Name: Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprenda a visualizar a inserção de receptores dopaminérgicos D2 na membrana plasmática de neurônios primários de rato cultivados usando microscopia TIRF. Este método permite observar em tempo real a dinâmica do tráfico de receptores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização do Laboratório Jackson.

1. Preparando Cultura Glia Rato para o condicionamento de Cultura Neuronal <ol><li> Frascos T75 são revestidos com uma solução de colagénio (1:3 diluição de Purecol em DDH 2 O). Os frascos são erguidas e deixa-se secar durante a noite numa câmara de cultura de tecidos. </li><li> Tampão dissecção (aCSF: 119 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl2, 30 mM de glicose, 25 mM de HEPES, pH 7,4, sem cálcio) e os meios da glia (DMEM suplementado com 10% de FBS, 10 unidades / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina, e Glutamax) são preparadas e armazenadas a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> No dia da cultura as células gliais, os meios de comunicação glia é aquecida durante pelo menos 30 min em banho de água a 37 ° C antes da dissecação de cérebros de ratos. Ratos embrionários ou neonatais são sacrificados por decapitação rápida. Córtex cerebral são dissecados sob um microscópio de dissecação. </li><li> Tecidos cerebrais dissecados são digeridas em solução de papaína (100 ml de papaína e 20 ul de 1% de DNase I, em 2 ml de tampão de dissecção) a 37 ° C for 20 min. </li><li> Após a digestão com papaína, tecidos cerebrais são lavados com 10 ml de meio pré-aquecido da glia. Media glia frescas (2 ml) é então adicionado aos tecidos cerebrais digeridos, e os tecidos são triturados com uma chapa de vidro polido ao fogo pipeta de Pasteur. </li><li> Meios frescos glia (8 ml) é adicionado aos tecidos dissociados. A 70 uM de células-filtro é usado para filtrar a suspensão de tecido dissociado. As células são então semeadas em frascos T75 (geralmente 2-3 embriões pode semear um frasco T75), e colocados em um de 37 ° C célula incubadora de cultura. </li><li> No dia seguinte, os meios de comunicação a partir dos frascos T75 é aspirado. Os balões são lavados com 10 ml de PBS. Media glia frescos (10-15 ml) é então adicionado a cada frasco. </li><li> Dentro de 10-12 dias, as células gliais nos frascos T75 deve ser confluente. As células gliais são lavadas com PBS, e de 5 ml de tripsina a 0,05% é adicionado a cada frasco T75. </li><li> Após incubação com tripsina a 37 ° C durante 5 minutos, as células gliais são células dissociadas e glial de cada frasco T75 são divididos em doisdiferentes de colagénio revestidos frascos T75. </li><li> Inserções de cultura (Millipore PICM03050) são preparados colocando-as em placas de 6 poços, revestindo-os com o colagénio, e o ar de secagem durante a noite. Media glia (2 ml cada) é colocado por baixo de cada inserção de cultura. </li><li> Glia de frascos T75 confluentes são tripsinizadas e semeadas sobre as inserções de cultura (de um frasco T75 por placa de 6 poços, 2 ml cada inserção). Estas inserções de cultura glia será utilizada para condicionar as culturas neuronais. </li></ol> 2. Cultura neuronal <ol><li> As lamelas de vidro para cultura neuronal são limpos por imersão em 70% HNO 3, pelo menos durante a noite. As lamelas são em seguida lavadas com DDQ 2 O, pelo menos, 3 vezes, e secou-se num forno Isotemp (&gt; 200 ° C) durante a noite. </li><li> Lamelas limpos são colocados numa placa de 6 poços, uma lamela por poço. As lamelas são revestidas com poli-L-Lisina a solução (2 ml, 0,1% em 100 mM de ácido bórico, pH = 8,5) durante a noite numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Opoli-L-lisina solução é removida e as lamelas lamelas foram lavadas 3 vezes com autoclavado DDH 2 O. As lamelas são em seguida incubadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite em meio de plaqueamento (Neurobasal suplementado com soro de cavalo a 5% inactivado pelo calor, a 10 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 10 ug / ml, Glutamax, 2% B27 suplemento é adicionado ao meio de plaqueamento no dia em que é usado). </li><li> No