrifugação. O isopropanol deve provocar a precipitação do DNA na solução, formando pequenos filamentos brancos e esbranquiçados. Inverta todos os tubos 50 vezes para garantir uma boa mistura. Em seguida, centrifugue todos os tubos por três minutos a 2.500 ×g para formar um pellet de DNA. O DNA geralmente é visível como um pequeno pellet branco no fundo do tubo. No entanto, um baixo rendimento de DNA pode ser invisível a olho nu. Prossiga com todas as extrações até que as concentrações sejam medidas.

Independentemente da presença de um pellet de DNA, descarte o sobrenadante de isopropanol. Lave o DNA adicionando etanol 70%. Isso removerá quaisquer componentes residuais indesejados que possam interferir em análises posteriores. Centrifugue por um minuto a 2.500 ×g. Para garantir que o pellet de DNA esteja bem aderido ao fundo do tubo, descarte todo o etanol 70% dos tubos e, em seguida, inverta-os sobre uma toalha de papel limpa para secar ao ar por uma hora.

Não deve haver etanol visível remanescente nos tubos ao prosseguir com o protocolo. O passo final na extração é a ressuspensão do DNA em uma solução. Solução de hidratação de DNA ou água são opções adequadas para a maioria das extrações.

Adicione 250 microlitros a menos de solução de hidratação de DNA para amostras que produzem poucas ou nenhuma mecha ou pellet visível de DNA; vorte suave e gradualmente o DNA para suspender. Por fim, transfira todo o DNA suspenso para um tubo de centrífuga. Neste momento, a concentração e pureza do DNA podem ser medidas por NanoDrop ou outro espectrofotômetro.

De modo geral, espera-se que a pureza do DNA seja próxima à do DNA extraído diretamente de sangue total obtido em tubos com EDTA de potássio coletados exclusivamente para recuperação de DNA. A concentração de DNA depende da quantidade de material inicial, mas pode variar de 50 nanogramas por microlitro a quase 1000 nanogramas por microlitro, com média na faixa de 200 nanogramas por microlitro. A vantagem do uso deste protocolo é dupla. Primeiro, permite que clínicos utilizem uma única coleta sanguínea para dois testes clínicos, em vez de realizarem duas coletas separadas.

Em segundo lugar, simplifica o processo de obtenção de acesso às células contendo DNA ao utilizar tubos separadores mecânicos modernos em vez das gerações anteriores. Nos tubos com gel separador da geração anterior, tanto o próprio gel separador quanto o coágulo sanguíneo atuavam como barreiras às células contendo DNA. Com os tubos P 100, o separador mecânico é facilmente removido utilizando separação por densidade com Sacarose 17%.

Esta é uma captura de tela da leitura do nano drop de uma extração média de DNA. Utilizando este método por amostra P 109, a extração resultou em uma solução de 250 microlitros com concentração de 209 nanogramas por microlitro de DNA. O rendimento total foi de aproximadamente 52 microgramas.

A razão 260 sobre 280, a medida principal para a pureza do DNA, situou-se dentro da faixa ótima de 1,8 a 1,9, com valor de 1,88. Uma medida secundária para a pureza do DNA, a razão 260 sobre 230, foi próxima à faixa esperada de 2 a 2,2, com valor de 2,35.

Estes são resultados bastante típicos. Realisticamente, os rendimentos das extrações variarão em quantidade e qualidade, dependendo do volume e estado do sangue antes da extração, utilizando eletroforese em gel padrão com coloração por brometo de etídio. Testes adicionais de qualidade mostram que o DNA genômico extraído de tubos P 100 é tão intacto quanto o DNA extraído de sangue total.

Isso é evidente pela faixa espessa e brilhante que aparece no topo de cada poço contendo DNA genômico. Existem dois benefícios principais em usar este protocolo em vez dos métodos anteriores. Primeiro, ele combina o que normalmente seriam duas coletas de sangue em uma única coleta.

Em segundo lugar, este protocolo é mais rápido e limpo do que um protocolo que envolve tubos típicos com separador de gel SST. Ao eliminar a necessidade de romper o coágulo sanguíneo rotineiramente, os clínicos coletam dois tubos de sangue quando são necessários testes genéticos e sorológicos. Geralmente, utiliza-se um tubo com separador de gel SST, chamado tubo com tampa dourada, e um tubo de EDTA de potássio, chamado tubo com tampa roxa; o soro é removido do tubo SST e o DNA é extraído do tubo com tampa roxa. Com este método, é necessário coletar apenas um único tubo com tampa vermelha P100.

Embora instituições familiarizadas com o método de separação por gel para extração de DNA já possam estar coletando um tubo para testes sorológicos e genéticos simultaneamente, o método aqui apresentado representa uma melhoria incremental, porém substancial, em relação a esses métodos existentes de separador por gel. Ambos os métodos exigem a remoção de algum tipo de separador, embora o gel tenda a ser mais inconveniente que o separador plástico.

Os tubos separadores exigem que o sangue coagulado seja homogeneizado por meio de uma malha metálica antes da extração de DNA. Essa homogeneização pode ser trabalhosa, e a extração de DNA torna-se mais difícil quando há uma quantidade significativa de hemácias, que não contêm DNA. Este método de extração P 100 permite a separação de leucócitos contendo DNA do hematócrito, deixando poucas hemácias para interferir na extração de DNA.

Esse sistema de recuperação de DNA de um tubo plasmático P 100, em vez dos tubos separadores de gel da geração anterior, apresenta diversas vantagens. Os tubos P 100 contêm EDTA, que inibe a endonuclease dependente de magnésio e atua como anticoagulante para prevenir a coagulação sanguínea. O resultado final é uma integridade de DNA maior e um protocolo de extração muito mais simples, notadamente pela eliminação da necessidade de romper e homogeneizar sangue coagulado.

Além disso, o sangue com plasma esgotado pode ser armazenado em P one hundreds, testado indefinidamente por até três anos, até que a extração de DNA seja desejada. Além disso, os clínicos gerariam dados de pacientes mais úteis com menos coletas de sangue e, portanto, com menos estresse para os pacientes submetidos aos Procedimentos.