Modelos de metástase óssea
4 de setembro de 2012
Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.
O objetivo geral deste procedimento é injetar células tumorais de maneira a induzir o crescimento das células tumorais no osso e a subsequente destruição óssea. Isso é realizado primeiramente ressuspendendo as células tumorais em PBS frio e colocando-as sobre gelo. Em seguida, um número apropriado de células é injetado no ventrículo cardíaco esquerdo ou na tíbia de um camundongo anestesiado.
Em seguida, o crescimento do tumor ósseo e os parâmetros ósseos são monitorados longitudinalmente por meio de múltiplas técnicas de imagem. Por fim, realiza-se a quantificação final dos parâmetros do tumor e do osso. Em última instância, utiliza-se uma combinação de radiografia 2D e 3D com fluorescência ou luminiscência in vivo e ex vivo.
A micro-TC e a histologia são utilizadas para demonstrar o crescimento tumoral e as alterações no microambiente ósseo nos níveis celular e estrutural do crescimento. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da metástase do câncer, como quais fatores no osso permitem a colonização metastática do câncer de mama e de próstata. A demonstração do preparo celular será realizada por Alisa Merkel, assistente de pesquisa no meu laboratório. Mantenha as células por menos de uma semana.
Que mantêm o clone M-D-A-M-B 2 3 1 marcado com GFP em DMEM contendo 10% de FBS e 0,1 miligrama por mililitro de penicilina-estreptomicina a 37 graus Celsius em 5 a 8% de dióxido de carbono. Passe as células com 80 a 90% de confluência e substitua por uma diluição de 1 para 10. Para preparar as células para inoculação, trypsinize-as com 80 a 90% de confluência usando tripsina-EDTA a 0,15% com 10 mililitros.
DMEM gelado com 10% de FBS, transfira imediatamente as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue por cinco minutos. Re-suspenda o pellet em um tubo cônico de 50 mililitros com 25 mililitros de PBS gelado sem cálcio e magnésio e conte as células, descarte as células indesejadas e re-suspenda em PBS gelado numa concentração de 10 elevado a seis células por mililitro para inoculação intracardíaca e 250.000 células por mililitro para injeção intratibial.
Utilizam-se camundongos fêmeas imunocomprometidos com idade entre quatro e seis semanas que receberam uma dieta Tela 29 20 x cinco a dez dias antes da injeção para esses experimentos. Após anestesiar o camundongo em uma câmara com 2,5% de isoflurano, transfira o animal para um cone nasal sob uma capela ventilada e posicione-o em decúbito dorsal. Utilize uma solução de 10% de poviodina para lavar o tórax, seguida por etanol 70%.
Marque o peito do camundongo para a injeção no ponto médio entre a escotadura esternal e o topo do processo xifoide e levemente à esquerda do esterno. Em seguida, usando uma seringa de insulina de 300 microlitros, calibre 28, meia polegada, aspire uma pequena bolha de ar para criar espaço entre o êmbolo e o menisco e aspire 100 microlitros de células enquanto segura a pele do camundongo esticada com uma das mãos.
Mantenha a agulha na posição vertical e insira-a. A inserção bem-sucedida no ventrículo cardíaco esquerdo deve resultar em um pulso distinto de sangue vermelho brilhante na seringa. Nessa profundidade, pressione cuidadosamente o êmbolo da seringa sem movimentar significativamente a agulha, para evitar perfurar o coração ou derramar células na cavidade torácica. Para reduzir o gotejamento de células na cavidade torácica, puxe levemente o êmbolo para criar uma pequena quantidade de pressão negativa.
Em seguida, retire diretamente a agulha do tórax, tomando cuidado para evitar inclinar a agulha durante a remoção, o que pode rasgar o revestimento do coração e causar sangramento. Aplique pressão suave sobre o local da injeção para reduzir o sangramento por cerca de um minuto. Ao remover o cone nasal, mova o camundongo para um tapete aquecido até que esteja totalmente consciente.
Imediatamente antes do procedimento intra-tibial, injete o camundongo com buprenorfina. Após anestesiar o camundongo e posicioná-lo em um cone nasal, limpe ambas as pernas com iodo-povidona a 10%, seguido de etanol, utilizando quatro dedos e o polegar.