dia seguinte, o meio de revestimento é removida e 2 ml de meio fresco com chapeamento B-27 é adicionada a cada poço que tem uma lamela de vidro. </li><li> Ratas grávidas (E15-18) são sacrificados com CO 2, e os ratos embrionárias são sacrificados por decapitação. O hipocampo ou estriado é dissecado a partir do tecido cerebral e colocados em um tubo de 15 ml com tampão arrefecido com gelo de dissecação, para a cultura de neurónios do hipocampo ou do estriado neurónios espinhosos médios, respectivamente. </li><li> Tecidos cerebrais dissecados são dissociados com papaína, tal como descrito nas etapas 1.4) e 1.5). </li><li> Fepois de dissociação, o número de células em cada suspensão neuronal é contado com um hemocitómetro. Os neurónios são então semeadas em cada lamela, a uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço de uma placa de 6 poços, e cultivadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite (neurónios são DIV 0). </li><li> Para preparar inserções de cultura condicionado por células gliais as culturas neuronais, os meios de comunicação glia é removido das inserções de cultura de células da glia e meio de revestimento fresco é adicionado (2 ml na inserção e 2 ml por baixo da inserção). </li><li> No dia seguinte (DIV 1), com lamelas de neurónios são colocadas por baixo das inserções de cultura da glia, um lamínulas em cada poço. </li><li> Os neurónios são alimentados com metade do volume de meio fresco pré-aquecido com alimentação (B-27) a cada 3-4 dias até que estejam prontos para experiências de transfecção e de imagem. </li></ol> 3. Transfecção <ol><li> Neuronal transfecção é realizada utilizando Lipofectamine 2000. Para cada cultura neuronal (uma cultura por cada lamela), 2 ulLipofectamine 2000 e 1 ug de ADN são utilizados. Meio Neurobasal fresco, sem suplemento é usado para diluir a Lipofectamina e DNA. </li><li> DNA Lipofectamine e são incubadas durante 20 min à temperatura ambiente após a mistura. </li><li> Salve 1 ml dos meios de comunicação de baixo cada inserção da cultura glia, e 1 ml de dentro de cada inserção, e transferir a mídia para um tubo cônico. Adicionar o mesmo volume de meio de alimentação + B27 para o meio de salva, e incubar a 37 ° C. Este meio é utilizado para a cultura neuronal após transfecção. </li><li> Seguindo a incubação de 20 min Lipofectamine / DNA, as inserções de cultura são removidas da glia momentaneamente a partir das placas de 6 poços. A mistura de Lipofectamine 200 / ul de ADN é adicionado a cada lamela com neurónios. As inserções de cultura de células gliais são então devolvidos a cada poço, acima dos neurónios. Geração de bolhas sob a membrana das inserções de cultura deve ser evitado. Os neurónios são incubadas com a mistura de Lipofectamine / DNA a 37 ° C durante 2-4 hr. </li><li> Depois ªe 2-4 hr período de incubação, as inserções são removidas novamente da glia. Os meios de cultura com a mistura de Lipofectamine / DNA é removida de cada poço. Os meios de comunicação guardados no passo 3.3) é adicionada a neurónios (2 ml por poço). Inserções de cultura glia são devolvidos a cada poço, e os meios de comunicação glia de cada inserção é removido, e 2 ml de meios de comunicação a partir do passo 3.3) é adicionado em cada pastilha. </li><li> Os neurónios são cultivados durante uma hora adicional a 24-72 permitir a expressão de ADNc transfectado antes TIRF imagem é executada no estes neurónios. </li></ol> 4. TIRF imagem <ol><li> Fluido cerebrospinal artificial (aCSF: 119 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES, pH = 7,4) será utilizado para geração de imagens ao vivo experimentos. Nosso sistema de imagem TIRF é costume set-up com um 100-mW Ciano laser para excitação, e uma carga do elétron Multiplicando Juntamente câmera do dispositivo (EMCCD) para um detector. </li><li> Antes de experimentos com imagens, o aCSF é advertido em um 37 &amp; dpor exemplo, C banho de água durante pelo menos 30 min. O inserto para geração de imagens ao vivo de aquecimento é colocada na platina do microscópio, e a inserção de aquecimento, laser, câmara e são aquecidos durante pelo menos 30 minutos antes do início das