Name: Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda a diferenciar progenitores neurais fetais humanos em oligodendrócitos usando meios específicos e fatores de crescimento. Este protocolo gera populações puras sem células de suporte para estudos de biologia e doenças.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa intramuros no National Institutes of Health, NINDS. Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do Laboratório de Medicina Molecular e Neurociência, Rick Dreyfuss para ajudar com microscopia e peneiramento Pamela C. para ajudar com a edição.

Nota: Para a cultura de rotina de células progenitoras neurais e células da linhagem oligodendrocytic, a incubação é realizada a 37 ° C em 5% de CO 2 humidificado atmosfera. Cada 2 dias, o meio é substituído com 50 a 100% de meio fresco se a cultura é de 40-70% confluentes. No momento da confluência perto, as culturas são passadas a 2-2.5e6/T75 frasco geralmente num plano semanal. 1. Preparando o balão revestido <ol><li> Para preparar frascos revestidos diluir 5 mg de poli-D-lisina (PDL) em 100 ml de água desionizada (DI-água), em seguida, casaco frascos T75 com 50 ug / ml de PDL à temperatura ambiente (TA) no escuro. Após 1 ½ hora, aspirar o PDL e lavar os frascos de uma vez com DI-água. Deixe os frascos secos antes de semear as células (Tabela 1). </li></ol> 2. Começando diferenciação das células progenitoras neurais em oligodendrócitos Progenitoras derivados (DOP) O protocolo para seolate células progenitoras do SNC é descrito numa publicação anterior e não faz parte do presente protocolo 1. As células progenitoras do SNC, foram isolados do telencéfalo de um cérebro de 8 semanas de gestação fetal, obtidas em conformidade com as directrizes de NIH. <ol><li> Crescer população multipotencial das células progenitoras neurais em PDL frascos revestidos em meio neurobasal suplementado com 25 ng / ml de bFGF e 20 ng / ml do factor de crescimento epidérmico (EGF) (Figura 1A). Não usá-los se for maior do que a passagem 11 (p11). </li><li> Começam a diferenciar as células progenitoras neuronais, quando a cultura é de aproximadamente 70% confluentes. </li><li> Fazer meio de diferenciação completa oligodendrócitos usando DMEM livre de soro / HAMS F12 01:01 suplementado com albumina de soro bovino, L-glutamina, gentamicina, componentes N2, T3, Shh, NT-3, bFGF, e PDGF-AA (Tabela 1) . Este meio será definida como o meio de oligo com factores de crescimento (meio de oligo + GF). </li><li> Remover PROGENItor media dos frascos, lave as células uma vez com salino tamponado com fosfato (PBS), em seguida, adicionar meio de oligo + GF (detalhes descritos em 2.3) para iniciar a diferenciação oligodendrocítica. Apenas as células comprometidas com a linhagem oligodendrocytic crescerá (Figura 1B). Cultura das células neste meio durante 3 semanas. </li><li> Cada semana, quando as células estão a 90-95% de confluência passagem, eles utilizando tripsina (0,05%), EDTA (0,1%) (4 ml para um frasco T75). Transferir todo o meio a partir das células para ser passado para um tubo cónico de 50 ml, o meio condicionado será utilizado para temperar a tripsina. Certifique-se de não secar as células. Em seguida, adicionar tripsina. </li><li> Incubar as células em tripsina durante 5 min à TA, batendo suavemente o frasco várias vezes para ajudar destacamento celular. </li><li> Extingue-se a tripsina por adição de 4-5 ml de meio condicionado para o balão com as células isoladas. </li><li> Transferir o meio e as células para o mesmo tubo cónico de 50 ml. Centrifuga-se o meio e as células a 1200 rpm (~300 xg) durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento de células, inclinando gentilmente o tubo e, em seguida, adicionar meio fresco oligo + GF. Gentilmente pipeta meio e as células para cima e para baixo para se obter uma suspensão de célula uniforme. </li><li> Contar as células e 2.5e6 de transferência em cada novo PDL revestido T75 frasco. </li></ol> 3. Etapa final da diferenciação de oligodendrócitos <ol><li> Após 3 semanas de cultura em meio de oligo + GF, quando as células estão a 70-80% de confluência, iniciar o processo final de diferenciação (Figura 1C). </li><li> Preparar meio da mesma maneira como o meio de oligo + GF mas sem adicionar o GF quatro: Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA. Este meio sem o GF quatro serão definidos como oligo meio - GF. </li><li> Aspirar o meio de oligo + GF do frasco, lavar uma vez com PBS e, em seguida, adicionar um volume total de 16 ml de meio, que de ¾ (12 ml) é oligo meio - GF e ¼ (4 ml) é PDN meio condicionado, por 6-10 Dias). O uso de meio condicionado a partir de PDN não é crítico para o processo de diferenciação ou a sobrevivência das células. Nós, de facto, observou-se que só o contacto directo com as células de DOP PDN em experiências de co-cultura tinha um efeito