Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo C. elegans

Este vídeo demonstra um procedimento para identificar genes que regulam, veja o crescimento de elgan e o tamanho do corpo. Usando interferência de RNA ou olho de RNA para inativar genes candidatos, são preparadas as primeiras placas contendo bactérias que expressam RNA de fita dupla, que têm como alvo os genes de interesse. Os hermafroditas do quarto estágio larval são transferidos para as placas de RNAi.

Quando atingem o estágio de adulto jovem, eles são transferidos para novas placas de RNAI para botar ovos. Depois de várias horas, eles são removidos, deixando populações sincronizadas de embriões. No estágio desejado de desenvolvimento, a progênie foi coletada e montada em lâminas.

Finalmente, imagens microscópicas dos vermes são adquiridas. A análise da imagem demonstra mudanças no tamanho do corpo causadas pela inativação do gene. Embora esse método possa ser usado para identificar reguladores da via de sinalização TGF beta, ele também pode ser aplicado a outras vias que regulam o desenvolvimento pós-embrionário na elegância do mar, como a via de sinalização da insulina.

Comece este procedimento clonando as sequências do gene alvo no vetor L 4 4 4 0 Um plasmídeo de RNAi de verme comumente usado transforma o plasmídeo recombinante na cepa bacteriana. HT um 15 DE três cultura. As bactérias transformadas em placas de ágar LB com 25 microgramas por mililitro de tetraciclina carbônica e 12,5 microgramas por mililitro de tetraciclina e, em seguida, escolhem um único clone para uso futuro.

Enquanto isso, transforme o vetor vazio L 4 4 4 0 na cepa bacteriana. HT um 15. Para usar como controle para a cultura do experimento, as bactérias transformadas em um mililitro de caldo LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina durante a noite a 37 graus Celsius.

A tetraciclina não é adicionada porque diminui a eficiência do RNAI. Adicione mais cinco mililitros de caldo LB com 100 microgramas por mililitro de ampicilina à cultura durante a noite e incube por mais quatro a seis horas a 37 graus Celsius. Quando a cultura estiver pronta, semeie 0,5 mililitros de bactérias experimentais ou de controle nas placas de vermes RNAI rotuladas com o nome do clone apropriado.

Pelo menos duas placas devem ser preparadas para cada condição. Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte.

Deve estar presente um gramado de bactérias que expresse RNAi com ou sem a sequência do gene alvo. Os animais usarão a bactéria como fonte de alimento. Assim que as placas de alimentação RNAI estiverem prontas, as chamas esterilizam a ponta de um fio de platina.

Em seguida, use o fio de platina para transferir seis a dez quartos estágios larvais ou hermafroditas L quatro C elgan para cada placa de RNAi. Deixe os hermafroditas crescerem a 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, os animais serão adultos jovens.

Transfira-os para uma nova placa de RNAI devidamente marcada e preparada. Incube as placas a 20 graus Celsius por quatro a seis horas para permitir que os adultos ponham ovos. Após a incubação, remova todos os adultos do prato para sincronizar a progênie.

Assim que os adultos forem removidos, comece a contar o tempo. Este é o tempo zero. Incube as placas a 20 graus Celsius para permitir que os animais cresçam até o estágio de desenvolvimento de interesse.

Aqui, adultos jovens serão escolhidos para análise fenotípica. Para knockdowns que se desenvolvem a uma taxa normal, é necessária uma incubação de 72 horas. Lembre-se de que vários genes afetam o desenvolvimento animal de maneira diferente, portanto, os tempos de incubação podem precisar ser ajustados.

Se o RNAi faz com que os animais cresçam a uma taxa diferente, os adultos jovens podem ser identificados como aqueles que não passam mais de 24 horas após o L quatro com desenvolvimento VUL completo e dois a seis embriões no útero, como mostrado aqui. Para identificar outros estágios de desenvolvimento, o investigador deve usar o desenvolvimento gonadal e VUL como guia. Uma vez que os animais tenham crescido até o estágio apropriado, prepare-se para pontuar os fenótipos de tamanho corporal dos vermes tratados com RNAi.

Em seguida, coloque duas camadas de fita adesiva colorida em uma lâmina de amostra de vidro com um milímetro de espessura, conforme mostrado aqui. Faça duas dessas lâminas de vidro. Em seguida, coloque uma nova lâmina de vidro entre as duas lâminas com a fita e aplique uma gota de 2%Agros derretido em água.