experiências de imagiologia. </li><li> A lamela com os neurônios transfectadas é montado na câmara ao vivo de imagens. O aCSF pré-aquecido é colocado na câmara depois da câmara é montada, esta etapa deve ser completado tão rapidamente quanto possível. </li><li> Uma vez que a câmara é colocada sobre o inserto de aquecimento sobre a platina do microscópio, os neurónios transfectadas são identificadas visualmente sob epi-fluorescente modo de imagem. </li><li> Após saudáveis ​​neurônios transfectadas são identificadas (ver as Figuras 1 e 2), que normalmente executam 1 ​​min de foto-branqueamento para eliminar preexistente pHluorin fluorescência na membrana plasmática, tal como pHluorin-receptores na membrana plasma ter níveis muito elevados de fluorescência quando TIRF imagem é iniciado, o que interfere com a visualização de ins indivíduoertion eventos. </li><li> Seguindo Fotobranqueador, o ajuste de ganho do multiplicador de electrões na câmara EMCCD é ajustado para o máximo, e a gravação é realizada durante 1 min a 10 Hz. </li><li> Cada gravação irá conter 600 imagens. Eventos de inserção individuais são identificadas por jogar nas costas de gravação usando ImageJ. Eventos de inserção individuais são analisados ​​manualmente usando ImageJ. </li></ol> 5. Resultados representativos Cultura neuronal consistente é a chave para o sucesso de imagem ao vivo experimentos. Figura 1 mostra os neurônios do hipocampo de rato cultivadas utilizando nosso protocolo de DIV DIV 11 a 18. É claro a partir das imagens que os neurônios se desenvolveram processos extensos e que os processos dendríticas são cobertos densamente com espinhas dendríticas, indicações de que esses neurônios são saudáveis ​​na cultura. O protocolo de cultura pode também ser utilizado para outros tipos de neurónios no cérebro. Por exemplo, recentemente utilizado este protocolo para culturaestriado neurônios espinhosos médios em um estudo para examinar receptor de dopamina D2 (DRD2) inserção na cultura de neurônios de rato médio estriado espinhosas. 9 Figura 2 mostra rato estriado neurônios espinhosos médios cultivadas utilizando nosso protocolo em DIV 8. Temos também realizada com sucesso TIRF imagiologia de superecliptic DRD2s pHluorin-tagged neste tipo de neurónio. Figura 3 mostra a expressão de pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) num neurónio spiny médio e visualização de pH-DRD2 inserção neste neurónio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Figura 1. Cultura do hipocampo do rato pelo método de cultura de interface. DIV: dias in vitro, o dia de cultura é considerada como DIV 0. A partir das imagens, é evidente que os neurónios do hipocampo maduros neste tipo de cultura entre 11 e DIV DIV 15. Às 11 e 13 DIV, dendrites neuronais são cobertas com espinhas filipodia e imaturas. Às 15 e DIV18, dendritos neuronais são cobertos com espinhos grandes, uma indicação de mais neurônios maduros. Painéis esquerdo: ampliação de imagens de baixa de neurônios do hipocampo de rato em diferentes idades. Painéis direito: ampliação de imagens de alta (zoom em dendritos neuronais do painel esquerdo) de processos neuronais dendríticas com espinhas dendríticas em diferentes idades. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Figura 2. Rato estriatal média spiny cultura neuronal utilizando o método de cultura de interface. Neurônios nas imagens estão em DIV 8. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Figura 3. Um rato estriatal meio neurônio espinhoso transfectadas com super eclíptica pHluorin-marcado receptor de dopamina D2 (pH-DRD2). Imagem à esquerda é a projeção de intensidade máxima de uma gravação de lapso de tempo (600 imagens, 100 ms por imagem). Setas brancas indicam a inserção vesicular individual de pH-DRD2. Esta imagem retém informação de inserção na dimensão xy, mas perde a informação da hora. Imagem da direita mostra a intensidade de projecção yt máximo, em que a pilha XYT é girada em 90 graus em torno do eixo y, e o pixel máximo em cada linha do eixo x é projectada para um pixel único eixo y. Esta imagem retém informação de inserção ao longo do eixo yt mas perde a informação eixo x.