sobre a duração da sobrevivência DOP. O tempo de sobrevivência médio em oligo - GF pode ser prolongada até duas ou três semanas, se as células de DOP são co-cultivados com células PDN. O protocolo para diferenciar as células progenitoras neurais em PDN é descrito numa publicação anterior e não faz parte do presente protocolo 1. Retirada do factor de crescimento a partir dos resultados de cultura de média em cultura progressivamente diferenciadas de células com vários processos (Figura 1D). </li></ol> 4. Ensaio de Citometria de Fluxo O ensaio de citometria de fluxo compara a aquisição de marcadores de oligodendrócitos, durante o processo de diferenciação, em relação com as da sua população parental. <ol><li> Use pró neuralgenitores como controle. Semente de células DOP 2.5x10 6 células em dois frascos T75 revestidos com poli-D-lisina em meio de oligo + GF. </li><li> Uma semana mais tarde, substitua meio com meio fresco oligo + GF em frascos como uma cultura de controlo para a viabilidade celular, enquanto que outros frascos tinham oligo meio - GF. </li><li> Para dissociar as células em ambos os meios DOP usar 20 U / ml de papaína e não tripsina. Isto é porque a papaína tem um suave efeito sobre as células durante a dissociação preservação da morfologia celular. </li><li> Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Earle (EBSS) para um frasco de papaína. Colocar o frasco a 37 ° C durante 10 minutos ou até que a papaína esteja completamente dissolvido e a solução é mais clara. Esta é a solução de papaína utilizada para dissociar as células. </li><li> Adicionar 0,5 mL de EBSS para um frasco de desoxirribonuclease I (DNase) (Tabela 1). Misture delicadamente. Adicionar 0,25 ml desta solução para o frasco de papaína dissolvida. Esta preparação contém uma concentração final de aproximadamente 20 U / ml de papaina, e 00,005% de DNase. </li><li> Solução de papaína lugar (como descrito acima), em que as células e incubar a 37 ° C durante 15-30 min; monitorar o desprendimento das células utilizando um microscópio. Parar a reacção com 5 ml de meio com ou sem GF e centrifugar a 1200 rpm durante 7 min. </li><li> Transferir os sedimentos celulares a partir de ambos os balões em dois diferentes tubos de 5 ml de polipropileno e lavá-las com meio fisiológico normal (NPM: 145 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM de Hepes e 10 mM de glucose) suplementado com 1 mg / ml albumina de soro bovino (BSA + NPM). </li><li> Executar superfície imunocoloração a 4 ° C durante 20 minutos utilizando específicos e apropriadamente titulado anticorpos primários para A2B5, O4, GalC (Tabela 2). </li><li> Lavar as células com NPM + BSA a 4 ° C durante 5 min e incube-as com anticorpos específicos secundários, a 4 ° C durante 20 minutos (Tabela 2). </li><li> Para corar os antigénios intracelulares, incluindo nestina, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), classe III e serta;-tubulina e a proteína básica mielina (MBP) (Tabela 2), as células fixar em 2% de paraformaldeído (PFA), durante 20 min à TA e permeabilizar com etanol a 70% frio durante 15 min a -20 ° C. </li><li> Lavar as células com PBS 1x e incubar com anticorpos específicos secundários (Quadro 2). </li><li> Para discriminar entre células intactas e fragmentos subcelulares, durante a análise de citometria de fluxo, corar as células com 4,6-diamidino-2-phenyllindole, o dicloridrato de (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Na otimização do protocolo acima, foram realizados todos os experimentos de controle apropriados para confirmar a especificidade de cada imunorreagente. Resumidamente, para os anticorpos marcados directamente, o controlo negativo adequado era um anticorpo conjugado directamente da mesma classe de imunoglobulinas do isotipo (ou subclasse) e conjugado de fluorocromo como o anticorpo primário (isto é, o controlo de isotipo). Para imunomarcação indireta de anticorpos primários, o adequado controle negativo wcomo anticorpo secundário conjugado com o fluorocromo de interesse que especificamente dirigida a classe de imunoglobulina (ou subclasse) do hospedeiro, em que o anticorpo primário foi gerado. Quando os anticorpos primários a partir de hospedeiros múltiplos (rato, coelho e galinha) foram utilizados em conjunto, utilizou-se o anticorpo secundário de segmentação do anticorpo primário de cada máquina e cada um anticorpo secundário usado foi tipicamente cruzada adsorvido contra as imunoglobulinas de outros hospedeiros para minimizar transversal imunorreatividade hospedar. Os controlos positivos incluíram imunocoloração directa ou indirecta de preparações de células que se sabe expressarem os antigénios de interesse utilizando quer imunorreacções, directas ou indirectas, com os anticorpos primários específicos para estes antigénios. Os métodos de optimização acima foram efectuados uma vez para