Segure suavemente o maléolo lateral, o maléolo medial e a metade inferior da tíbia. Em seguida, dobre a perna para que o joelho fique visível e acessível. Usando etanol 70%, umedeça a pele para aumentar a visibilidade do ligamento patelar subjacente, que deve ser visível como uma linha grossa e branca distinta enquanto segura firmemente o tornozelo.
Insira uma agulha de meia polegada e calibre 28 sob a patela, através do meio do ligamento patelar e até a área intercondilar anterior no topo da tíbia. Use pressão firme e constante com um leve movimento de perfuração para guiar cuidadosamente a agulha através da placa de crescimento. Ao penetrar a placa de crescimento da tíbia, a agulha encontrará uma resistência significativamente menor.
Use um movimento lateral suave da agulha para garantir que ela esteja dentro da tíbia e atravessando a placa de crescimento. O movimento será limitado se a agulha estiver na posição correta dentro da tíbia. Pressione lentamente o êmbolo para injetar 10 microlitros da solução celular.
Quase nenhuma ou nenhuma resistência deve ser sentida neste momento. Em seguida, retire lentamente a agulha. Remova o camundongo da anestesia e mantenha-o sobre uma placa aquecida até que se recupere.
Monitore o camundongo duas a três vezes por semana. Uma variedade de técnicas de imagem, como luciferase, fluorescência de GFP e raio-x, é realizada em camundongos anestesiados. A fluorescência indica áreas de tumor.
Uma varredura estron é usada para localizar lesões. As lesões correlacionam-se com as imagens de fluorescência. Mais detalhes sobre as técnicas de imagem podem ser encontrados na parte escrita deste protocolo.
21 a 35 dias após a injeção. Sacrificar os camundongos utilizando um método aprovado pelo IACUC e armazenar os ossos em formalina 4%. Realizar análise ex vivo utilizando micro-TC e histomorfometria com coloração de hematina e DSN nos ossos isolados. Detalhes podem ser encontrados no protocolo escrito após inoculação intracardíaca ou intra-tibial de células tumorais.
Os camundongos são monitorados semanalmente por radiografia e fluorescência ou luminiscência. As lesões normalmente se tornam aparentes por raios X entre a segunda e a terceira semana. Embora possam ser visíveis por fluorescência e luminiscência já na segunda semana, dependendo do modelo, conforme mostrado aqui, as lesões são visíveis como orifícios escuros no osso e podem se acentuar com o tempo. As lesões foram quantificadas usando análise por Metamorph das radiografias e da fluorescência.
Foram quantificados utilizando o software de aquisição e análise de imagens Maestro. Nesta figura, a perda óssea é quantificada por meio de análise de micro-TC. Os dados estruturais e minerais ósseos obtidos por meio de medições de micro-TC são representados como imagens tridimensionais de osso saudável e de osso com tumor, onde as áreas de destruição óssea são mostradas como regiões vazias.
A geometria histo-morfológica foi então realizada nas amostras para determinar a carga tumoral e o volume ósseo em relação ao volume do tecido. Ao tentar executar esses procedimentos, é importante ser paciente e posicionar cuidadosamente cada camundongo, monitorando-os de perto. Se começarem a morrer, isso provavelmente se deve ao agregamento celular e você deve preparar novas células imediatamente.
A pior coisa que você pode fazer é se apressar nos procedimentos ou se frustrar. Lembre-se, com mais prática e tempo, você ficará melhor e mais rápido após o seu desenvolvimento. Essas técnicas abriram caminho para que pesquisadores de câncer estudassem metástase óssea in vivo.
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Visão Geral
Este protocolo descreve métodos para inoculação de tumores em camundongos para estudar a metástase óssea do câncer. Ele detalha a injeção de células tumorais e o subsequente monitoramento do crescimento do tumor ósseo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Metástase Óssea
Antecedentes
- Modelos animais são essenciais para o estudo da metástase do câncer.
- O osso é um local comum para metástase do câncer.
- Compreender o crescimento tumoral no osso pode auxiliar no desenvolvimento de tratamentos.
- Técnicas de monitoramento são cruciais para avaliar a progressão tumoral.