No centro da nova lâmina de vidro, pressione uma segunda lâmina de vidro na parte superior para fazer uma almofada agros fina. Assim que o agros solidificar, remova o vidro superior. Deslize a corrediça com a almofada agros está pronta para carregar minhocas.

Rotule o slide com o nome do clone. Adicione 10 microlitros de azida sódica 25 milimolares à almofada aros. Em seguida, usando um fio de platina como antes, transfira 30 a 40 animais para a solução azi de sódio.

Para imobilizá-los, coloque uma lamínula na parte superior. Faça isso para animais tratados com RNAi L 4 4 4 0 recombinantes e vazios. Em seguida, coloque a lâmina micrométrica sob o microscópio de dissecação com uma lente objetiva de 2,5 x.

Usando o Q Capture ou software semelhante, capture uma imagem da régua do micrômetro e salve-a. Em seguida, coloque os vermes sob a mira e capture as imagens. Para medir o comprimento do corpo primeiro, abra a imagem da régua do micrômetro no software Image Pro.

Em seguida, clique em medir e escolha calibração. Em seguida, escolha o assistente de calibração espacial com calibrar a imagem ativa selecionada. Clique em próximo.

Insira o nome da calibração e certifique-se de que as unidades de referência espacial estejam definidas como mícrons. Em seguida, marque o botão Criar uma calibração de referência e clique em Avançar. Clique em desenhar linha de referência.

Uma barra de escala de referência aparecerá. Reposicione a barra de escala para corresponder às extremidades do micrômetro. Em seguida, indique que a referência indica 1000 unidades.

Clique em OK. Em seguida e termine. Depois que o software estiver calibrado, abra uma imagem de worm.

Em seguida, no menu de medidas, selecione calibração e clique em selecionar espacial. No menu suspenso, selecione o file nome criado para a calibração do micrômetro. Em seguida, no menu de medidas, selecione medidas na janela que se abre.

Selecione a ferramenta de desenho livre e, usando o mouse do computador, trace uma linha através do centro do corpo do animal da cabeça à cauda. O comprimento será relatado na janela. Repita este processo para todos os animais no campo.

Exporte as medidas de comprimento para um arquivo do Microsoft Excel ou outro software estatístico adequado. Analise os dados calculando a média e o desvio padrão para cada amostra. Em seguida, compare os resultados de cada grupo usando o teste T de um aluno.

O fator de crescimento transformador beta ou TGF beta SUPERFAMILY protein DBL one é necessário para a ativação da via TGF beta. Em resposta à ativação do sinal, os transdutores de sinal smad intracelulares se translocam para o núcleo e iniciam a transcrição do gene. Veja elegância em que a via beta do TGF é interrompida tem um tamanho corporal menor, incluindo um comprimento corporal menor do que os animais do tipo selvagem.

Assim, telas para a elegância do mar. Os mutantes de tamanho corporal são capazes de identificar componentes e modificadores de sinalização TGF beta para testar a eficácia do RNAi alimentando-se para a identificação de mutantes de tamanho corporal. O RNAi foi usado para derrubar os componentes da via DBL um, SMA três, em SMA, seis, em quatro cepas diferentes de elegância do mar.

As cepas C elegance testadas incluíram duas que são RN AI hipersensível A um, Lin 15 B e RF três, bem como a cepa padrão do tipo selvagem N dois e a cepa LIN 36, cuja sensibilidade ao RNAi é semelhante à N dois, conforme mostrado aqui. Quando a expressão de SMA três ou SMA seis foi interrompida, os animais exibiram um tamanho corporal significativamente menor do que os animais de controle, exceto SMA seis RNAi em Lin 36. Antecedentes em RF três.

Os comprimentos corporais de fundo de adultos jovens após o tratamento com RNAi foram de 84 a 95% do vetor sozinho. Em A um Lin 15 B, os comprimentos corporais de adultos jovens após RNAi foram de 68 a 86% dos animais de controle. No entanto, a cepa A one lin 15 B produz progênie view.

Isso os torna inadequados para triagem em larga escala. Portanto, sugere-se o uso da linhagem RF três para essas técnicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar genes que regulam o crescimento e o tamanho do corpo usando a técnica de interferência de RNI.