Name: Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda o modelo de oclusão da artéria cerebral média induzido por endotelina-1 para AVC isquêmico em ratos usando fluxometria Doppler a laser. Este método menos invasivo permite estudos sobre mecanismos de derrame cerebral.

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Este trabalho foi financiado por doações do American Heart Association Maior filial Sudeste (09GRNT2060421), a Associação Médica Americana, e da Universidade da Flórida Clínica e Translacional Science Institute. Adam Meca é um NIH / NINDS, companheiro NRSA predoctoral (F30 NS-060335). Robert Regenhardt recebeu apoio comunhão predoctoral da Universidade da Flórida Programa de Formação Multidisciplinar em Hipertensão (T32 HL-083810).

Este protocolo foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório&quot; (oitava edição, a National Academy of Sciences, 2011). Materiais <ol><li> Animais: Oito semanas de idade, macho, Sprague Dawley (Farms Charles River, Wilmington, MA, EUA) pesando 250-300 g no momento da cirurgia. </li><li> Anestesia <ol class="lalpha"><li> Sistema de anestesia por inalação (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA) </li><li> Anestésico isoflurano (Baxter Farmacêutica, em Deerfield, Illinois, EUA) </li></ol></li><li> Estereotáxico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA) <ol class="lalpha"><li> Sistema estereotáxico de pequenos animais </li><li> Não-ruptura de ouvido barras para ratos </li><li> Gás titular cabeça anestesia para ratos </li></ol></li><li> Regulação da temperatura<ol class="lalpha"><li> BAT-12 termômetro microssonda (Precision Mundial Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA) </li><li> T / BOMBA, TP600 manta térmica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA) </li></ol></li><li> Instrumentos cirúrgicos <ol class="lalpha"><li> Cabo de bisturi e lâmina n º 11, íris fórceps, fórceps Graefe, afastadores braçadeira bulldog, chave de fenda, 10 seringas ul com agulha de calibre 26 chanfrado (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, Flórida, EUA) </li><li> Micromotor e broca titular estereotáxica, Quintessential Estereotáxica Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA) </li><li> 1,0 milímetros broca de perfuração redonda, 1,0 mm cone invertido de perfuração da broca (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA) </li></ol></li><li> Material cirúrgico <ol class="lalpha"><li> Parafusos de montagem 0-80 X 3/32 com 2,4 comprimento do eixo mm, 21 de calibre da cânula guia [4 milímetros longa abaixo do pedestal] e manequim cânula (Plásticos, uma Roanoke, VA, EUA) </li><li> Jet acrílico dentadura e líquido (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, EUA) </li><li> 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EUA) </li><li> Cotonetes, pomada Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA) </li><li> Elétrica de cortar cabelo (Oster, Providence, RI, EUA) </li></ol></li><li> Produtos químicos <ol class="lalpha"><li> A endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA) </li><li> Clorexidina 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA) </li><li> Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EUA) </li></ol></li><li> Equipamento de visualização <ol class="lalpha"><li> Microscópio cirúrgico (Seiler Instrumento e Manufatura; St. Louis, MO, EUA) </li><li> Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA) </li></ol></li><li> Laser Doppler fluxometria sistema (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, EUA) <ol class="lalpha"><li> StSonda