Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar e identificar bactérias usando sensores eletroquímicos. Isso é conseguido liberando primeiro o RNA ribossômico da bactéria para permitir a hibridização com a sonda do detector fluorado como uma segunda etapa, o RNA ribossômico ligado à sonda do detector é adicionado ao eletrodo de trabalho, o que permite a hibridização com a sonda de captura na superfície do sensor. Em seguida, o conjugado antifluoresceína de rabanete peroxidase pode se ligar à sonda do detector fluorado.

Finalmente, na corrente interferométrica, cuja intensidade está correlacionada com o número de sonda de captura ribossômica, podem ser obtidos complexos de sonda detectora de RNA na superfície do sensor. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos baseados em cultura é que as bactérias podem ser detectadas e identificadas em cerca de 45 minutos, evitando o peso noturno. Para uma bactéria formar uma colônia visível em uma placa EDGAR A aplicação dessa técnica melhoraria o manejo de doenças infecciosas.

Como a detecção precoce de patógenos bacterianos é essencial para a antibioticoterapia direcionada e melhores resultados clínicos. Embora este método seja útil para o diagnóstico de doenças infecciosas, também pode ser aplicado a outros problemas de diagnóstico, como o imunodiagnóstico. Comece incubando a sonda de captura dilatada com hexano di tiol por 10 minutos à temperatura ambiente para garantir que o grupo tiol na sonda de captura seja reduzido, resultando em resultados mais consistentes.

Após a incubação, aplique um fluxo de nitrogênio para produzir ouro. 16 chips de matriz de sensores por cinco segundos para remover qualquer umidade ou partículas, pequenos volumes de líquido precisam ser cuidadosamente aplicados ao eletrodo de trabalho na matriz de sensores. A demonstração visual dessa técnica é crítica.

Como a execução adequada das técnicas de pipetagem, lavagem e secagem reduz muito a variabilidade de cavaco para cavaco. Em seguida, aplique seis microlitros da mistura de sonda de captura dilatada HDT no eletrodo de trabalho de todos os 16 sensores do conjunto de sensores e armazene os chips do sensor em uma placa de Petri coberta a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte, lave os chips do sensor com água deionizada por dois a três segundos e, em seguida, seque os chips sob um fluxo de nitrogênio por cinco segundos. Agora aplique seis microlitros de cloreto de sódio de cloridrato de attri, solução de EDTA MERCAPTOETANOL no eletrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incube os sensores por 50 minutos em uma placa de Petri em temperatura ambiente.

Para preparar as amostras para o ensaio do sensor eletroquímico. Transferir um mililitro de cultura bacteriana na fase logarítmica de crescimento para um tubo de microcentrífuga e, em seguida, centrifugar as células durante cinco minutos a 16 000 gs. Observe que as bactérias patogênicas devem ser manuseadas em um capuz de biossegurança.

Depois de remover o snat, aplique uma ponta de pipeta contendo 10 microlitros de hidróxido de sódio molar no fundo do tubo da microcentrífuga e pipete para cima e para baixo algumas vezes para ressuspender completamente o pellet. Depois de incubar a suspensão em temperatura ambiente por cinco minutos, adicionar 50 microlitros de PBS contendo albumina de soro bovino ou BSA e uma sonda detectora modificada com fluoresceína para neutralizar o lisado bacteriano. Em seguida, incube o lisado neutralizado por 10 minutos em temperatura ambiente.

Comece esta etapa lavando a solução de mercaptoetanol de um dos chips sensores preparados com água deionizada por dois a três segundos. Depois de secar o chip conforme demonstrado, aplique quatro microlitros do lisado de bactérias neutralizadas nos eletrodos de trabalho. 14 dos sensores.

Em seguida, aplique quatro microlitros do oligonucleotídeo de ponte na sonda do detector modificado PBS mais BSA mais fluoresceína aos dois sensores de controle positivo. Depois de incubar o lisado e os sensores de controle positivo por 15 minutos, lave e seque todo o chip do sensor como antes. Agora aplique quatro microlitros de peroxidase de rabanete antifluoresceína ou HRP em PBS contendo caseína nos eletrodos de trabalho de todos os 16 sensores.

