Name: RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Aprenda a realizar análise de RNA-seq em células endoteliais microvasculares pulmonares humanas tratadas com trombina. Este protocolo detalhado abrange isolamento de RNA, construção de bibliotecas, sequenciamento e análise de dados.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Stephen Kingsmore e do Centro de Medicina Pediátrica Genoma em hospitais pediátricos Mercy e clínicas para o uso de clusters de computação para a nossa análise de dados, a equipe de Illumina serviço de campo (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e técnico equipa de consultores para as suas respostas rápidas e sugestões úteis sobre o funcionamento do instrumento de próxima geração de sequenciamento de DNA, HiScanSQ e análise de dados de qualidade. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health Grant HL080042 (para SQY) e start-up fundo e dotação de hospitais infantis de Misericórdia e Clínicas, da Universidade de Missouri, em Kansas City (para SQY).

<html> Um fluxograma descrevendo este protocolo é mostrado na Figura 1. 1. O tratamento de células com trombina, RNA Isolation, Quality Assessment e Quantificação de RNA <ol><li> Cultura As células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluência em placas de 6 poços em meio EGM-2 com 5% de FBS, factores de crescimento e antibióticos (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Alterar media para os meios de comunicação de fome (0% de FBS) 30 min antes do tratamento com trombina. </li><li> Tratar as células com 0,05 U / ml de trombina ou deixar sem tratamento como um controlo durante 6 horas a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Isolar o RNA total a partir das células tratadas e de controlo, usando o Ambion mir Vana kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Avaliar a qualidade do RNA com uma Eukaryotic StdSense Experion chip de RNA de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion (Automated= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Quantificar o ARN utilizando um método padrão espectrofotométrico. </li></ol> 2. Construção de biblioteca e Sequenciamento <ol><li> Use de 1 ug de ARN total de elevada qualidade por exemplo como material de partida. </li><li> Para construir a biblioteca, seguir o procedimento padrão da Illumina (protocolo n º 15008136 Rev. A). Neste protocolo, duas rodadas de poli (A) de ARNm contendo selecções são realizadas para remover rRNA para minimizar a sequenciação de rRNA. </li><li> Avaliar a qualidade das bibliotecas utilizando um chip de ADN Experion 1K de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion automatizada ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> Quantificar a biblioteca utilizando qPCR: Usar uma biblioteca que tenha sido previamente sequenciados como uma curva padrão e iniciadores específicos para os adaptadores ligados. Utilizar uma gama de diluições das bibliotecas desconhecidas (por exemplo, 1:100, 1:500 e 1:1000). Execute o acco qPCRrding com o protocolo MM SyberGreen e calcular a concentração original de estoque de cada biblioteca. </li><li> Diluir os stocks de biblioteca de 10 nM e armazenar a -20 ° C até estar pronto para agrupar uma célula de fluxo. </li><li> Quando estiver pronto para agrupar uma célula de fluxo, descongelar a placa reagente CBOT num banho de água. CBOT é um instrumento utilizado Illumina para agilizar o processo de geração de cluster. </li><li> Lavar o instrumento CBOT. </li><li> Desnaturar as bibliotecas: Combinar 13 ul de 1x TE e 6 uM biblioteca ul 10 e, para o lado do tubo, adicionar 1 ml de NaOH 1 N (fornecido pela Illumina). Vortex, girada para baixo, incubar à temperatura ambiente durante 5 min e colocar as bibliotecas desnaturados em gelo. </li><li> Diluir as bibliotecas: Diluir as bibliotecas desnaturados com pré-gelada de tampão de hibridação (HT1, fornecido pela Illumina) através da combinação de 996 ul HT1 e 4 uL biblioteca desnaturado para uma concentração final de 12 pM. Coloque as bibliotecas desnaturados e diluído em gelo. </li><li> Inverter cada fila de tubos da placa CBOT,assegurar que todos os reagentes são descongeladas. Girar a placa, remover / punção os selos tiras e coloque sobre a CBOT. </li><li> Ul