Lápis andard </li><li> Suporte da sonda </li><li> Fluxômetro sangue </li><li> Powerlab 4/30 com 7 LabChart </li></ol></li><li> Medição do volume de enfarte <ol class="lalpha"><li> De cérebro de rato matriz (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA) </li><li> 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), diluída a 0,05% em PBS </li><li> Scanner de mesa (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, EUA) </li><li> Image J software (ImageJ 1.42q software, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA) </li></ol></li></ol> 1. Pré-cirúrgicos Passos <ol><li> Antes da cirurgia, os ratos são alojados sob um ciclo de luz / escuridão 12:12, com livre acesso à água e à ração de roedores. </li><li> A anestesia é induzida com 4% de isoflurano em 100% de mistura de gás O2, em uma câmara de indução até que o rato já não retiradas para aperto da pata traseira. </li><li> Atécnica séptico deve ser mantida durante este processo, incluindo a utilização de luvas estéreis, instrumentos cirúrgicos estéreis, e uma cortina cirúrgica estéril 11. </li><li> A coroa da cabeça é raspada com cortar cabelo elétrica. </li><li> O rato é colocado na posição de decúbito ventral com uma almofada absorvente que encontra-se sobre uma superfície de funcionamento com temperatura controlada (manta térmica). </li><li> A cabeça é colocada no aparelho estereotáxico de partida com a colocação da máscara de gás anestésico. </li><li> Em seguida, as barras de orelha são inseridos e apertados. </li><li> Durante o procedimento de anestesia é mantida com isoflurano a 2% em 100% de mistura de gás de O 2. </li><li> Unguento oftálmico lubrificante é aplicado a ambos os olhos, e as pálpebras estão fechadas para evitar a dessecação do olho durante o procedimento cirúrgico. </li><li> Uma sonda de temperatura rectal é inserido para manter uma temperatura constante de animais núcleo de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Com a cabeça firmemente mantido no estereotáxicodispositivo, a área cirúrgica é lavada com alternância de clorexidina a 2% e solução salina, três vezes. </li></ol> 2. Passos cirúrgicos <ol><li> Utilizando um bisturi, de uma incisão na linha média é feita sobre a pele que recobre o calvarium dos aspectos mais caudais dos olhos (násio) para entre as orelhas (linha nucal superior). </li><li> A pele é então retraída lateralmente com 3 pinças bulldog. </li><li> O tecido conectivo é removida do crânio com cotonetes de algodão seco, de modo que as estruturas múltiplas pode ser vista claramente. Estes incluem bregma, a sutura coronária, e a crista do crânio lateral direito. Cotonetes de algodão são usadas para remover o sangue do campo cirúrgico. </li><li> Usando o microscópio cirúrgico, bregma está localizado, e os manipuladores estereotáxicas são ajustados até que a broca broca 1,0 milímetros rodada é zerada em bregma. </li><li> A broca de perfuração é, então, movido para 1,6 mm anterior e 5,2 mm lateral à bregma. </li><li> Um buraco broca que penetra no crânio é perfurado para cannula colocação (Figura 1). Excesso de detritos e sangue são continuamente eliminados com cotonetes. </li></ol> Neste ponto, uma cânula de guia pode ser inserida (passo 7) ou uma injecção de ET-1 directo através do orifício de broca pode ser realizada (avançar directamente para o passo 16). <ol start="7"><li> Em seguida, os furos de broca de 3 parafusos de fixação são perfurados através de espessura parcial do crânio utilizando um cone invertido 1,0 milímetros de perfuração da broca (Figura 1). Um buraco é perfurado