cada tipo de imunocoloração experimentos. Imunorreacções de controlo não revelou imunorreactividade cruzada epítopo significativa entre os anticorpos primários e secundários. A citometria de fluxo foi realizada de forma uniformesuspensão de células marcadas por fluorescência utilizando um classificador FACVantage célula SE (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado com três lasers, que proporcionam comprimentos de onda de excitação de 488 nm sintonizados, 647 nm, e uma gama de UV (351-364 nm) (Figura 2) . </li></ol> 5. Ensaio de Imunofluorescência Nota: Para as experiências de imunofluorescência, DOP são plaqueadas em meio de oligo + GF ou meio de oligo - GF em 2.5e5 em placas de 6 poços revestidas com PDL. As células são fixadas em 2% de PFA em vários pontos de tempo após a retirada de factores de crescimento. O anticorpo mancha é realizada em placas de 6 cavidades de plástico em vez de lamelas de vidro. <ol><li> Remova a mídia e adicione o PFA 2%. Incubar durante 10 min à TA. Descarte PFA. Lavar as células 3 vezes com PBS, 5 minutos de cada vez. Tenha cuidado para não secar as células. </li><li> Permeabilizar as células para marcadores intracelulares utilizando solução de triton 0,25% em PBS durante 10 min à RT. </li><li> Para evitar ligação não específicos de células, bloco fou 10 min com HHG (1 mM de tampão HEPES, soro de cavalo a 2% e soro de cabra a 10% em solução salina equilibrada de Hanks). Diluir anticorpos específicos primários (Tabela 2) até uma concentração pré-determinada em HHG. Coloque anticorpos diluídos em células. Incubar 1 hora à temperatura ambiente no agitador ou a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar as células 3 vezes com PBS, durante 5 minutos de cada vez. Diluir anticorpos secundários apropriados (Tabela 2), acoplado com um fluorocromo a uma concentração pré-determinada em HHG. Coloque a mistura de anticorpos secundários diluídos em células. Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador no escuro. </li><li> Lavar as células 3 vezes com PBS, durante 5 minutos de cada vez. </li><li> Para evitar a fotodegradação adicionar 10 ul de Prolong ouro com DAPI para as células e colocar uma lamela de vidro em cima deles. Visualizar as células marcadas, utilizando um microscópio de fluorescência Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve como para derivar a partir de oligodendrócitos fetais humanas primárias células progenitoras neuronais e caracterizar o fenótipo de citometria de fluxo utilizando ambos e coloração por imunofluorescência. A expansão eo crescimento de células progenitoras neurais de SNC fetal foi muito bem descrito 1-4. No entanto, a obtenção de oligodendrócitos humanos suficientes para experimentação in vitro continua a ser difícil, embora seja possível identificar e isolar precursore...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> DME / PRESUNTOS F12 01:01 </td><td> Omega Cientista </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Bovine Albumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> Componentes N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 ^ g / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Qualidade Biologicals </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNase frascos </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Ouro comDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primário Abs (todos a 1 ug / ml) </td><td></td><td> Isotype espécies </td><td> Fonte </td><td> Abs secundário </td></tr><tr><td colspan="5"> Citometria de Fluxo </td></tr><tr><td> A2B5-Biotina </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Dom J. Nielson </td><td> Estreptavidina PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Presente de J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Mouse </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Frango </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestina </td><td> Mouse </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> tubulina βIII </td><td> Mouse </td><td> IgG2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG-2-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Imunocitoquímica </td></tr><tr><td> tubulina βIII (1:1,500) </td><td> Mouse </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Frango </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Mouse </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Coelho </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabela 2 Os anticorpos (Abs) utilizados para ensaios de citometria de fluxo e imunocitoquímica conjugados de anticorpos: PE, ficoeritrina; PETR, ficoeritrina Texas Red; AMCA, amino-metil-cumarina-acetato; Cy, cianina; FITC, isotiocianato de fluoresceína de Ig:. Imunoglobulinas. . AF: Alexa Fluor; gαm: cabra anti-rato; gαrb: cabra anti-coelho; dαck: burro anti-galinha. </td></tr></tbody></table>