alíquota 120 das bibliotecas diluídas, desnaturados para um tubo de tira, rotulado 1-8. Adicionar 1,2 uL diluído, biblioteca de controle PhiX desnaturado (de Illumina) em cada tubo como uma espiga de controle. Vortex e girar os tubos e carregá-los na CBOT na orientação correta (tubo n º 1 para a direita). </li><li> Carregar uma célula de fluxo e colector para a CBOT. </li><li> Completar o fluxo de verificar e começar a corrida de agrupamento. </li><li> Após a corrida é completa, veja a entrega de reagente em todas as pistas. Tome nota de quaisquer anormalidades. Quer iniciar a execução de sequenciação imediatamente ou armazenar a célula de fluxo no tubo desde a 4 ° C. </li><li> Descongele o seqüenciamento por síntese (SBS, Illumina) reagentes. </li><li> Coloque os reagentes para os pontos apropriados nas bandejas de reagentes, tomando cuidado para não tocar os outros reagentes depois de tocar o mix de clivagem. </li><li> Usando um nãon-seqüenciamento célula de fluxo (isto é, que foi sequenciado anteriormente), principais linhas de reagente duas vezes. </li><li> Limpar completamente a célula de fluxo de sequenciação com EtOH a 70% e Kimwipes, seguido de EtOH a 70% e de papel de lente. Inspecione a célula de fluxo para qualquer fiapo. Re-limpá-lo, se necessário. </li><li> Carregar a célula de fluxo para o sequenciador e executar um fluxo de verificação para assegurar que a vedação entre os tubos de distribuição e a célula de fluxo é apertado. </li><li> Iniciar a execução seqüenciamento. </li><li> Avaliar as métricas de qualidade (por exemplo, a densidade de cluster, clusters de passar filtro, Q30, intensidade), como eles se tornam disponíveis durante a corrida. </li><li> Monitorar a intensidade em toda a corrida. </li><li> Após 101 ciclos são concluídos, realizar a química de retorno para completar a segunda leitura: Descongelar os reagentes finais emparelhadas e o buffer de Incorporação segunda leitura (ICB, um componente do SBS reagentes, Illumina) e carregar os reagentes. </li><li> Continuar a corrida seqüenciamento, avaliando 2 ª leitura intensidade, um Q30nd outras métricas de qualidade como os avanços de execução. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> Use a versão mais recente do casava (Illumina, atualmente 1.8.2) para converter os arquivos de base de chamada (. Bcl) arquivos em arquivos. Fastq, estabelecendo fastq-cluster contagem a 0 para garantir a criação de um arquivo fastq único para cada amostra . Descompactar os arquivos fastq para análise a jusante. </li><li> Realizar o alinhamento final emparelhado utilizando as mais recentes versões do TopHat (1.4.1) 5, que alinha RNA-seq lê para mamíferos de tamanho genomas usando o ultra high-throughput alinhador de leitura curta (Bowtie, 0.12.7) 6 e SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools implementa vários utilitários para pós-processamento de alinhamentos no formato SAM. O transcriptoma de referência humano pode ser baixado do iGenomes ( <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). Na corrida TopHat, usamos todas as configurações padrão de parâmetros, incluindo a opção de tipo de biblioteca como fr-unstranded (padrão). </li><li> Nosção a CuffDiff programa, uma parte dos botões de punho (1.3.0) 8 pacote de software, comparar as células tratadas com trombina para as células de controlo de filtrar os transcritos de genes expressos diferencialmente na antiga com base na referência do transcriptoma humano. Esta comparação detectar a expressão diferencial de transcritos conhecidos. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em forma de tabela. Na execução do programa Abotoaduras, usamos todos os parâmetros predefinidos. Essas transcrições de genes com FPKM &lt;0,05 e p&gt; 0,05 são filtrados. </li><li> Para detectar novas isoformas, executar Cufflinks sem transcriptoma de referência. Comparar os arquivos de transcritos de amostras de referência, utilizando o genoma Cuffcompare e testar a expressão diferencial com Cuffdiff usando os arquivos de transcrição combinados trombina como o genoma de referência para uma análise e os ficheiros de controlo de transcrição combinados, como no genoma de referência para uma segunda análise. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em formato tabular. Novamente, thostranscrições de e genes com FPKM &lt;0,05 e p&gt; 0,05 são filtrados. Após esta etapa, os pesquisadores podem optar por carregar uma lista de transcrições de notificação recente para o site UCSC Genome Browser ( <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) para verificar a sua validade por uma inspeção manual. </li><li> Apresentar listas de genes diferencialmente expressos para Análise Ingenuity Pathway (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) para a caracterização dos genes e as vias afetadas pelo tratamento trombina. Nesta etapa, os pesquisadores podem optar por usar cummerbund ( <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> ), um pacote de R que é projetado para ajudar e simplificar a tarefa de analisar Cufflinks saída de RNA-seq, para ajudar a gerenciar, visualizar e integrar todos os dados produzidos por uma análise Cuffdiff. </li></ol> 4. Validação dos resultados RNA-seq por quantitativa em tempo real-PoReacção lymerase Chain (qRT-PCR) <ol><li> Realizar isolamento de RNA total do controle e da trombina tratados HMVEC Lbl células, RNA qualidade de avaliação e quantificação de RNA descrito nos Passos 1,4-1,6. </li><li> Gerar DNA complementar a partir de 1 ug de RNA total de cada amostra com o Superscript First-Strand III Síntese Kits sistema RT, seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen, 18080-051). </li><li> Executar qRT-PCR em uma VIIa Applied Biosystems 7 Real-Time PCR System usando Taqman Assay-on-Demand oligonucleótidos concebidos para a detecção de CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Cada amostra tinha um modelo equivalente a 5 ng de RNA total. Medir a quantificação utilizando o método DDCT e normalizar a β-actina. Cada ensaio foi realizado através de, pelo menos, três repetições biológica. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+pathway+analysis%3A+current+approaches+and+outstanding+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As principais etapas Manipulação de RNA: RNases irá degradar ainda os mais elevada qualidade de ARN, por isso deve ser tomado cuidado durante o isolamento, o armazenamento e utilização de RNA 10. Luvas são sempre usadas para evitar a contaminação por RNases encontrados em mãos humanas. As luvas devem ser mudados frequentemente, especialmente depois de tocar a pele, maçanetas ou outras superfícies comuns. Um conjunto de pipetas deve ser dedicado exclusivamente para o ...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagentes ou Equipamentos </td><td width="85"> Companhia </td><td width="185"> Número de catálogo </td><td width="359"> Comentários </td></tr><tr><td> As células endoteliais microvasculares de pulmão humano </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit Bala </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contém EGM-2, FBS, factores de crescimento e antibióticos </td></tr><tr><td> Trombina </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA PreparaçãoConjunto </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Contas AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Sobrescrito transcriptase reversa II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion 1K DNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Geração Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Controle Kit </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Ciclo SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR máquina - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Equipamento Model # VIIA7 / # 10631261 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Experion Sistema </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer é um sistema alternativo </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Microplaca Espectrofotômetro </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Centrífuga - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Suporte magnético </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96 poços termociclador </td><td> Geral Fornecedor Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lista Tabela 3. Dos Reagentes chave e Mi Maiorquipment. *, No vídeo, em vez de HiSeq1000 HiScanSQ foi demonstrada. </td></tr></tbody></table>

