Name: Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a manipular geneticamente células epiteliais em glândulas salivares submandibulares de embriões de camundongo usando vetores adenovirais. Este método permite estudar funções gênicas sem criar organismos transgênicos.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Nelson Deirdre pelos comentários úteis e para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH DE019244, DE019197, e DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, e C06 RR015464 para a Universidade de Albany, SUNY.

O protocolo contém quatro etapas principais, conforme representado na Figura 1. Todos os passos são descritos em pormenor. Construção do adenovírus e purificação viral deve ser realizada antes da colheita de órgãos para utilização na transdução genética das dissecados rudimentos epiteliais. Todos os padrões de precauções BSL-2 de segurança devem ser seguidas quando se trabalha com adenovírus. 1. Embrionárias de camundongos glândula submandibular colheita (SMG) e Microdissecção <ol><li> Euthanize timed-fêmeas grávidas de ratinhos (estirpe CD-1 outbred ou ICR) usando CO 2 narcose, seguido por deslocação cervical e cordas de colheita de embriões de ratinho no dia embrionário 13 (E13, 3-5 brotos epiteliais) seguintes procedimentos aprovados pelo IACUC institucional comitê. O dia da descoberta plug vaginal é designado como E0. As glândulas salivares podem também ser colhidas e cultivadas na fase E12, quando existe um único botão primário e do caule com fendas apenas começandopara iniciar. SMGs anteriores a esta fase requer diferentes condições de cultivo que os indicados aqui. </li><li> Transferir cordas de embriões em estéreis 10 centímetros pratos de cultura de tecido cheias com 25 ml de DMEM / Ham &#39;s Medium F12 (F12) sem vermelho de fenol (Life Technologies), suplementado com 100 U / penicilina ml e 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Usando um bisturi estéril (# 11 lâminas) e fórceps (# 5, Ferramentas Ciência Fine, 11.252-20), remova os embriões dos sacos em um prato separado 10 centímetros contendo 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep. </li><li> Cortar as cabeças de embriões com um corte angular, logo abaixo do maxilar inferior. </li><li> Isolar as mandíbulas inferiores das cabeças sob um microscópio de dissecação estéreo com uma base de luz transmitida (Nikon SMZ645 ou equivalente), utilizando um corte abaixo do maxilar superior. Colocar os tecidos em cima de uma peça extra de vidro, em vez de directamente sobre o elemento de vidro da base do microscópio. </li><li> Recolha as mandíbulas inferiores em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um prato de 35 milímetros estéril de cultura de tecido. </li><li> Coloque uma fatia mandíbula na platina do microscópio de dissecação, de modo que a lingueta está na parte inferior da fatia, mas está a apontar para a posição 0:00 horas. </li><li> Usando um dos lados de duas pinças cruzadas em um movimento de tesoura, remover e descartar o rd 1/3 inferior da fatia de mandíbula. </li><li> Transformar a fatia de 90 ° para a direita (se destro) e, usando um corte de tesoura com o fórceps, cortar a parte superior da fatia da mandíbula (sem corte da língua) na metade da fatia. </li><li> Descascar o tecido em excesso e removê-la para expor as SMGs por baixo. Haverá um de cada lado, perto da base da língua. </li><li> Usando um par de fórceps para segurar o tecido pela língua, usar o fórceps outros para provocar a SMG longe da língua. Repita o processo para a glândula outro. </li><li> Recolher as glândulas salivares microdissecadas em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um tecido estéril 35 milímetros novoplaca de cultura. Nota: as glândulas submandibulares maiores (3-5 brotos epiteliais), juntamente com a mais pequena glândula sublingual conectado (1 bud) podem ser cultivadas intactas saltando a etapa 4 e realizando os passos 4.1, 4.3, e 4.4, como descrito anteriormente 2,8. </li></ol> 2. SMG Separação Rudiment epitelial <ol><li> Colocar 5 (ou mais) das glândulas salivares para um fundo de vidro de 50 mm de diâmetro de micropoços prato (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F), contendo 200 ul de solução salina equilibrada de Hank (HBSS sem Ca + + ou Mg + +, Life Technologies) contendo 0,4% (v / v) de dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, utilizando uma ponta de pipeta estéril de 200 ul, aspirar cuidadosamente a solução de dispase, sem perturbar as glândulas. Imediatamente adiciona-se 200 ul de meio DMEM/F12 contendo 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pré-esterilizado com um filtro de 0,22 ^ M) para neutralizar a dispase. </li> &lt;li&gt; Sob um microscópio de dissecação, usando um par de pinças com