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
<li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li>
<li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+%28GluR2%29+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li>
<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
<li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N%2C+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li>
<li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li>
<li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li>
<li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li>
<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Por razões desconhecidas, os neurônios de rato são sempre mais difíceis de cultura do que neurônios de rato. Em nossa experiência, uma cultura mista de neurônios e da glia funciona bem para os neurônios primários de rato cultivadas. No entanto, uma tal cultura mista não é adequado para as experiências de imagiologia TIRF, como neste tipo de cultura de neurónios e seus processos tendem a crescer em cima de células da glia, situando o somata neuronal e processos dendríticos para além do alcance de microscopia TIRF. Assim,...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nome do Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentários</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purificada solução de colágeno bovino (Purecol)</td&gt;<td&gt; Avançado Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank solução salina equilibrada (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina-estreptomicina (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Piruvato de sódio</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose DMEM High</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; De soro fetal de bovino (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papaína</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Desoxirribonuclease I a partir de pâncreas de bovino (DNase I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10mg</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdFosfato&gt; Dulbecco tamponado salino (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tripsina 0,05%</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-lisina bromidrato</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ácido bórico</td&gt;<td&gt; Fisher-Científico</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Médio Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 Suplemento Serum-Free</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Calor soro de cavalo inativo</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Científico</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Inserir Cultura</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imagiologia phluorin-tagged inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Uma melhor compreensão dos mecanismos que regem o tráfico receptor entre a membrana do plasma (PM) e compartimentos intracelulares requer uma abordagem experimental, com excelentes resoluções espaciais e temporais. Além disso, esta abordagem também deve ter a capacidade de distinguir os receptores localizados na PM daqueles em compartimentos intracelulares. Mais importante ainda, a detecção de receptores de uma vesícula única requer excelente sensibilidade de detecção, uma vez que cada vesícula leva apenas um pequeno número de receptores. Abordagens normalizadas para examinar o tráfico receptor incluem a biotinilação da superfície seguido de detecção bioquímica, que carece tanto as resoluções necessárias espaciais e temporais, e exame de microscopia de fluorescência de receptores de superfície, o que requer immunolabeled fixação química de células e, portanto, carece de resolução temporal suficiente 1-6. Para superar essas limitações, nós e outros têm desenvolvido e utilizado um novo stratégia que permite a visualização da inserção dinâmica de receptores para a PM, com excelentes resoluções espaciais e temporais 7-17. A abordagem inclui a marcação de uma GFP sensível ao pH, o pHluorin superecliptic 18, para o domínio N-terminal extracelular de receptores. Superecliptic pHluorin tem a propriedade única de ser fluorescente a pH neutro e não fluorescente a pH ácido (pH &lt;6,0). Portanto, os receptores marcados são não-fluorescente quando dentro do lúmen ácida tráfico de vesículas intracelulares ou compartimentos endossomais e tornam-se facilmente visualizado apenas quando exposto ao ambiente extracelular pH neutro, na superfície exterior do PM. Nossa estratégia, consequentemente, permite-nos distinguir receptores de superfície PM daqueles dentro de vesículas tráfico intracelular. Suficientes para alcançar resoluções espaciais e temporais, bem como a sensibilidade necessária para estudar o tráfico dinâmica dos receptores, foram empregados interna total reflectemion microscopia fluorescente (TIRFM), o que nos permitiu obter a melhor resolução espacial da imagem óptica (~ 170 nm), a resolução temporal do vídeo de taxa de microscopia (30 quadros / seg), e a sensibilidade para a detecção de fluorescência de uma única GFP molécula. Pela imagem pHluorin-marcado receptores sob TIRFM, fomos capazes de visualizar diretamente eventos receptores individuais inserção na PM em neurônios cultivados. Esta abordagem de imagem pode, potencialmente, ser aplicada a qualquer proteína de membrana com um domínio extracelular que poderiam ser marcadas com pHluorin superecliptic, e permitirá a dissecação dos mecanismos chave de pormenor que regem a inserção de proteínas de membrana diferentes (receptores, canais de iões, transportadores, etc) para da PM.

Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Uma melhor compreensão dos mecanismos que regem o tráfego de receptores entre a membrana plasmática (MP) e os compartimentos intracelulares requer um...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar receptores neuronais à medida que são inseridos na membrana plasmática em neurônios primários de camundongo cultivados. Para isso, obtêm-se GL de camundongo a partir do córtex cerebral de camundongos embriônicos ou neonatais e cultivam-se sobre inserções de cultura revestidas com colágeno semipermeáveis. Os cultivos gliais são suspensos sobre neurônios hipocampais embrionários primários em lamínulas.Em seguida, após sete dias de condicionamento, os neurônios são transfectados com um receptor de dopamina D2 marcado com fluoroforo super eclíptico. O receptor marcado se localiza em vesículas intracelulares, mas permanece não fluorescente no ambiente ácido das vesículas. Quando a vesícula se funde com a membrana plasmática, no entanto, o fluoróforo é exposto ao pH neutro do ambiente extracelular e fluoresce intensamente, permitindo sua detecção por microscopia de fluorescência por reflexão total interna.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de tráfego de proteínas de membrana, permitindo-nos visualizar o tráfego de quaisquer proteínas de membrana que possam ser marcadas com flúor, como receptores de glutamato e receptores acoplados à proteína G. Demonstrando o procedimento junto comigo hoje estarão breeding dry e, e nós um, dois outros membros do nosso grupo de pesquisa. No dia anterior ao procedimento de dissecção, prepare frascos T75 com solução de colágeno, coloque os frascos na posição vertical e deixe secar durante a noite. No dia do cultivo de gliócitos, aqueça o meio de gliócitos por pelo menos 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius; após a eutanásia, dissecar os córtices cerebrais de camundongos embrionários ou neonatais sob microscópio de dissecção.Coloque os córtices removidos em um tubo cônico de 15 mililitros contendo fluido cefalorraquidiano artificial gelado, ou A CSF, sobre gelo. Em seguida, remova todo o A CSF, exceto dois mililitros, e adicione 100 microlitros de solução de pepase e 20 microlitros de DNAsa 1%. Coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius e deixe o tecido digerir por 20 minutos.Após a digestão, lave cuidadosamente os tecidos cerebrais removendo com cuidado a solução de propano e adicionando 10 mililitros de meio glial pré-aquecido. Em seguida, tomando cuidado para não perturbar o tecido, remova o máximo possível do meio glial.Adicione dois mililitros de meio glial fresco e, utilizando uma pipeta de vidro polida a fogo, pipete até que o tecido não seja mais visível. Evite formar bolhas assim que o tecido estiver completamente dissociado. Adicione oito mililitros adicionais de meio glial fresco e pipete a suspensão através de uma peneira celular de 70 microns.Colete o fluxo em um tubo cônico de 50 mililitros. Transfira as células dissociadas de dois a três embriões para um frasco T 75 revestido com colágeno e cultive a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio. Enxágue as células uma vez com 10 mililitros de PBS.Em seguida, adicione 10 a 15 mililitros de meio glial fresco a cada frasco. Incube as culturas por 10 a 12 dias, trocando o meio a cada três a quatro dias. Quando as células estiverem confluentes, lave as células gliais com PBS.Em seguida, adicione cinco mililitros de tripsina 0,05% ao frasco e deixe as células destacarem por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a breve incubação, adicione o meio glial e pipete para destacar as GL do fundo do frasco. Divida as células em dois novos frascos T 75 revestidos com colágeno.Uma vez que atinjam confluência, realize a tripsinização como antes e semeie o conteúdo de cada frasco em placas de seis poços