em cada osso frontal de cerca de 1-2 mm anterior ao da sutura coronária com 1-2 mm lateral à sutura sagital. Um buraco é perfurado no osso parietal de cerca de 2-3 mm posterior à sutura coronal e 2-3 mm lateral da sutura sagital ipsilateral ao orifício guia da broca cânula. Três 0-80 x 3/32 parafusos são colocados nestes buracos broca e fornecerá suporte para o cimento que na cânula. Os parafusos devem apenas ser avançado 2 ou 3 voltas de modo a não danificar a dura-máter. </li&gt; <li> A cânula guia é colocada no suporte da cânula estereotáxico e bregma está localizado. </li><li> Os manipuladores estereotáxicas são ajustados até que a cânula guia foi zerada em bregma. A cânula é movida para o furo de broca localizado 1,6 milímetros anterior e 5,2 mm lateral à bregma. </li><li> Finalmente, a cânula guia foi baixada para dentro do furo de broca com a posição de ponta final de 4,5 mm ventral a bregma. </li><li> Laser Doppler colocação da sonda de fluxo (opcional) <ol class="lalpha"><li> A fim de controlar o fluxo de sangue cerebral utilizando LDF, um suporte da sonda pode ser colocada em posição antes da fixação da cânula guia com cimento dental. </li><li> A base de suporte da sonda é aparado rente ao pedestal com exceção de guia em forma de cunha pequena. </li><li> O suporte da sonda é então colocada posterior à cânula guia e apenas medial ao rebordo lateral do crânio com a guia orientado medialmente (Figura 1). </li><li> O titular da sonda e guide cânula estão afixadas em conjunto com cimento dental. </li></ol></li><li> Cimento dentário é então utilizado para fixar a cânula no lugar. O cimento está em contacto com os três parafusos e rodeia toda a base da cânula. </li><li> O cimento deve ser completamente seca antes da remoção do suporte da cânula. Isto demora cerca de 5 min. </li></ol> Depois destes passos, a incisão cirúrgica pode ser fechada e que o boneco cânula pode ser aparafusado na cânula guia. Alternativamente, a ET-1 induzida por MCAO pode ser realizada no rato, após um período de recuperação a partir da cirurgia de implante da cânula. Por este método, o passo 19 deve ser realizada em seguida e os passos 14-18 pode ser realizada em um momento posterior. Para realizar o implante da cânula guia e ET-1 a injecção durante a mesma cirurgia, passo 14 deve ser realizada em seguida. <ol start="14"><li> A seringa de infusão é carregado com ET-1 (diluído a 80 uM em PBS) e, em seguida, montado no injector estereotáxica. </li><li> Omanipuladores estereotáxicas são ajustados até que a ponta da agulha é colocado em zero na borda da cânula guia. </li><li> A ponta da agulha é abaixada através da cânula guia para uma posição de 17,2 milímetros ventral para o aro da cânula guia. Se uma cânula guia não é utilizada, a ponta da agulha é colocado a zero no bregma e abaixada através do orifício de broca de um milímetro posição ventral 8,7 a bregma. </li><li> 3 ul de 80 mM ET1 é infundida a uma taxa de 1 ml por min. </li><li> A seringa é deixada no lugar durante 3 minutos após a conclusão da perfusão e então lentamente removido. </li><li> A incisão é fechada com sutura de nylon 3,0 e o manequim cânula é aparafusado na cânula. </li><li> Uma dose de analgésico apropriado (isto é, a buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg) deve ser utilizado após a cirurgia, para minimizar a dor e desconforto durante o período de recuperação. </li><li> O rato é removido do conjunto cirúrgico e colocadas numa área de recuperação quente, seco para evitar a hipotermia, com acesso livre, fácil de alimentos moles e água. </li&gt; </ol>