rna-seq análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

A caracterização da expressão do gene em células por meio de medição de níveis de mRNA é uma ferramenta útil na determinação de como a maquinaria transcricional da célula é afectada por sinais externos (por exemplo, tratamento com drogas), ou como células diferem entre um estado saudável e de um estado de doença. Com o advento e aperfeiçoamento contínuo da próxima geração de tecnologias de sequenciação de DNA, RNA-sequenciação (RNA-seq) tornou-se um método cada vez mais popular de análise do transcriptoma para catalogar todas as espécies de transcritos, para determinar a estrutura da transcrição de todos os genes expressos e quantificar os níveis de expressão de mudar o conjunto total de transcritos de 1,2 um tecido, célula ou organismo determinado. RNA-seq está a substituir gradualmente microarranjos de DNA como um método preferido para a análise do transcriptoma porque tem as vantagens de um perfil transcriptoma completa, proporcionando um dado tipo digital (número de cópias de qualquer transcrição) e não se basear em qualquer sequen genómico conhecidoce 3. Aqui, apresentamos um protocolo completo e detalhado para aplicar RNA-seq para transcriptomas perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com ou sem tratamento de trombina. Este protocolo é baseado em nosso estudo recente publicado intitulado &quot;RNA-seq revela Transcriptoma Novel de genes e suas isoformas em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares Tratados com trombina,&quot; 4 em que realizaram com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma humano pulmonares células endoteliais microvasculares tratado com trombina usando RNA-seq. Ele rendeu recursos sem precedentes para a experimentação ainda mais para obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes trombina mediada disfunção endotelial na patogênese de doenças inflamatórias, câncer, diabetes e doença cardíaca coronária, e fornece novas pistas para potenciais alvos terapêuticos para essas doenças. O texto descritivo deste protocoloé dividido em quatro partes. A primeira parte descreve o tratamento de humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com trombina e isolamento de ARN, análise de qualidade e de quantificação. A segunda parte descreve a construção da biblioteca e seqüenciamento. A terceira parte descreve a análise de dados. A quarta parte descreve um ensaio de RT-PCR de validação. Os resultados representativos de vários passos-chave são exibidos. Dicas úteis ou precauções para impulsionar o sucesso em passos-chave são fornecidos na seção de Discussão. Embora este protocolo utiliza humanas pulmonares células endoteliais microvasculares tratados com trombina, pode ser generalizado para transcriptomas perfil em ambas as células de mamíferos e não mamíferos e dos tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou para comparar transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.

Para o Passo 1: O 28s: 18s razão é tradicionalmente utilizada como um indicador da degradação de ARN. Idealmente, o pico 28s deverá ter aproximadamente duas vezes a área da banda de 18s (uma proporção de 2), no entanto este rácio ideal não é muitas vezes visto na prática. Além disso, 28s: 18s rácios obtidos a partir de métodos espectrofotométricos pode subestimar a quantidade de degradação do RNA. Para quantificar mais precisamente a degradação, e, por conseguinte, a qualidade da amostra de RNA, o siste...

Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar um processo completo e detalhado para aplicar o RNA-Seq, uma poderosa tecnologia de sequenciamento de DNA de próxima geração, para traçar o perfil de transcriptomas. Isso é feito isolando primeiro o RNA total das células endoteliais microvasculares pulmonares humanas com ou sem tratamento com trombina e verificando a qualidade do RNA. O segundo passo é construir bibliotecas de DNA a partir dessas amostras de RNA.Simplifique a geração de clusters usando o instrumento cbot e execute a tarefa de sequenciamento de DNA no HighSeq 1000. Em seguida, a análise de dados é realizada para identificar e exibir transcritos de genes diferencialmente expressos. A etapa final é validar os resultados do RN aeq por RT TP CR. A principal vantagem do IC sobre os métodos existentes, como um micro array de DNA para análise do transcriptoma, é que o IC pode traçar o perfil de um transcriptoma completo, fornecer dados do tipo digital e não depender de nenhuma genômica conhecida da expressão gênica nas células.Embora a medição do nível de MRA seja uma ferramenta útil para determinar como a transcrição da maquinaria da célula é afetada por sinais externos ou

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Biologia

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

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miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

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RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

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