pontas finas (# 5 Dumostar, Ferramentas Ciência Fine, 11.295-20), gentilmente separar o mesênquima solto ao redor dos botões SMG epiteliais e dutos, tendo o cuidado de deixar o epitélio intacto . </li><li> Pré-molhada estéril 200 ponteira ul com DMEM/F12-BSA mídia e gentilmente pipetar os rudimentos epiteliais em um 50 milímetros de diâmetro novo prato micropoços contendo 200 ul de DMEM/F12 + caneta strep. Use uma alta qualidade de 200 ul de ponta da pipeta com uma extremidade lisa. </li><li> No prato que contém as peças mesênquima, descartar qualquer tecido não-mesenquimal, incluindo as glândulas sublinguais e quaisquer destacadas botões de glândulas submandibulares. </li></ol> 3. A infecção adenoviral de Rudiments Epiteliais <ol><li> Fazer 200 ul de meios de infecções virais através da diluição do adenovirus de interesse em DMEM/F12 + pen-strep em um tubo de microcentrífuga, de modo que o título da solução resultante é 1x10 8 -10 9 PFU. Otítulo óptimo requerido para diferentes vírus podem variar. É importante a utilização de cloreto de césio (CsCl), preparações purificadas virais para a eficiência de absorção óptima. </li><li> Remova a mídia do prato contendo os cinco rudimentos epiteliais. Rapidamente adicionar 200 ul do meio de infecção, mantendo-se os rudimentos húmida em todos os momentos. Tome precauções necessárias ao manuseio do vírus e eliminação de pontas de pipeta contaminados. Desinfectar as superfícies contaminadas com vírus solução de água sanitária a 10%. </li><li> Mover os rudimentos epiteliais longe um do outro, com uma pinça para evitar que fiquem colados e permitir que elas se depositem no fundo da placa. Incubar rudimentos em meios virais durante 1 hora à temperatura ambiente. Durante a incubação, a separação dos rudimentos, se eles se movem juntos. Balanço excessivo ou movimento vai permitir que as glândulas a se aglutinarem. </li><li> Após a incubação, remova a mídia viral contendo e descartar adequadamente, tendo o cuidado de não perturbar o rudiments. Adicionar 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep. Repita esta lavagem pelo menos mais duas vezes e substituir com 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep mídia. Estas lavagens são críticos para remover qualquer vírus que não está fortemente ligado ao epitélio e para evitar a infecção do mesênquima. </li><li> Incubar rudimentos epiteliais com 200 ml de DMEM/F12 contendo 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356231) durante 20 minutos. Descobrimos que esta incubação curto em Matrigel minimiza a regressão das fissuras existentes, durante o período de cultura inicial, mas este passo pode ser omitido se a exposição a Matrigel não é desejado. </li></ol> 4. Cultura ex vivo de SMGs recombinados <ol><li> Colocar cada rudimento, um de cada vez, usando uma pré-molhado 200 ul ponta de pipeta, em cima de um (pequeno corte) com entalhe 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) que flutuam mais de 200 uL de meio de cultura ( 5 rudimentos / filtro) em uma microplaca com fundo de vidro. Os meios de culturaé: DMEM/F12 + pen-strep contendo 50 ug / ml de transferrina e 150 mg de ácido ascórbico / ml, conforme descrito anteriormente 2,8. Transferrina é conhecido por estimular a sobrevivência e ramificação morfogénese de glândula salivar e de outros órgãos explantes 9. Adição de ácido ascórbico foi mostrado para estimular SMG ramificação. 10 É conhecido por actuar como um cofactor em reacções de hidroxilação de muitos processos metabólicos (tais como a hidroxilação de prolina durante a formação de colagénio fibra 11) e também estimula a produção de fibronectina e laminina em explantes de outros órgãos 12. </li><li> Remover como meios muito em cima do filtro que possível após a adição de cada um rudimento epitelial. Media muito em cima do filtro pode causar o filtro para afundar, enquanto meios menos torna a colocação dos rudimentos mesênquima e muito mais fácil. Mídia em excesso pode ser removido quer com uma ponta de pipeta ou usando uma pinça para agarrar os meios de comunicação entre as pontas. </li><li> Peças mesenquimais derivadas lugar from 3-4 glândulas na parte superior e / ou em torno de cada um rudimento epitelial. Remova qualquer mídia extra que está ao redor das glândulas para evitar o movimento do mesênquima longe dos rudimentos. Mesênquima derivado mais glândulas não é benéfico, mas pode ser menos prejudicial para o crescimento rudimento epitelial. </li><li> Incubar SMGs recombinados num incubador humidificado (95% de ar / 5% CO 2), a 37 ° C durante 48 -72 horas, conforme desejado. </li><li> Adquirir claro e / ou imagens fluorescentes das glândulas ao vivo a 0 h (se desejado), duas horas após a recombinação e cada hora 24, depois disso, um microscópio de luz invertida, na