<ol><li>Stroke--1989. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, 480-486 (2009).</li>
<li>Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Stroke%3A+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%22">Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management</a>. Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. , Churchill Livingstone. New York. 377-450 (1986).</li>
<li>Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+local+cerebral+blood+flow+to+pathological+levels+by+endothelin-1+applied+to+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat.</a> Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).</li>
<li>Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+microapplication+of+endothelin-1%3A+a+new+model+of+focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).</li>
<li>O'Neill, M. J., Clemens, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).</li>
<li>Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candesartan+pretreatment+is+cerebroprotective+in+a+rat+model+of+endothelin-1-induced+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion.</a> Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).</li>
<li>Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%3A+procedural+pitfalls+and+translational+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8(2009).</li>
<li>Tomsick, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+thrombolysis+for+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Interv.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke.</a> J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).</li>
<li>Olsen, T. S., Lassen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+concept+of+middle+cerebral+artery+occlusion+and+cerebral+infarction+in+the+acute+state+based+on+interpreting+severe+hyperemia+as+a+sign+of+embolic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration.</a> Stroke. 15, 458-468 (1984).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), e2586(2011).</li>
<li>Gonzalez, C. L., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+different+models+of+stroke+on+behaviour+and+brain+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice.</a> J. Vis. Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Sharkey, J., Butcher, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+an+experimental+model+of+stroke+produced+by+intracerebral+microinjection+of+endothelin-1+adjacent+to+the+rat+middle+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery.</a> J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).</li>
<li>Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1-induced+reductions+in+cerebral+blood+flow%3A+dose+dependency%2C+time+course%2C+and+neuropathological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).</li>
<li>Mecca, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroprotection+by+angiotensin-%281-7%29+in+endothelin-1-induced+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke.</a> Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).</li>
<li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+stroke+therapy+academic+industry+roundtable+preclinical+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations.</a> Stroke. 40, 2244-2250 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A ET-1 induzida OACM é um modelo estabelecido de acidente vascular cerebral isquêmico experimental que é regularmente utilizado em várias linhagens de ratos. Muitas variáveis, tais como a estirpe de ratos, a idade do animal, temperatura corporal, método de anestesia, e experiência do operador pode levar a aumento da variabilidade nos volumes de infarto ao usar este modelo de 5, 14. No entanto, vários investigadores têm mostrado que as vantagens deste modelo incluem a abordagem relativamente não invasiva, de ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td><ol><li> Animais: Oito semanas de idade, macho, Sprague Dawley (Farms Charles River, Wilmington, MA, EUA) pesando 250-300 g no momento da cirurgia. </li><li> Anestesia <ol class="lalpha"><li> Sistema de anestesia por inalação (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA) </li><li> Anestésico isoflurano (Baxter Farmacêutica, em Deerfield, Illinois, EUA) </li></ol></li><li> Estereotáxico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA) <ol class="lalpha"><li> Sistema estereotáxico de pequenos animais </li><li> Não-ruptura de ouvido barras para ratos </li><li> Gás titular cabeça anestesia para ratos </li></ol></li><li> Regulação da temperatura <ol class="lalpha"><li> BAT-12 termômetro microssonda (Precision Mundial Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA) </li><li> T / BOMBA, TP600 manta térmica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA) </li></ol></li><li> Instrumentos cirúrgicos <ol class="lalpha"><li> Cabo de bisturi e lâmina n º 11, íris fórceps, fórceps Graefe, afastadores braçadeira bulldog, chave de fenda, 10 seringas ul com agulha de calibre 26 chanfrado (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, Flórida, EUA) </li><li> Micromotor e broca titular estereotáxica, Quintessential Estereotáxica Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA) </li><li> 1,0 milímetros broca de perfuração redonda, 1,0 mm cone invertido de perfuração da broca (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA) </li></ol></li><li> Material cirúrgico <ol class="lalpha"><li> Parafusos de montagem 0-80 X 3/32 com 2,4 comprimento do eixo mm, 21 de calibre da cânula guia [4 milímetros longa abaixo do pedestal] e manequim cânula (um Plásticos, Roanoke, VA, EUA) </li><li> Jet acrílico dentadura e líquido (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, EUA) </li><li> 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EUA) </li><li> Cotonetes, pomada Puralube (Fisher cientificamentec, Pittsburg, PA, EUA) </li><li> Elétrica de cortar cabelo (Oster, Providence, RI, EUA) </li></ol></li><li> Produtos químicos <ol class="lalpha"><li> A endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA) </li><li> Clorexidina 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA) </li><li> Buprenorfina HCl (Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EUA) </li></ol></li><li> Equipamento de visualização <ol class="lalpha"><li> Microscópio cirúrgico (Seiler Instrumento e Manufatura; St. Louis, MO, EUA) </li><li> Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA) </li></ol></li><li> Laser Doppler fluxometria sistema (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, EUA) <ol class="lalpha"><li> Sonda lápis padrão </li><li> Suporte da sonda </li><li> Fluxômetro sangue </li><li> Powerlab 4/30 com 7 LabChart </li></ol></li><li> Medição do volume de enfarte <ol class="lalpha"><li> De cérebro de ratomatriz (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA) </li><li> 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), diluída a 0,05% em PBS </li><li> Scanner de mesa (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, EUA) </li><li> Image J software (ImageJ 1.42q software, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA) </li></ol></li></ol></td></tr></tbody></table>