Após uma incubação de 15 minutos, lave e seque o chip do sensor. Em seguida, aplique um adesivo de filme na superfície do chip do sensor e carregue o chip na pipeta de montagem do chip do sensor 50 microlitros de substrato TMB em todos os 16 sensores e feche o suporte do chip do sensor. Por fim, use um leitor de chip Helios para obter medições de pirometria e telemetria cíclica para todos os 16 sensores.

O ensaio eletroquímico que acabamos de descrever é estruturado de forma semelhante a um sanduíche, Eliza, como mostrado nesta figura alvo ribossômico, a hibridização de RNA com sondas de captura e detector é desenvolvida por uma reação redox catalisada por HRP conjugado a fragmentos de anticorpos antifluoresceína que se ligam às três ligações de fluoresceína de pinheiro na sonda detectora. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química da superfície do eletrodo de ouro. O eletrodo de ouro é revestido com mercaptoetanol e hine ol e é funcionalizado pela adição de sondas de captura dilatadas.

A hibridização em sanduíche do RNA ribossômico alvo com a sonda de captura e a sonda do detector marcada com fluoresceína resulta em um complexo que é detectado pela adição do conjugado antifluoresceína peroxidase de rabanete e o substrato TMB. A corrente paramétrica M é gerada pelo ciclo redox que resulta da oxidação do TMB pela peroxidase de rábano e da redução do TMB pelos elétrons do eletrodo. Os ensaios demonstrados aqui empregam um chip de matriz de sensores 16 de fluido genético.

Cada um dos sensores da matriz contém três eletrodos, de referência de trabalho e auxiliares, que possuem pontos de contato na borda do chip. O leitor de chip possui pinos pogo que se conectam a cada um dos pontos de contato. O leitor de chip serve como uma interface para o conjunto de sensores com um potenciômetro controlado por um algoritmo de computador.

Aqui, são mostrados exemplos de um fluxo de corrente do sensor eletroquímico. O fluxo de corrente nos sensores é artificialmente alto nos sensores durante os primeiros segundos após o início das medições paramétricas. Devido ao acúmulo de substrato oxidado durante o tempo desde a aplicação do TMB na superfície do sensor, até o início do algoritmo do leitor, o fluxo de corrente atinge rapidamente um estado estacionário e leituras precisas do sensor podem ser obtidas de forma confiável em 60 segundos.

A variabilidade de sensor para sensor é relativamente constante, portanto, é possível realizar 16 ensaios de sensores diferentes em paralelo no gene fluídico 16 chips de matriz de sensores controles positivos e negativos são essenciais como controle positivo. Um oligonucleotídeo de DNA de ponte sintética que hibridiza com as sondas de captura e detector e serve como um alvo sintético de concentração conhecida é usado dessa maneira. Os resultados obtidos usando o oligonucleotídeo de ponte funcionam como um controle de calibração interno para minimizar a variação de chip a chip.

Quanto maior a corrente negativa do eletrodo, maior o sinal. Ao testar sondas de captura e detector. O limite de detecção deve ser determinado pela diluição em série de uma amostra de concentração conhecida, conforme mostrado nesta figura, há uma correlação logarítmica linear entre a concentração da amostra e a saída do sinal na faixa dinâmica do ensaio.

Nesses gráficos de barras, os resultados representativos para amostras contendo esia coli e selo de kleb e amônia, que são freqüentemente encontrados na urina de pacientes com infecção do trato urinário, mostram sinais para a maioria dos sensores serão baixos e semelhantes, e esses resultados negativos podem ser agrupados como a reatividade do sinal de fundo com o par de sondas KE distingue o cânone da e coli. O oligonucleotídeo de ponte serve como um controle positivo e padrão de calibração interna. Esta técnica pode ser aplicada à detecção de bactérias resistentes a antibióticos em amostras clínicas medindo a resposta fenotípica da bactéria aos antibióticos.

Esta técnica pode ser utilizada para determinar a terapia ideal para um paciente individual. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar e identificar bactérias comparando as correntes átricas nos diferentes sensores específicos da espécie no chip.