progenitor derivado sistema de cultura oligodendroglial cérebro fetal humano

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Diferenciação de progenitores neurais humanas em tipos de células neuronais e gliais oferece um modelo para estudar e compará-regulação molecular do desenvolvimento neural de células de linhagem. Expansão in vitro de células progenitoras neurais a partir de tecido fetal CNS tem sido bem caracterizado. Apesar de a identificação e isolamento de células progenitoras da glia do adulto assunto sub-cortical humano branco e desenvolvimento de várias condições de cultura de diferenciação directa de progenitores neurais fetais em oligodendrócitos de mielina que produzem, adquirindo suficientes oligodendrócitos humanos para experimentação in vitro continua a ser difícil. Diferenciação de galactocerebrósido + (GalC) e O4 + precursor oligodendrócitos ou células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurais tem sido relatado o uso de segundo trimestre cérebro fetal. No entanto, estas células não proliferam na ausência de células de suporte, incluindo os astrócitos e neurónios, e são rapidamente perdidos ao longo do tempo na cultura. Permanece a necessidade para um sistema de cultura para a produção de células da linhagem de oligodendrócitos adequado para experimentação in vitro. Cultura de oligodendrócitos humanos primários poderiam, por exemplo, ser um modelo útil para estudar a patogénese da neurotrópicas agentes infecciosos, como o poliomavírus humanos, JCV, que in vivo infecta as células. Estas culturas de células podem também proporcionar modelos de outras doenças desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC). Primária, fetal humano derivado do cérebro, as células progenitoras neurais multipotenciais proliferam in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em neurônios (células progenitoras derivadas de neurônios, PDN) e astrócitos (células progenitoras derivadas de astrócitos, PDA) Este estudo mostra que progenitores neurais pode ser induzida para diferenciar através de muitos dos estágios de desenvolvimento da linhagem oligodendrocytic (progenitor derivados de oligodendrócitos, DOP). Nós, de cultura de células progenitoras neurais em meio isento de soro F12 de DMEM-supcomplementado com um factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 e tri-iodotironina (T3). As células cultivadas são passadas a células 2.5e6 por frascos de 75 centímetros aproximadamente de sete em sete dias. Usando estas condições, a maioria das células na cultura de manter uma morfologia caracterizada por alguns processos e marcadores expressos do pré-oligodendrócitos células, tais como A2B5 e O-4. Quando se remover os factores de crescimento de quatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e adicionar o meio condicionado a partir de PDN, as células começam a adquirir mais processos e os marcadores de diferenciação específicos expressos oligodendrócito, tais como GalC e mielina proteína básica (MBP). Foi realizada a caracterização fenotípica usando multicolor citometria de fluxo para identificar marcadores únicos de oligodendrócitos.

