RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um processo completo e detalhado para aplicar o RNA-Seq, uma poderosa tecnologia de sequenciamento de DNA de próxima geração, para traçar o perfil de transcriptomas. Isso é feito isolando primeiro o RNA total das células endoteliais microvasculares pulmonares humanas com ou sem tratamento com trombina e verificando a qualidade do RNA. O segundo passo é construir bibliotecas de DNA a partir dessas amostras de RNA.

Simplifique a geração de clusters usando o instrumento cbot e execute a tarefa de sequenciamento de DNA no HighSeq 1000. Em seguida, a análise de dados é realizada para identificar e exibir transcritos de genes diferencialmente expressos. A etapa final é validar os resultados do RN aeq por RT TP CR. A principal vantagem do IC sobre os métodos existentes, como um micro array de DNA para análise do transcriptoma, é que o IC pode traçar o perfil de um transcriptoma completo, fornecer dados do tipo digital e não depender de nenhuma genômica conhecida da expressão gênica nas células.

Embora a medição do nível de MRA seja uma ferramenta útil para determinar como a transcrição da maquinaria da célula é afetada por sinais externos ou como as células diferem entre um estado de saúde e um estado de doença. Neste protocolo, demonstraremos a análise de IC de transcriptomas em células Indo syn microvasculares pulmonares humanas tratadas com trobina e controle. Este protocolo é baseado em nosso estudo publicado recentemente, no qual realizamos com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma de células endoteliais microvasculares pulmonares humanas tratadas com trombina usando RNA-Seq no High SEQ 1000, uma plataforma popular de sequenciamento de DNA de próxima geração.

Usando o sistema VS seven R-T-P-C-R, o Dr. Denova demonstrará o tratamento com trombina de células pulmonares humanas, endoteliais microvasculares e isolamento de RNA de células totais.

E o Dr. Dimitri Gregor demonstrará análise de dados Para iniciar esta cultura de protocolo. Células endoteliais microvasculares do pulmão humano entre 90 e 100% de confluência em seis placas de poços em EGM dois meios com fatores de crescimento 5% FBS e antibióticos. Mude o meio para o meio de inanição 30 minutos antes do tratamento com trombina.

Após 30 minutos, trate as células com 0,05 unidades por mililitro, trombina ou deixe sem tratamento como controle. Incube as células por seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após um tratamento de seis horas.

Isole o RNA total das células tratadas e de controle usando o kit Nirvana de acordo com as instruções do fabricante. Avalie a qualidade do RNA com um chip de RNA eucariótico de sentido padrão Experian de acordo com o protocolo padrão na estação de eletroforese automatizada Experian. Finalmente, quantifique o RNA usando um método espectrofotométrico padrão para construção de bibliotecas.

Use um micrograma de RNA total de alta qualidade por amostra como material de partida para construir a biblioteca. Siga o protocolo padrão do fabricante. Neste protocolo, são realizadas duas rodadas de seleções de poli contendo Mr.mRNA.

Para remover nosso RNA de modo a minimizar nosso sequenciamento de RNA, avalie a qualidade das bibliotecas usando um chip Experian DNA one K. De acordo com o protocolo padrão na estação de eletroforese automatizada Experian. Quantifique a biblioteca usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real.

Abreviado Q-R-T-P-C-R conforme descrito no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, execute o Q-R-T-P-C-R de acordo com o protocolo MM verde cibernético e calcule a concentração de estoque original de cada biblioteca. Dilua os estoques da biblioteca para 10 nanomolares e armazene a 20 graus Celsius.

Quando estiver pronto para agrupar uma célula de fluxo, descongele a placa de reagente cbot em banho-maria. A CBOT é um instrumento usado para agilizar o processo de geração de clusters. Depois de lavar o instrumento cbot, desnature as bibliotecas combinando primeiro 13 microlitros de um XTE e seis microlitros de 10 nanomolares.

Biblioteca em seguida, ao lado de cada tubo, adicione um microlitro de um hidróxido de sódio normal, vórtice os tubos giram para baixo e incube-o em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque as bibliotecas desnaturadas no gelo. Em seguida, dilua as bibliotecas desnaturadas com tampão de hibridização pré-resfriado, combinando 996 microlitros de tampão e 4,0 microlitros de biblioteca desnaturada para uma concentração final de 12 pico molar.

Coloque as bibliotecas diluídas desnaturadas. Em seguida, inverta cada fileira de tubos da placa cbot, garantindo que todos os reagentes sejam descongelados. Depois de girar a placa, remova a vedação da folha da fileira dos tubos de hidróxido de sódio e carregue na alíquota do robô.

120 microlitros das bibliotecas desnaturadas diluídas em um tubo de tira rotulado de um a oito. Adicione 1,2 microlitros da biblioteca de controle PHI X desnaturada diluída em cada tubo como um pico no controle. Depois de fazer o vórtice e girar os tubos, carregue-os no cbot na orientação correta com o tubo número um à direita.

