Fabricação e utilização Piggy-back Multibarrel Eletrodos para Em vivo As manipulações farmacológicas de respostas neurais

Este procedimento tem como objetivo a aplicação ioforética de agentes farmacológicos a microcircuitos no cérebro enquanto se registra simultaneamente a atividade neural. Primeiro, puxe um eletrodo de vidro de barril simples para o registro de célula única e dobre a ponta. Além disso, puxe um eletrodo de vidro multibarril e quebre sua ponta até o diâmetro desejado.

Prossiga com a montagem dos dois eletrodos. Em última análise, o eletrodo produzido é utilizado para gravações extracelulares in vivo, nas quais agentes farmacológicos podem ser aplicados diretamente para manipular microcircuitos neurais. Olá, meu nome é Dr. Achim Klu, e nosso laboratório mostrará a você hoje como produzir eletrodos multibarrel do tipo piggyback.

Esses eletrodos podem ser usados para iontoforese de agonistas e antagonistas neurais no microambiente de um neurônio e, assim, manipular circuitos neurais de um neurônio in vivo. Olá, sou o Dr. An Zillow. Sou pós-doutorando no laboratório do Dr. Ah him Crow e demonstrarei o procedimento hoje. Para um eletrodo de barril simples, utilize uma capilar de vidro de barril simples com filamento e puxe a ponta até um diâmetro de cerca de um a dois micrômetros e um comprimento de haste de 10 a 12 milímetros.

Verifique esporadicamente a resistência do eletrodo puxado preenchendo-o com cloreto de sódio 3 molar e testando-o com um medidor O padrão em solução salina 0,9%. Uma vez que o eletrodo é preenchido com a solução salina, a solução seca rapidamente, tornando o eletrodo inutilizável. Portanto, realize este teste somente quando necessário.

Pise em alguns eletrodos que não serão usados na produção piggyback. Para criar um eletrodo multi-bocal completo, puxe o vidro até obter uma ponta de pipeta com diâmetro total de cerca de 10 micrômetros ou menos. Um eletrodo com ponta corretamente puxada é essencial para o sucesso.

Além de ser longa e fina, a ponta deve permanecer firme e quebrar facilmente até o diâmetro desejado. A ponta será quebrada até o diâmetro correto na próxima etapa. Assim, o tamanho exato da ponta é menos crítico durante o processo de pooling do que a forma geral da ponta do eletrodo, que deve ser longa e relativamente fina.

Agora, segure o eletrodo de barril simples em um ângulo de aproximadamente 45 graus, com a ponta voltada para baixo, e mova-o através da chama relativamente rápido. O objetivo é fazer com que a chama derreta o vidro na região de transição a cerca de 10 milímetros da ponta do eletrodo, curvando-o em cerca de 20 graus. Coloque o eletrodo de múltiplos barris em uma base de massa de modelar sobre uma lâmina de vidro e, em seguida, insira-o nas platinas do microscópio.

Suporte para lâmina Usando os manipuladores XY do estágio do microscópio, mova suavemente a ponta do eletrodo contra o pedaço de plexiglás. Observe a quebra da ponta através das oculares do microscópio. A montagem do conjunto do eletrodo é mostrada aqui.

O eletrodo de múltiplos canais é fixado sobre uma lâmina de vidro na platina do microscópio. Enquanto isso, o eletrodo de canal único é segurado por um manipulador manual de múltiplos eixos, que permite ao usuário posicionar com grande precisão a pipeta de canal único sobre o eletrodo de múltiplos canais. Abaixe o eletrodo de canal único diretamente para dentro do sulco do eletrodo de múltiplos canais, formado pelo arranjo dos cinco canais, de modo que sua ponta ultrapasse a ponta do eletrodo de múltiplos canais em cerca de cinco a dez micrômetros.

Cole os eixos dos dois eletrodos juntos usando cianoacrilato. Comece na posição mais distal das pontas e mova lentamente um palito com uma gota de cola ao longo dos eixos dos eletrodos em direção às pontas dos eletrodos. Aplicar cola muito próxima das pontas dos eletrodos irá entupi-las e tornar o eletrodo pelo menos parcialmente disfuncional.

Misture uma pequena quantidade de cimento dental. Deixe secar por cerca de 15 minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o eletrodo piggyback concluído.

Primeiro, retire do suporte do micromanipulador e, em seguida, solte do lâmina de vidro. Imediatamente antes de usar o eletrodo, prepare-se para preencher cada barril com a respectiva droga. Preencha os quatro barris externos da configuração de cinco barris com quatro drogas de escolha e o barril central com cloreto de sódio 3 molar como barril de equilíbrio.

Em seguida, encha o eletrodo de gravação de barril simples com cloreto de sódio três molar. Agora ligue os módulos da bomba de iontoforese e teste todos os barris. A função de teste do eletrodo de cada módulo da bomba ajudará a determinar se o barril do eletrodo está funcional para gravações no cérebro profundo.

Um eletrodo de cinco canais montado, finalizado, junto com um eletrodo de gravação de canal único possui um eixo longo de cerca de sete milímetros. Vários agonistas e antagonistas sinápticos são comumente usados com iontoforese, bloqueando a inibição por glicina com fármacos como os antagonistas do receptor de glicina. O cloreto de strychnine geralmente aumenta a atividade de disparo em neurônios.

Estes dados amostrais medem a taxa de descarga de neurônios auditivos em função da intensidade, e mostram respostas a estímulos sonoros sinusoidais de intensidade crescente aplicados aos ouvidos do animal. Sons mais intensos resultaram em taxas de disparos mais altas antes da aplicação do agente tóxico nove. A função taxa-intensidade do neurônio mostra taxas de disparos baixas.

A aplicação de uma corrente inicial de iontoforese de 15 nanoampères estimula um leve aumento na corrente de ejeção. Correntes de ejeção progressivamente mais altas bloqueiam progressivamente mais receptores de glicina no neurônio, resultando em taxas de disparo progressivamente mais elevadas. Com uma corrente de 45 nanoampères, todos os receptores de glicina desse neurônio parecem estar bloqueados pelo cloreto de strychnine.

Qualquer aumento adicional da corrente de ejeção e a liberação de quantidades ainda maiores de norepinefrina não resultaram em mudanças adicionais. O nível da frequência de descarga dos neurônios após a terminação da iontoforese mostra função de recuperação completa das respostas neurais ao nível basal após cerca de 25 minutos. Esse processo de recuperação depende do tipo e da quantidade de fármaco ejetado.

É importante lembrar que a droga ferre irá difundir-se para a vizinhança do local de registro e também poderá bloquear receptores em neurônios vizinhos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar um eletrodo de registro com um eletrodo multicanal para drogas, a fim de obter gravações cerebrais profundas com baixo ruído, juntamente com a administração controlada no tempo de até quatro agentes farmacológicos.