É muito importante para iniciar o processo de diferenciação de uma cultura de células de 70% -80% confluente neural progenitor (Figura 1A). Muitas células irão morrer depois de mudar o meio de cultura de células progenitoras para médio oligo uma vez que inclui fatores de crescimento específicos. Isto indica que o crescimento de células progenitoras neurais não comprometidos com um fenótipo oligodendrocytic não serão suportadas pelo meio novo (Figura 1B). A incubação em meio de oligo + G...

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais proliferam<em&gt; In vitro</em&gt; Enquanto se mantém a capacidade de se diferenciar em neurónios e astrócitos. Este trabalho mostra que os progenitores neurais podem ser induzidas a diferenciar por estágios da linhagem oligodendrocytic por condicionamento com factores de crescimento seleccionados.

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

A diferenciação de progenitores neurais humanos em tipos celulares neuronais e gliais oferece um modelo para estudar e comparar a regulação molecular do desenvolvimento da linhagem celular neural. A expansão in vitro de progenitores neurais de tecido do SNC fetal foi bem caracterizada. Apesar da identificação e do isolamento de progenitores gliais da substância branca subcortical humana adulta e do desenvolvimento de várias condições de cultura para direcionar a diferenciação de progenitores neurais fetais em oligodendrócitos produtores de mielina, a obtenção de oligodendrócitos humanos suficientes para experimentação in vitro continua sendo difícil. A diferenciação de células precursoras ou progenitoras de oligodendrócitos (OPC) GalC+ (galactocerebrosídeo+) e O4+ a partir de células precursoras neurais foi relatada utilizando cérebro fetal do segundo trimestre. No entanto, essas células não proliferam na ausência de células de suporte, incluindo astrócitos e neurônios, e são perdidas rapidamente ao longo do tempo em cultura. Permanece a necessidade de um sistema de cultura para produzir células da linhagem oligodendrocítica adequadas para experimentação in vitro. A cultura de oligodendrócitos humanos primários poderia, por exemplo, ser um modelo útil para estudar a patogênese de agentes infecciosos neurotrópicos como o poliomavírus humano, JCV, que in vivo infecta essas células. Essas células cultivadas também poderiam fornecer modelos de outras doenças desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC). Células progenitoras neurais multipotenciais primárias, derivadas de cérebro fetal humano, proliferam in vitro mantendo a capacidade de se diferenciar em neurônios (neurônios derivados de progenitores, PDN) e astrócitos (astrócitos derivados de progenitores, PDA). Este estudo mostra que progenitores neurais podem ser induzidos a se diferenciar através de muitos dos estágios do desenvolvimento da linhagem oligodendrocítica (oligodendrócitos derivados de progenitores, PDO). Cultivamos células progenitoras neurais em meio DMEM-F12 sem soro suplementado com fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), fator neurotrófico 3 (NT-3), N-2 e triiodotironina (T3). As células cultivadas são subcultivadas a 2,5e6 células por frascos de 75 cm aproximadamente a cada sete dias. Utilizando essas condições, a maioria das células em cultura mantém uma morfologia caracterizada por poucos prolongamentos e expressa marcadores de células pré-oligodendrocíticas, tais como A2B5 e O-4. Quando removemos os quatro fatores de crescimento (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e adicionamos meio condicionado de PDN, as células começam a adquirir mais prolongamentos e a expressar marcadores específicos de diferenciação oligodendrocítica, como GalC e proteína básica da mielina (MBP). Realizamos a caracterização fenotípica utilizando citometria de fluxo multicolorida para identificar marcadores exclusivos de oligodendrócitos.