Carregue uma célula de fluxo e um coletor no cbot. Conclua a verificação de fluxo e inicie a execução do clustering. Após a conclusão da execução, verifique a entrega do reagente em todas as pistas.

Anote quaisquer anormalidades. Inicie a execução do sequenciamento imediatamente ou armazene a célula de fluxo no tubo fornecido a quatro graus Celsius. Para começar o sequenciamento.

Descongelar a sequência por reagentes de síntese. Coloque os reagentes nos pontos apropriados nas bandejas de reagentes, certificando-se de não tocar nos outros reagentes. Depois de tocar na mistura de clivagem, usando uma célula de fluxo não sequencial, prepare as linhas de reagente duas vezes, limpe completamente a célula de fluxo sequencial com 70% de etanol e lenços Kim, seguidos de 70% de etanol e papel para lentes.

Inspecione a célula de fluxo em busca de riscos e limpe-a novamente, se necessário. Carregue a célula de fluxo no sequenciador e execute uma verificação de fluxo para garantir que a vedação entre os coletores e a célula de fluxo esteja firme. Inicie a execução do sequenciamento.

Avalie as métricas de qualidade à medida que elas se tornam disponíveis durante a corrida Monitore a intensidade durante toda a corrida. Após 101 ciclos são concluídos. Execute a química de retorno para completar a segunda leitura.

Primeiro pai emparelhado e reagentes, e o segundo leu tampão de incorporação. Em seguida, carregue os reagentes, continue o sequenciamento, execute a avaliação. Em segundo lugar, leia a intensidade Q3 e outras métricas de qualidade à medida que a corrida avança.

Para iniciar a análise de dados, use a versão mais recente do mandioca para converter os arquivos de chamada base em arquivos FAST Q. Definir a contagem rápida de clusters Q como zero para garantir a criação de um único arquivo Q rápido. Para cada amostra, descompacte os arquivos Q rápidos para análise downstream.

Execute o emparelhamento e o alinhamento usando a versão mais recente do cartola, que alinha as leituras de RNA-Seq aos genomas de tamanho de mamíferos usando as ferramentas de leitura curta e SAM de taxa de transferência ultra alta, que implementam vários utilitários para alinhamentos de pós-processamento no formato SAM. O transcriptoma humano de referência pode ser baixado de I genomas em execução cartola todas as configurações de parâmetros padrão foram usadas, incluindo a opção de tipo de biblioteca como fragmento unstranded usando a parte diff do programa cuff diff do pacote de software de abotoaduras. Compare as células tratadas com trombina com as células de controle.

Filtre os transcritos gênicos diferencialmente expressos nas células tratadas com trombina com base no transcriptoma de referência humano. Em seguida, use uma planilha para visualizar o resultado em forma de tabela. Nesse caso, todas as configurações de parâmetros padrão foram usadas e os transcritos de genes com FPKM menor que 0,05 e p maior que 0,05 foram filtrados para detectar novas isoformas de abotoaduras sem referência.

O transcriptoma compara os arquivos de transcrição da amostra com o genoma de referência usando a comparação de manguitos. Teste a expressão diferencial com diff de manguito usando os arquivos de transcrição de trombina combinados como genoma de referência para uma análise e os arquivos de transcrição de controle combinados como genoma de referência para uma segunda análise, novamente, use uma planilha para visualizar o resultado em formato tabular. Como antes, os transcritos de genes com FPKM menor que 0,05 e p maior que 0,05 foram filtrados.

Após esta etapa, os investigadores podem optar por fazer upload de uma lista de transcrições recém-relatadas para o site do navegador do genoma uc SC para verificar sua validade por meio de uma inspeção manual. Listas de genes diferencialmente expressos também podem ser submetidas à análise da via de engenhosidade para caracterização dos genes e vias afetadas pelo tratamento com trombina. Nesta etapa, os investigadores podem optar por usar o cummerbund, um pacote R projetado para auxiliar e simplificar a tarefa de analisar a saída de abotoaduras RN aeq para ajudar a gerenciar, visualizar e integrar todos os dados produzidos por uma análise de diferença de manguito.

A validação dos resultados do RN aeq é então realizada primeiro pelo Q-R-T-P-C-R, realizar o isolamento total do RNA das células endoteliais microvasculares do pulmão humano tratadas com trombina, avaliação da qualidade do RNA e quantificação do RNA, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Em seguida, gere DNA complementar a partir de um micrograma de RNA total de cada amostra com três primeiros índices de sistema de síntese de fita rt seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, execute a análise Q-R-T-P-C-R em um sistema de PCR VI a sete em tempo real usando os nucleotídeos projetados para ensaio TAC MAN sob demanda listados no protocolo escrito que acompanha este vídeo e meça a quantificação conforme descrito lá.