contendo inserts de cultura revestidos com colágeno. Coloque sobre dois mililitros de meio de cultura glial e cultive as células por um a sete dias. Esses inserts de cultura glial serão usados para condicionar as culturas neuronais.Adicione quatro mililitros de meio de plaqueamento a cada poço de uma placa de seis poços contendo lamínulas revestidas com polilisina limpas e coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius durante a noite. Este passo aumenta a probabilidade de sobrevivência neuronal, muito provavelmente ao remover a polilisina residual no dia seguinte. Remova o meio de plaqueamento e substitua-o por dois mililitros de meio de plaqueamento fresco.Meio contendo 2% do meio. Suplemento B27 para o cultivo de neurônios do hipocampo. Sob um microscópio estereoscópico, dissecar os hipocampos a partir do tecido cerebral de quatro camundongos embrionários E15 a E18. Colocar os hipocampos em um tubo cônico de 15 mililitros com tampão de dissecção gelado.Em seguida, dissecar o estriado a partir do tecido cerebral de três camundongos embrionários entre E 15 e E 18 e colocá-los em um tubo cônico separado de 15 mililitros com tampão de dissecção gelado. Digestionar o tecido com pepina como anteriormente. Em seguida, utilizando um hemocitômetro.Determine o número de células em cada suspensão neuronal e semeie. Cada lamínula com 0,4 vezes 10 à sexta potência de células e cultive-as durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius. Para preparar os insertos de cultura glial para condicionar as culturas neuronais, aspire o meio dos insertos de cultura glial e da placa, e substitua cada um por dois mililitros de meio fresco de semeadura.No dia seguinte, coloque as lamínulas com os neurônios em cada poço da placa sob os insertos de cultivo glial. Continue a incubação a 37 graus Celsius, trocando a cada três ou quatro dias metade do meio por meio de alimentação fresco, pré-aquecido, contendo B 27, até que estejam prontos para os experimentos de transfeção e imageamento.Os neurônios serão transfectados no sétimo dia e analisados no oitavo dia de cultivo. O cultivo neuronal consistente é fundamental para experimentos bem-sucedidos de imagem em tempo real. Esta figura mostra neurônios hipocampais de camundongo cultivados com este protocolo desde 11 dias in vitro até 18 dias in vitro.É evidente pelas imagens que os neurônios desenvolveram processos extensos e que os processos dendríticos estão densamente cobertos por espinhos dendríticos. Indicações de que esses neurônios estão saudáveis em cultura para cada cultura neuronal. Combine dois microlitros de lipectomia em 2001 microgramas de DNA e codificando o receptor de dopamina D2 marcado com florina super eclíptica.Agite e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Durante a incubação, remova e transfira um mililitro do meio de baixo e um mililitro do interior de cada inserto de cultura glial para o mesmo tubo cônico. Em seguida, adicione o mesmo volume de meio de alimentação com B 27 ao meio reservado e incube a 37 graus Celsius.Este meio será utilizado para o cultivo neuronal após a transfeção, após a incubação momentânea de 20 minutos com o DNA no meio lipídico. Remova os insertos de cultivo glial das placas de seis poços. Adicione a mistura de DNA lipectomia de 200 microlitros a cada lamínula com neurônios.Evite gerar bolhas sob a membrana da cultura. Substitua os insertos de cultura glial e incube a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Após a incubação, remova novamente os insertos gliais e aspire a solução de transfeção de cada poço, então adicione os dois mililitros de meio previamente guardados aos neurônios e substitua os insertos de cultura glial.Por fim, remova o meio glial de cada inserto e adicione dois mililitros do meio reservado a cada cultura. Incube as células por um período adicional de 24 a 72 horas para permitir