Este vídeo demonstra um método para diferenciação de células progenitoras neurais primárias humanas fetais em oligodendrócitos. Primeiro, as células progenitoras neurais são cultivadas em meio de progenitor até atingirem quase a confluência C. O meio de progenitor é então substituído por meio para oligodendrócitos, suplementado com fatores de crescimento que promovem o processo de diferenciação. As células são então cultivadas e expandidas por três semanas.O meio para oligodendrócitos suplementado com fatores de crescimento é então substituído por meio para oligodendrócitos sem fatores de crescimento, e as células são cultivadas por mais seis a 10 dias até que alterações fenotípicas sejam observadas por microscopia. A diferenciação é então confirmada por microscopia de imunofluorescência e citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para a linhagem de oligodendrócitos. Por fim, os oligodendrócitos diferenciados com sucesso podem ser utilizados em estudos in vitro da biologia dos oligodendrócitos e de suas interações com agentes infecciosos, como o poliomavírus humano JCV.Uma das verdadeiras vantagens da técnica que estabelecemos neste laboratório, em comparação com o que já está publicado na literatura científica, é que, em nosso sistema, os oligodendrócitos podem ser cultivados e diferenciados sem a necessidade de células de suporte, como astrócitos e neurônios. Outra vantagem do nosso protocolo, na nossa opinião, é que ele possibilita o cultivo de um grande número desses oligodendrócitos precursoras que expressam marcadores como o OH4, podendo ser mantidos em cultura patogênica por muitas semanas, gerando populações celulares numerosas, enquanto mantêm seu fenótipo. O resultado final da diferenciação nos fornece quase uma população pura de oligodendrócitos.Nós mencionamos pela primeira vez a ideia deste método quando lemos a extensa literatura sobre a diferenciação in vitro de oligodendrócitos em células de rato e minhas células. Além disso, diferentes pesquisadores estavam removendo fatores de crescimento de culturas específicas com o objetivo de completar a diferenciação das células. Demonstrará este procedimento com nosso protocolo Alexa Bandon, uma estudante de graduação em nosso laboratório aqui no N-I-N-D-S.Em preparação para a diferenciação, cultive uma população multipotencial de células progenitoras neurais em frascos revestidos com polilisina em meio basal neural, suplementado com BFGF e EGF, descartando quaisquer células não utilizadas. Após 11, quando o cultivo estiver aproximadamente entre 70 e 80% confluentes, inicie a diferenciação. Para isso, aspire o meio de progenitores dos frascos.Lave as células uma vez com PBS e, em seguida, adicione 12 mililitros de meio oligo com fatores de crescimento. Incube as células a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após uma semana, as células remanescentes exibirão uma morfologia bipolar estreita.Uma vez que as células diferenciadas atinjam pelo menos 70% de confluência, remova o meio e transfira-o para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Reserve o meio condicionado salvo para uso posterior. Em seguida, adicione rapidamente quatro mililitros de tripsina 0,05%, EDTA 0,1% às células e incube-as por cinco minutos à temperatura ambiente.Bata suavemente no frasco várias vezes para ajudar na desanexação das células. Após a incubação, interrompa os trips adicionando quatro a cinco mililitros do meio condicionado reservado ao frasco. Em seguida, transfira o meio e as células de volta para o tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue o meio e as células a 310 RCF por sete minutos em temperatura ambiente. Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular batendo suavemente no tubo e, em seguida, adicione meio oligo fresco com fatores de crescimento.Pipete suavemente o meio e as células para cima e para baixo para obter uma suspensão celular uniforme. Conte as células utilizando um hemocitômetro. Em seguida, transfira 2,5 milhões de células para novos frascos T 75 revestidos com poli-L-lisina e coloque o cultivo no incubador após três semanas, quando as células atingirem 80 a 85% de confluência, aspire o meio oligo com fatores de crescimento do frasco.Lave uma vez com PBS e, em seguida, adicione 12 mililitros de meio oligo sem fatores de crescimento e quatro mililitros de meio não condicionado de neurônio derivado de