endotelina-1 induzida médio modelo de oclusão da artéria cerebral para avc isquêmico com laser orientação fluxometria doppler em ratos

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

AVC é a causa número um de deficiência e terceira principal causa de morte no mundo, com um custo estimado de US $ 70 bilhões em Estados Unidos, em 2009 1, 2. Vários modelos de isquemia cerebral têm sido desenvolvidos para mimetizar a condição humana de acidente vascular cerebral. Tem sido sugerido que até 80% de todo o resultado de danos isquémicos pancadas na artéria cerebral média (MCA) de área de 3. No início dos anos 1990, a endotelina-1 (ET-1) 4 foi utilizado para induzir isquemia, aplicando-a directamente adjacente à superfície da MCA após craniotomia. Mais tarde, este modelo foi modificado 5 utilizando uma injecção estereotáxica de ET-1 ao lado da MCA para produzir isquemia cerebral focal. As principais vantagens deste modelo incluem a capacidade de realizar o procedimento de forma rápida, a capacidade para controlar a constrição da artéria através da alteração da dose de ET-1 emitido, não há necessidade de manipular os vasos extracranianos que fornecem sangue ao cérebro, bem como reperfusi gradualem taxas que mais de perto imita a reperfusão em humanos 5-7. Por outro lado, o modelo ET-1 tem desvantagens que incluem a necessidade de uma craniotomia, bem como maior variabilidade no volume de curso 8. Esta variabilidade pode ser reduzida com a utilização de dopplerfluxometria a laser (LDF) para verificar se a isquemia cerebral durante a infusão de ET-1. Fatores que afetam a variabilidade AVC incluem precisão de infusão e lote do ET-1 utilizado 6. Outra consideração importante é que, apesar de reperfusão é uma ocorrência comum em acidente vascular cerebral humano, a duração da oclusão por ET-1 induzida por MCAO pode não imitam de perto a do acidente vascular cerebral humano onde muitos pacientes têm reperfusão parcial ao longo de um período de horas a dias após a oclusão 9, 10. Este protocolo irá descrever em detalhes a ET-1 induzida modelo OACM para AVC isquêmico em ratos. Será também chamar a atenção para as considerações especiais e inconvenientes potenciais durante todo o procedimento.

1. Pós-Op avaliação neurológica Depois de o animal recupera a consciência, uma grande variedade de ensaios pode ser utilizada para avaliar défices neurológicos incluindo o equilíbrio, a força de preensão, colocação da pata, assimetria postural e escada de escalada. A tarefa de semente de girassol é uma avaliação grosseira da função motora e sensorial que tem correlação significativa com infarto volume 7, 12. Durante essa tarefa, os ratos são cronometrados ao abrir e consumir 5 sement...

Vários modelos animais de isquemia cerebral foi desenvolvido para simular a condição humana de acidente vascular cerebral. Este protocolo descreve a endotelina-1 (ET-1) induzida por oclusão da artéria cerebral média do modelo (MCAO) para acidente vascular cerebral isquêmico em ratos. Além disso, considerações importantes, vantagens e inconvenientes deste modelo são discutidos.