a expressão do CD NA transfectado. O sistema de imagem TIRF utilizado neste vídeo é uma configuração personalizada com um laser ciano de 100 miliwatts para excitação e uma câmera de dispositivo acoplado por carga com multiplicação eletrônica como detector. Trinta minutos antes do início da aquisição de imagens, aqueça o CSF a 37 graus Celsius em banho-maria. Além disso, ligue o laser, a câmera e o inserto aquecedor, e coloque o inserto aquecedor na platina do microscópio.Coloque um lamínula com neurônios transfectados em uma câmara de imagem em tempo real e adicione rapidamente A CSF previamente aquecido. Coloque a câmara no suporte aquecido sobre a platina do microscópio em modo de imagem epifluorescente e identifique os neurônios transfectados. Em seguida, no modo de imagem TIRF, faça a fotobranqueamento dos neurônios por um minuto para eliminar qualquer fluorescência pré-existente de fluorocromos na membrana plasmática.Em seguida, ajuste a configuração de ganho do multiplicador de elétrons na câmera E-M-C-C-D ao máximo e comece a capturar imagens por um minuto a 10 hertz. Cada gravação conterá 600 imagens ao final de todas as aquisições. Analise os dados utilizando o Image J para determinar a inserção na membrana do receptor de dopamina D dois.Um neurônio espinal médio de camundongo foi transfectado com super eclíptico. A imagem foi então realizada com fluoróforo marcado com receptor de dopamina D dois PDR D dois vivo por microscopia TIRF, na qual 600 imagens foram obtidas a uma taxa de uma imagem a cada 100 milissegundos. Esta imagem mostra a projeção de intensidade máxima da gravação em lapso de tempo; os ponteiros brancos indicam onde vesículas individuais contendo pH DD dois se fundiram com a membrana plasmática.Esta imagem mostra a projeção de intensidade máxima de YT, na qual a pilha XYT é rotacionada 90 graus em torno do eixo Y, e o pixel máximo em cada linha do eixo X é projetado em um único pixel do eixo Y. Para fornecer informações sobre a linha do tempo de inserção, esses dados demonstram que este método pode ser empregado com sucesso para examinar a regulação da inserção na membrana plasmática de receptores em neurônios de camundongo cultivados após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do tráfego de receptores neuronais explorarem a regulação de outros receptores, canais e transportadores da membrana plasmática neuronal.

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são...

Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Fonte: Lacin, E., et al. Construção de Repórteres de Engenharia Fluorescente de Neurotransmissores Baseados em Células (CNiFERs) para Detecção Óptica de Neurotransmissores In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica para obter imagens da liberação de neurotransmissores in vivo usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células (CNiFERs), células repórter especializadas pré-injetadas no córtex de camundongo. Posicionado sob um microscópio de...

Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

Aqui, é apresentado um procedimento para ativar seletivamente uma proteína neuronal com um pulso curto de luz codificando geneticamente um aminoácido não natural foto-reativo em uma proteína neuronal alvo expressa em neurônios em cultura ou in vivo.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro.  Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.

Visualizando o colapso do Cone de crescimento Axonal e primeiros efeitos β amiloide nos neurônios cultivados Mouse

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Aprenda a visualizar a inserção de receptores dopaminérgicos D2 na membrana plasmática de neurônios primários de rato cultivados usando microscopia TIRF. Este método permite observar em tempo real a dinâmica do tráfico de receptores.

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Explorar mais vídeos