Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

O objetivo deste procedimento é monitorar o comportamento da cultura de embriões cranianos em sincronia. Sob condições definidas de cultivo. O primeiro passo é coletar os cornos uterinos de um camundongo prenhe com tempo determinado.

8,5 dias após o acasalamento. Após o isolamento, os embriões são removidos do decíduo e o saco vitelino é removido para genotipagem. Em seguida, os mesenquimas cranianos são microdissecados e transferidos para placas de cultura tecidual revestidas com matriz extracelular.

Os explantes X são deixados aderirem e cultivados por até 48 horas na presença ou ausência de agentes farmacológicos definidos. Por fim, são obtidas imagens dos explantes para mostrar as diferenças na migração celular. Este método é útil para responder perguntas fundamentais, como quais são as vias de sinalização e as proteínas da matriz extracelular envolvidas e que controlam o comportamento do cran durante a elevação do dobramento neural.

A demonstração visual deste método é essencial porque os passos da microdissecção são difíceis de aprender e exigem paciência e prática para serem dominados. Para começar, se a imuno-histoquímica for realizada, prepare lamínulas; caso contrário, pule este passo e revista diretamente as placas de cultura de tecidos com lamínulas circulares de vidro esterilizadas de 12 milímetros de diâmetro em ECM, mergulhando-as em etanol. Deixe secar ao ar. Em seguida, coloque uma lamínula esterilizada em cada poço de uma placa de 12 poços.

Trabalhando em uma capela de fluxo laminar, adicione um mililitro de matriz extracelular ou ECM para revestir as lamínulas ou o fundo de uma placa de cultura de tecidos. Incube a placa a 37 graus Celsius por três horas; após a incubação, aspire a solução de ECM e lave três vezes com PBS. Neste ponto, as placas revestidas podem ser usadas imediatamente ou acondicionadas e armazenadas a quatro graus Celsius por até duas semanas.

Ade na visualização do embrião translúcido. Placas de proteção Syl com fundos pretos resistentes são preparadas. Seguindo o protocolo do fabricante.

Prepare as ferramentas de dissecação inserindo um alfinete minutian em um suporte para alfinetes. Use uma pedra de afiar para afiar a pinça quando tudo estiver preparado. Colete o útero de um camundongo prenhe com tempo controlado que esteja a 8,5 dias pós quot.

Coloque o útero isolado em uma placa com PBS estéril e lave. Sob um microscópio de dissecação, separe as deciduas individuais usando tesoura e pinça. Remova o tecido conjuntivo uterino com um movimento de rasgo, tomando cuidado para não exercer pressão e fazer o embrião sair da decídua.

Use uma pinça para rasgar cuidadosamente o tecido uterino no lado oposto à placenta. Para expor o embrião envolto pelo saco vitelino, use a pinça para pinçar o embrião e o saco vitelino da placenta e remova o tecido uterino do recipiente. Em seguida, usando a pinça para rasgar suavemente, remova o saco vitelino do embrião.

Coloque a vesícula vitelínica em um tubo eppendorf para genotipagem utilizando uma pipeta, e, após o isolamento, determine o estágio do embrião contando os somitos. Idealmente, o embrião estará entre os estágios seis e dez somitos. Neste estágio, os dobramentos neurais estão apenas começando a se elevar e a morfogênese principal do mesênquima craniano ainda não ocorreu.

Uma vez determinado o estágio, transfira o embrião para uma placa preta de proteção celular contendo DMEM sem vermelho de fenol. Primeiro, sob um microscópio de dissecação com a maior ampliação possível, foque na cabeça do embrião com uma agulha de dissecação em cada mão e disseque a cabeça anterior aos meros rmba. Em seguida, corte ao longo da linha média até bi.

Disseque a cabeça em duas metades iguais com uma agulha de dissecação em cada mão. Disseque as bordas externas ao longo da margem da cabeça do embrião e da linha média. Remova conforme necessário para evitar confundir o explante desejado com tecido indesejado.

O explante conterá crista neural craniana migratória, mesoderma paraxial e ectoderma superficial para remover células fracamente aderidas. Pipete cuidadosamente para cima e para baixo com uma ponteira de pipeta de 200 microlitros. E para Pepin, levante cuidadosamente o explante com uma ponteira de pipeta.

Coloque aproximadamente 10 microlitros de DMEM no centro de um poço de cultura tecidual recoberto, com 20 microlitros de DMEM aquecido suplementado com 15% de FBS; a seguir, a placa de cultura pode ser transferida para uma estufa de cultura tecidual. Após aproximadamente uma a duas horas, o explante estará aderido e pode-se adicionar mais 250 microlitros de meio. Após aproximadamente 24 horas, o explante estará firmemente aderido à lamínula.

Neste momento, agentes farmacológicos podem ser adicionados ao meio após mais 24 horas; as células migrarão dos sítios. Normalmente, imagens são adquiridas para documentar a distância e o número de células que migram dos sítios. Neste ponto, uma vez que os sítios começam a apresentar sinais de viabilidade reduzida com incubações mais longas.

Aqui estão exemplos de células migrando de estruturas cranianas me e plantas chix. Após 48 horas em diferentes substratos, tanto a forma quanto o tamanho das células migrando do explante dependem do substrato. A migração foi suportada em fibronectina, laminina, gel max, ECM e ácido hialurônico.

Após este procedimento, outros métodos como imunofluorescência e imagem em tempo real podem ser utilizados para investigar mais profundamente as vias que regulam o comportamento das células da crista neural durante a elevação do dobramento neural.