progenitor. Mantenha as células neste meio por seis a 10 dias em dias alternados. Examine as células por microscopia de contraste de fase para avaliar a diferenciação e a confluência e substitua pelo menos 50% do meio após a retirada dos fatores de crescimento; as células desenvolverão progressivamente múltiplos prolongamentos, indicando a diferenciação bem-sucedida das células em oligodendrócitos derivados de progenitor.Neste ponto, os oligodendrócitos derivados de progenitores podem ser utilizados para experimentos de citometria de fluxo ou imunofluorescência, conforme descrito nas próximas seções deste vídeo. O ensaio de citometria de fluxo compara a aquisição de marcadores de oligodendrócitos durante o processo de diferenciação em relação aos da população parental. Células progenitoras neurais humanas são utilizadas como controles C. Em cada um de dois frascos T 75 revestidos com poli-D-lisina em meio oligo com fatores de crescimento, incubados a 37 graus Celsius, colocar 2,5 milhões de células de oligodendrócitos derivadas de progenitores; uma semana depois, substituir o meio em um dos frascos por meio oligo fresco contendo fatores de crescimento, como controle de viabilidade celular.Substitua o meio no segundo frasco por meio com oligo fresco sem fatores de crescimento. Cultive essas células por até 10 dias; entre três e nove dias após a remoção dos fatores de crescimento, as células começarão a desenvolver mais prolongamentos típicos de um fenótipo de oligodendrócito. Para dissociar as células oligodendrócitas derivadas de progenitores, aspire o meio e adicione 5,25 mililitros de solução perian a cada frasco.Perian é usado em vez de tripsina porque tem um efeito mais suave sobre as células durante a dissociação. Para preservar a morfologia celular, incubar a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos. Verificar periodicamente a dessanexação das células utilizando um microscópio.Uma vez que as células estejam destacadas, adicione cinco mililitros de meio com ou sem fatores de crescimento para interromper a reação. Em seguida, transfira o conteúdo de cada frasco para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 310 RCF durante sete minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda os pellets celulares em quatro mililitros de meio fisiológico normal, suplementado com um miligrama por mililitro de albúmina sérica bovina ou NPM mais BSA.Em seguida, conte as células como antes e, para cada condição de imunomarcação, aloque 1 milhão de células em um tubo de polipropileno de cinco mililitros. Certifique-se de incluir todos os controles apropriados para confirmar a especificidade de cada reagente imunológico. A seguir, para realizar a imunomarcação, as células são primeiro incubadas com anticorpos contra as proteínas de superfície A dois B 5, 0 4 e gal C. As células são então lavadas para remover os anticorpos primários não ligados e incubadas com os anticorpos secundários marcados com fluorocromo apropriados.As células são então lavadas novamente para remover os anticorpos secundários. Fixadas com paraldeído 2% e permeabilizadas com etanol 70% frio, as células são lavadas e, em seguida, incubadas com anticorpos contra nestina, proteína ácida fibrilar de células da glia, tubulina beta classe III e proteína básica da mielina para coloração de proteínas intracelulares. Após a remoção dos anticorpos primários não ligados por lavagem.As células são incubadas com os anticorpos secundários adequados marcados com fluorocromo. Finalmente, para discriminar entre células intactas e debris subcelular durante a análise de citometria de fluxo, as células são mantidas com quatro seis DIA medino. Dois fenóis Lind diidrocloridrato ou dappy realizam a citometria de fluxo em um instrumento equipado com três lasers, que fornecem comprimentos de onda de excitação ajustados a 488 nanômetros, 647 nanômetros e uma faixa ampla de UV. Em preparação para microscopia de imunofluorescência, prepare seis lamínulas revestidas com poli-D-lisina.Placas de seis poços com 250.000 células de oligodendrócitos derivados de progenitores por poço. Duas placas são necessárias para cada ponto temporal. Uma cultivada com fatores de crescimento e outra sem, quando as células estiverem com 70 a 80% de confluência.Aspire o meio com fatores de crescimento da placa. Lave uma vez com PBS e, em seguida, adicione 12 mililitros de meio sem