Objetivo do Estudo
- Descrever métodos de inoculação tumoral para estudos de metástase óssea.
- Detalhar análises para monitoramento do crescimento tumoral.
- Fornecer um protocolo para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Injeção de células tumorais no ventrículo cardíaco esquerdo ou na tíbia de camundongos anestesiados.
- Uso de PBS frio para ressuspendência celular.
- Monitoramento longitudinal do crescimento do tumor ósseo por meio de técnicas de imagem.
- Quantificação final dos parâmetros do tumor e do osso.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida do crescimento de células tumorais no osso.
- Técnicas de monitoramento forneceram informações sobre a progressão tumoral.
- Análises quantitativas revelaram destruição óssea significativa.
- Combinação de imagens in vivo e ex vivo aprimorou a precisão dos dados.
Conclusões
- O protocolo demonstra efetivamente métodos de inoculação tumoral.
- O monitoramento e a quantificação são fundamentais para compreender a metástase óssea.
- Os achados contribuem para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos confiáveis in vivo de metástase óssea é essencial para avaliar candidatos terapêuticos que visam as interações tumor-ósseo. Esses modelos permitem a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer as vias de colonização, proliferação e osteolíticas em um sistema relevante para a doença. A abordagem reforça a confiança preditiva na identificação de compostos líderes e na priorização pré-clínica para indicações de câncer de mama, próstata e pulmão.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas por meio do monitoramento da parada tumoral, sobrevida e proliferação no osso após inoculação intracardíaca.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos utilizando um clone altamente seletivo para osso do MDA-MB-231-GFP, com metástase fora do alvo mínima.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir variantes com tropismo ósseo de linhagens com tropismo para pulmão, fígado ou adrenal.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em etapas subsequentes mediante monitoramento longitudinal da carga tumoral.
- Valor Operacional: Padroniza procedimentos de inoculação (intracardíaca ou intratibial) para garantir reprodutibilidade entre os sistemas modelo.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma para múltiplos tipos de tumores (PC-3, carcinoma de pulmão, tumores do coxim adiposo mamário) sob protocolos consistentes de monitoramento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a continuidade translacional do descobrimento até a validação pré-clínica, correlacionando saídas de fluorescência, raios X e histomorfométricas com a carga tumoral.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a quantificação de pontos finais de destruição óssea utilizando micro-TC e histologia.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece os mecanismos moleculares que controlam o estabelecimento e o crescimento de tumores no microambiente ósseo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir o monitoramento da arrestação de células cancerígenas no osso, sobrevivência, proliferação e estabelecimento tumoral.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio por meio de monitoramento semanal por raios X, fluorescência e luminiscência, com lesões detectáveis a partir da segunda semana.
- Análises: Fornece leituras quantitativas por meio da análise de radiografias com o software Metamorph e do software de imagem Maestro, permitindo a comparação de dados estruturais e minerais ósseos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de análises ex vivo utilizando micro-TC e histomorfometria com coloração por hematina e DSN em ossos isolados.
- Reutilização Corporativa: Estrutura o fluxo de trabalho de inoculação e monitoramento como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista nas interações tumor-osso.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos procedimentos de inoculação intracardíaca e intratibial.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou não, eficiência no uso de capital e redução do risco biológico em estágios avançados em programas de metástase óssea.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em métricas quantitativas de destruição óssea e carga tumoral.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em procedimentos cirúrgicos em camundongos, incluindo técnicas de injeção intracardíaca e intratibial sob anestesia.
- Depende de instrumentação para monitoramento longitudinal (raio X, fluorescência, luminiscência) e análise final (micro-TC, histologia).
- Necessita padronização entre equipes no preparo das células (MDA-MB-231 marcadas com GFP em DMEM com 10% de SBF e penicilina-estreptomicina) e nas concentrações de inóculo (10^6 células/mL para injeção intracardíaca, 2,5×10^5 células/mL para injeção intratibial).
- Envolve considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo camundongos BalbC atímicos imunocomprometidos (nus) alimentados com dieta Teklad 2920 antes da injeção.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de evitar agregação celular e preparar células frescas caso ocorra mortalidade dos camundongos durante os procedimentos.