A proporção de 28 s para 18 S é tradicionalmente usada como um indicador de degradação do RNA Para quantificar com mais precisão a degradação, o sistema de experiência calcula um indicador de qualidade de RNA ou número RQI. O algoritmo RQI compara o eletroferograma de amostras de RNA com dados de uma série de amostras de RNA degradadas padronizadas e retorna automaticamente um número entre 10 e um. A amostra de RNA deve ter um RQI de pelo menos sete e, idealmente, maior que oito.

Esses resultados da Experian indicam uma amostra de RNA de alta qualidade com um RQI de 8,4. As bibliotecas devem ter uma banda larga em aproximadamente 250 a 300 pares de bases, conforme mostrado nesta figura de resultados da Experian para uma biblioteca de alta qualidade. Aqui, os resultados Q-R-T-P-C-R de amostras de curva padrão e uma amostra desconhecida são mostrados.

O progresso e a qualidade da execução do sequenciamento devem ser constantemente observados durante toda a execução. Esta figura mostra a densidade de cluster apropriada durante a primeira etapa de imagem do ciclo. Esta é a primeira indicação da corrida.

Os clusters de qualidade devem ser brilhantes e focados. Um exemplo do primeiro relatório base gerado após a conclusão do primeiro ciclo é mostrado. É importante avaliar os níveis estimados de intensidade de densidade de agrupamento e a qualidade do foco neste ponto.

O próximo ponto de verificação de qualidade após o ciclo quatro é mostrado aqui. Isso mostra a densidade absoluta do cluster para cada pista. A densidade do aglomerado não deve ser superior a 850 K por milímetro quadrado após o ciclo 13.

As estatísticas de fase e pré-fase são calculadas. Os números típicos estão entre 0,1 e 0,25. A avaliação de qualidade principal é possível após o ciclo 24, quando várias métricas de qualidade são calculadas.

A porcentagem de leituras acima do 3º trimestre é uma medida da confiança na base. Chamar uma leitura com uma pontuação Q de três significa que há uma chance em 1000 de que a chamada base esteja errada. As pontuações Q diminuirão à medida que a execução avança, mas devem começar com mais de 95% das leituras atendendo ou excedendo Q3. Os clusters que passam filter ou pf são os clusters dos quais os dados reais da sequência serão obtidos.

Idealmente, isso deve estar acima de 85%O cluster pf é baseado em muitos fatores, incluindo faseamento, intensidade de pré-fase, e Q3.It não mudará à medida que a execução avança. A porcentagem alinhada é uma medida das leituras que se alinham em tempo real ao genoma FI x. Como aproximadamente 1%FI x library foi cravado nas bibliotecas de exemplo, a porcentagem alinhada deve estar entre 0,5 e um.

Esta estatística mostra que o conteúdo da biblioteca é bem representado pelos clusters e não houve viés de geração de cluster listados aqui são genes expressos e isoformas em células endoteliais microvasculares pulmonares humanas tratadas com trombina e controle. Notavelmente, existem cerca de 26.000 novas isoformas detectadas, o que ilustra a força do RN aeq. Ele pode identificar RNAs desconhecidos.

Alternativamente, transcritos emendados e uso de promotores alternativos, que não são detectáveis por técnicas de microarray. O RNA-Seq também pode medir os transcritos menos abundantes que são imprecisos, quantificados ou não detectados por microarrays para validar os resultados do RNA-Seq usando uma abordagem alternativa. O experimento A-Q-R-T-P-C-R foi realizado para testar três genes diferentes nos dados de RNA-Seq TR um foi regulado positivamente por 7,96 vezes o próprio.

Um foi regulado negativamente em 1,16 vezes e agradeceu que dois foram regulados negativamente em 1,70 vezes nos dados Q-R-T-P-C-R, esses números correspondentes são mais 7,25 vezes menos 1,15 vezes e menos 2,07 vezes, respectivamente. Os resultados desses três genes testados por RNA-Seq e Q-R-T-P-C-R estão em boa concordância, o que corrobora os resultados do RNA-Seq. Este protocolo é específico para CI em um ponto único de microvascular pulmonar humano tratado com trobina nas células seniores, mas pode ser facilmente adaptado para um estudo de vários pontos de tempo ou estudos em outros tecidos celulares tratados com diferentes estímulos ou inibidores ou comparação de transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e o estado de doença.

Embora seja específico para o alto SQ 1000, este protocolo é aplicável a qualquer um da família HighSeq ou ao analisador de genoma. Dois instrumentos com pequenas modificações nas etapas de geração de clusters e reagentes de sequenciamento. Outras plataformas de sequenciamento de DNA de próxima geração, como a série sólida.

Os sistemas GS, bem como alguns sistemas emergentes mais novos, também são empregados para fins de RNA-Seq. Embora seus procedimentos de construção e sequenciamento de bibliotecas possam ser ligeiramente diferentes, as dicas de manuseio de RNA, as porções de análise de dados e a validação por R-T-P-C-R apresentadas neste protocolo podem ser de valor de referência para suas aplicações de RNA-Seq.