fatores de crescimento. Realize a imunomarcação cinco e nove dias após a retirada dos fatores de crescimento conforme segue: primeiro, fixe as células com PFA 2% por 10 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, descarte o PFA e lave as células três vezes com PBS, cinco minutos cada vez. Então, trate as células com triton a 0,25% para, em seguida, bloquear a ligação inespecífica com soro de cavalo a 2% e soro de cabra a 10%. Após o bloqueio, incube as células com anticorpos contra beta três tubulina, G-F-A-P-M-V-P oh quatro e Gal C. Lave então os anticorpos não ligados das células e incube as células com os anticorpos secundários marcados com fluorocromo apropriado.Lave os anticorpos secundários não ligados das células e, em seguida, evite o fotodesbotamento e a descoloração. Monte o núcleo com a lamínula utilizando 10 microlitros de prolongado ouro com dpi.Visualize as células marcadas utilizando um microscópio de fluorescência com o conjunto de filtros apropriado para determinar se as células progenitoras neurais primárias humanas poderiam se diferenciar em oligodendrócitos. Células progenitoras neurais multipotentes foram cultivadas conforme descrito neste vídeo. As alterações fenotípicas foram então monitoradas por citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência.Como pode ser observado aqui, a maioria dos progenitores neurais expressa o marcador de células-tronco neuroepiteliais nestina, enquanto apenas pequenas subpopulações expressam marcadores restritivos de linhagem, como o marcador de astrócitos GFAP, o marcador neuronal tubulina beta classe III ou o marcador de oligodendrócitos O4. Quando o meio de cultura foi substituído por meio oligo acrescido de fatores de crescimento e as células foram mantidas em cultura por uma semana, observou-se diminuição da expressão de nestina e aumento da expressão de A2B5 após duas semanas.A expressão de nesting foi ainda mais reduzida e a expressão do marcador de precursor neuroglial A dois B cinco aumentou; a expressão de outro marcador de oligodendrócito, oh quatro, também aumentou dois dias após a retirada do fator de crescimento. A expressão de oh quatro e a expressão de GAL C, um marcador tardio de oligodendrócito, aumentaram seis dias após a retirada do fator de crescimento. A coexpressão de oh quatro e gal C aumentou e foi comparável à coexpressão de gal C e MBP.A imunomarcação com múltiplos epítopos revela que 72% das células em cultura expressaram MBP. Evidências adicionais da diferenciação de oligodendrócitos derivados de progenitores foram caracterizadas por meio de um ensaio de imunofluorescência. Dois dias após a retirada dos fatores de crescimento, a expressão de MVP mostrada em verde foi detectada.Isso foi aumentado no quinto dia e aumentado ainda mais no nono dia. A localização da MVP nos oligodendrócitos diferenciados é evidente. Em conjunto, esses dados indicam que culturas de células progenitoras neurais fetais humanas utilizando o método descrito são capazes de proliferar in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar através das etapas das linhagens de oligodendrócitos.Após o desenvolvimento deste protocolo, a técnica permite que pesquisadores nas áreas de biologia do desenvolvimento, neurociência e virologia investiguem a biologia do cérebro humano e as doenças que afetam o cérebro humano, especialmente aquelas que resultam em doenças da substância branca.

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura de neurônios induzidos humanos (iNs) e células precursoras de oligodendrócitos induzidos (iOPCs). Os iNs são misturados com iOPCs em uma co-cultura e depois incubados para apoiar a maturação de ambos os iNs em neurônios e iOPCs em oligodendrócitos. Os neurônios formam conexões sinápticas com outros neurônios e oligodendrócitos, enquanto os oligodendrócitos desenvolvem bainhas de mielina ao redor dos axônios dos neurônios.

Um método de co-cultura para modelar interações neurônio-oligodendrócitos

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) do córtex cerebral de filhotes de camundongos.

Isolando e cultivando células precursoras de oligodendrócitos do córtex cerebral de filhotes de camundongos

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

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Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

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