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Este protocolo de vídeo descreve um modelo de oclusão da artéria cerebral média induzida por endotélio para AVC isquêmico com orientação inflamatória por laser doppler em ratos. Isso é conseguido observando vários pontos de referência conforme mostrado e injetando um endotelial através de um orifício de rebarba com ou sem o uso de uma cânula guia. Vários métodos de isquemia cerebral foram desenvolvidos para modelar a condição humana do AVC.Um modelo envolve a injeção de um potente vasoconstritor endotelial um ou 81 no cérebro cérebro adjacente à artéria cerebral média após o tumor craniano. As principais vantagens do modelo ET one stroke são que a cirurgia pode ser realizada rapidamente e é menos invasiva em comparação com outros modelos, como a oclusão da artéria cerebral média induzida por filamento intraluminal. No entanto, o modelo ET de um AVC tem algumas desvantagens, incluindo a necessidade de craniotomia, bem como maior variabilidade no volume sistólico.Este vídeo demonstrará de forma gradual o modelo ET de um AVC para AVC isquêmico em ratos. Também discutiremos várias considerações especiais, bem como armadilhas comuns desse procedimento. Então vamos começar.A anestesia é induzida com flúor 4% ISO em oxigênio em uma câmara de indução e é mantida durante a cirurgia a 2% Depois que o rato é anestesiado, o cabelo é removido do topo da cabeça com máquinas de cortar cabelo elétricas. O rato é então colocado em decúbito ventral sobre uma gaze deitada numa superfície de operação com temperatura controlada, com a cabeça colocada no aparelho estereotáxico. As barras auriculares são então apertadas e ajustadas.A pomada oftálmica lubrificante é aplicada em ambos os olhos para evitar a dessecação ocular. Durante o processo cirúrgico, o couro cabeludo é então limpo com solução de clorexidina e solução salina estéril. Uma incisão na linha média é feita na pele que cobre a calvária, entre os aspectos mais mimados dos olhos até entre as orelhas.Em seguida, a pele é retraída lateralmente. Cotonetes secos são usados para mover o tecido conjuntivo lateralmente, de modo que pontos de referência ósseos podem ser observados como mostrado aqui. A broca é então movida para 1,6 milímetros anterior e 5,2 milímetros lateral em relação ao torema.Um pequeno orifício de broca é então perfurado neste local, que deve penetrar no crânio sem danificar a dura-máter. Em seguida, a broca é movida aproximadamente três a quatro milímetros para fazer três furos rasos separados. Isso servirá como colocação para três parafusos de ancoragem de montagem, aparafuse parcialmente três parafusos de montagem que fornecerão suporte para a fixação de cimento na cânula guia.Um guia de aço inoxidável de 21 calibres. A cânula é então inserida no orifício da broca 4,5 milímetros abaixo do bgma. Um suporte de sonda de fotometria Doppler a laser é então colocado logo posterior à cânula guia e medial ao crânio lateral.O cimento Ridge Dental é usado para prender a cânula e o suporte da sonda no lugar. É importante moldar o cimento de forma que fique em contato com os três parafusos, evitando a pele. A fixação do braço estereotáxico é então removida depois que o cimento estiver totalmente seco.Para registrar o fluxo sanguíneo da artéria cerebral média. Uma sonda inflamatória doppler a laser é então colocada no suporte da sonda. Uma seringa Hamilton de calibre 26 é carregada com endotelial micromolar nova de 80 e carregada em uma bomba de injeção automática.Usando os ataques estéreo, a agulha da seringa Hamilton é abaixada até tocar a borda da cânula guia. A agulha é então abaixada ventralmente 17,2 milímetros através da cânula guia e três microlitros de endotélio. Um é injetado a uma taxa de um microlitro por minuto usando fotometria doppler a laser.Você pode ver que o fluxo sanguíneo diminui em mais de 50% desde o início. Após alguns minutos com o tempo, ele retorna gradualmente ao valor da linha de base. Poucos minutos após a conclusão da injeção, a agulha é retirada suavemente da cânula guia.Por último, a ferida é fechada com sutura e a cânula é tampada. Para avaliar o grau de déficit sistólico, diferentes exames neurológicos podem ser realizados. Este é um exemplo da tarefa de comer sementes de girassol.Os ratos são avaliados tanto pelo tempo que levam para consumir cinco sementes quanto pelo número de pedaços de casca deixados para trás. Ratos com maior déficit de braçada consumirão as sementes mais lentamente E deixar mais pedaços de casca para trás. Além dos exames neurológicos, o volume do infarto também pode ser avaliado usando a coloração TTC, conforme descrito em detalhes em um protocolo de vídeo separado, que pode ser encontrado no endereço na tela.A oclusão da artéria cerebral média induzida por TE é um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico que é regularmente usado em espécies murinas. Este método permite o controle da constrição da artéria, alterando a dose de ET administrada e gradual, em oposição à reperfusão abrupta que imita mais de perto a de humanos humanos. Embora a reperfusão seja uma ocorrência comum no AVC humano, a reperfusão para a oclusão da artéria cerebral média induzida por TE um pode não imitar de perto a do AVC humano, onde a maioria dos pacientes tem pelo menos reperfusão parcial, mas durante um período de horas a dias após a oclusão.Outra desvantagem do método ET de um curso é que muitas variáveis, como tensão do rato, peso da idade, bem como experiência do operador, podem levar a inconsistência e volumes de infarto. No entanto, essa variabilidade pode ser reduzida com o uso da árvore de fluxo doppler a laser para verificar isquemia cerebral durante a infusão do TE um. Finalmente, a constrição rápida e a reperfusão gradual durante a oclusão da artéria cerebral média induzida pelo TE um podem imitar de perto o vasoespasmo observado após a hemorragia subaracnoide.Portanto, esse modelo também pode ser uma ferramenta útil para estudar a isquemia que ocorre durante eventos de vasoespasmo. Esperamos que você tenha achado este vídeo útil e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Indução cirúrgica de uma lesão cerebral isquêmico no rato é um modelo amplamente utilizado para a pesquisa acidente vascular cerebral. Aqui nós demonstram a indução de isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média. Visualização do infarto resultantes de coloração histológica e ressonância magnética também é mostrada.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Este artigo descreve um método para a visualização de artérias cerebrais de rato através de uma janela craniana via craniectomia temporal, a fim de visualizar partes proximais da artéria cerebral média...

Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Monitorização da perfusão cerebral foi demonstrada para melhorar a precisão em modelos de isquemia AVC. Dificuldades técnicas, muitas vezes limitam o uso desta ferramenta essencial para a pesquisa vascular cerebral. Neste vídeo, um sistema optimizado é mostrado para obter um controlo único ou multi-local hemodinâmicas durante a oclusão da artéria cerebral média intraluminal em ratos.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de isquemia de retina por oclusão da artéria carótida comum bilateral transitória usando suturas simples e um grampo. Este modelo pode ser útil para entender os mecanismos patológicos da isquemia da retina causada por anormalidades cardiovasculares.

Um modelo murino de lesão isquêmica da retina induzida pela oclusão da artéria da carótida comum bilateral transitória

Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.

Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

O protocolo atual descreve um modelo de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média em ratos que preserva a estrutura anatômica dos vasos cerebrais sem causar danos.

Um modelo de rato de oclusão/reperfusão da artéria cerebral média sem danificar a estrutura anatômica dos vasos cerebrais

Este protocolo apresenta um guia passo a passo para os pesquisadores realizarem o procedimento de oclusão da artéria cerebral média em camundongos usando o método modificado da artéria carótida externa Longa. As modificações apresentadas neste artigo visam aumentar a acurácia da oclusão da artéria cerebral média e garantir a reperfusão completa.

Otimização do Método de Oclusão da Artéria Cerebral Média Longa para Reperfusão Completa

Um procedimento cirúrgico minimamente invasivo é mostrado aqui, que envolve a colocação da sonda Doppler a laser no crânio sobre a região distal da artéria cerebral média (ACM), um local periorbital adequado para ratos e camundongos, para avaliar o fluxo sanguíneo durante a oclusão transitória da ACM.

Colocação periorbital de uma sonda Doppler a laser para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral antes da oclusão da artéria cerebral média em modelos de roedores

Este protocolo descreve o processo de preparação para a reperfusão da oclusão da artéria cerebral média através da artéria carótida comum.

Preparação de um modelo modificado para reperfusão de oclusão da artéria cerebral média

Aprenda o modelo de oclusão da artéria cerebral média induzido por endotelina-1 para AVC isquêmico em ratos usando fluxometria Doppler a laser. Este método menos invasivo permite estudos sobre mecanismos de derrame cerebral.

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos (Vídeo) | JoVE Journal

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

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