posição vertical, ou estéreo equipado com uma câmara digital, utilizando um objetivo de ampliação 4X ou 5X para capturar toda a glândula recombinada em um único quadro de vista. Imagens da glândula salivar mostrar o melhor contraste usando a configuração de campo claro ou o anel de fase apropriado colocado a meio caminho para o percurso da luz (que não é possível no totalmente automatizados microscópios). Contraste de fase normal hát necessário uma vez que a glândula é grossa e cria contraste. </li><li> Nas desejados pontos de tempo, SMGs recombinados pode ser fixo durante 20 minutos com solução de fixação constituídos por 2% de paraformaldeído (PFA) em 1X PBS contendo 5% (w / v) de sacarose (para melhor preservar a estrutura celular interna, mantendo as células em um estado isosmótica). Ao contrário de PFA a 4%, 2% PFA irá preservar uma quantidade significativa do sinal de GFP, se o fixador estiver completamente removido após a fixação. Glândulas pode ser armazenado durante até 1 semana, em 1X PBS no escuro a 4 ° C até que toda a imunocitoquímica de montagem e de imagem confocal é realizada, como relatado anteriormente 3,6,13-15. Idealmente, imunocitoquímica e imagem deve ser realizada logo após a fixação de obter imagens de melhor qualidade. Glândulas também podem ser lisadas em tampão RIPA para SDS-PAGE seguido por Western blotting. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ex vivo técnica de recombinação epitelial-mesenquimal foi publicado em glândulas salivares submandibulares em 1981 16. Neste protocolo, expandir-se no método original, utilizando infecção adenoviral para manipular a expressão de genes das células epiteliais, no contexto de uma glândula recombinada. Mostra-se que a percentagem de células epiteliais infectadas com o adenovirus, enquanto que a percentagem de células que estão infectadas depende das propriedades do promotor viral, titulação viral e pur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium sem vermelho de fenol </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina e estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Estoque 10X </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelar em alíquotas de utilização única de 20C- </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> V fração, endotoxina baixo </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Deveria ser título elevado (1x10 10 pfu / ml). Vírus CsCl purificados são mais eficazes do que os vírus purificado coluna neste ensaio. </td></tr><tr><td> Paraformaldeído 16% </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Diluída a 2% em PBS com 5% de sacarose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampão de fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparado a partir estoque 10X </td></tr><tr><td> Solução Salina Equilibrada de Hank </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> sem cálcio, magnésio não, não Vermelho de Fenol </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media. Congelar de uso único alíquotas a-20C </td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico (Vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media.Freeze de uso único alíquotas a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Lista dos reagentes necessários para a SMG protocolo recombinação. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 centímetros pratos de plástico estéreis </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados. </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio estéreo com base de luz transmitida </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Qualquer estéreo microscópio de dissecção podem ser utilizadas, que tem uma base de luz transmitida. </td></tr><tr><td> 35 placas de cultura de tecidos milímetros </td><td> Falcão </td><td> 353001 </td><td> Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados. </td></tr><tr><td> 50 mm de diâmetro pratos micropoços </td><td> MatTek Corporação </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtros de membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,1 milímetros </td></tr><tr><td> Widefield microscópio de fluorescência </td><td> Carl Zeiss, EUA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Qualquer microscópio de fluorescência (de pé, inverted ou estéreo microscópio de dissecção) pode ser utilizado para monitorizar a expressão da GFP em baixa ampliação com uma câmara anexa digital. </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocal é necessário ver estruturas celulares detalhados. Qualquer microscópio confocal pode ser usado. </td></tr><tr><td> Timed-fêmeas grávidas de ratinhos, tensão CD-1 ou ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Os embriões são colhidos no dia 13 (dia da descoberta com tampão designado como dia 0). </td></tr><tr><td> Lâmina de bisturi n º 11 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo de bisturi n º 3 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 5 fórceps liga de inox, 0.05mm X 0,02 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal para a colheita de embriões glândulas </td></tr><tr><td&gt; Dumont n º 5 fórceps liga dumostar, 0.05mm X 0,01 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Pontas finas são necessárias para a remoção do epitélio mesênquima. Agulhas de tungsténio também podem ser usados. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento Tabela 2. Usado em SMG protocolo recombinação. </td></tr></tbody></table>

modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Ramificação morfogénese ocorre durante o desenvolvimento de muitos órgãos, e a glândula submandibular embrionário de rato (GSM) é um modelo clássico para o estudo da ramificação morfogénese. No desenvolvimento de SMG, este processo envolve passos iterativos de broto epitelial e formação de condutas, para finalmente dar origem a uma rede complexa ramificada de ácinos e ductos, que servem para produzir e modificar / transportar a saliva, respectivamente, para dentro da cavidade oral 1 - 3. A membrana basal epitelial associada e aspectos do compartimento mesenquimal, incluindo as células do mesênquima, factores de crescimento e da matriz extracelular, produzida por estas células, são essenciais para o mecanismo de ramificação, embora como os eventos celulares e moleculares são coordenadas permanece pouco compreendido 4 . O estudo dos mecanismos moleculares condução avanços morfogênese epiteliais nossa compreensão de mecanismos de desenvolvimento e fornece insights sobre Regener possívelAtive abordagens da medicina. Estes estudos têm sido dificultados pela falta de métodos eficazes de manipulação genética do epitélio salivar. Atualmente, a transdução adenoviral representa o método mais eficaz para os células epiteliais nas glândulas adultos in vivo 5. No entanto, em explantes de embriões, mesênquima densa e a membrana basal que envolve as células epiteliais viral impede o acesso às células epiteliais. Se o mesênquima é removida, o epitélio pode ser transfectado utilizando adenovírus, e rudimentos epiteliais pode retomar a morfogénese ramificação na presença de Matrigel ou laminina-111 6,7. Mesênquima livre de crescimento epitelial rudimento também requer suplementação adicional com factores de crescimento solúveis e não totalmente recapitular morfogénese de ramificação tal como ocorre nas glândulas intactas 8. Aqui descrevemos uma técnica que facilita a transdução adenoviral de células epiteliais e cultura do e transfectadaspithelium com mesênquima associado. Após microdissecção dos SMGs embrionárias, a remoção do mesênquima e infecção viral do epitélio com um adenovírus contendo GFP, vamos mostrar que o epitélio espontaneamente recombina com mesênquima não infectado, recapitulando estrutura intacta SMG glandular ea ramificação morfogênese. A população de células geneticamente modificadas epitelial pode ser facilmente controlada por meio de métodos padrão de microscopia de fluorescência, se fluorescentemente marcado com construções adenovirais são utilizados. O método de recombinação tecido aqui descrito é actualmente o método mais eficaz e acessível para a transfecção de células epiteliais com um vector do tipo selvagem ou mutante no interior uma estrutura de tecido complexo 3D que não requer a geração de animais transgénicos.

O fluxo dos principais passos experimentais é apresentada na Figura 1. Um exemplo de um SMG intacto, um rudimento isolado epitelial, e sua mesênquima correspondente são mostrados na Figura 2. As imagens de campo claro de SMGs recombinadas, que continuam a sofrer de ramificação morfogénese quando cultivadas ex vivo para os tempos indicados, são mostrados na Figura 3. Glândulas recombinados cultivadas durante 48 horas expressando GFP epitelial são mostrados na <s...

Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivadas glândulas embrionárias de camundongos submandibulares (SMGs) utilizando transferência de gene viral é descrito. Este método tira vantagem da capacidade inata de SMG epitélio e mesênquima para recombinar-se espontaneamente, após a separação e a infecção de rudimentos epiteliais com vectores adenovirais.

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

O objetivo geral deste procedimento é alterar a expressão de uma proteína desejada no epitélio do camundongo, glândula salivar submandibular embrionária usando construções adenovirais. Isso é feito colhendo embriões no dia embrionário 13 e dissecando as glândulas salivares submandibulares. Em seguida, os rudimentos epiteliais são separados do mesênquima circundante e embebidos em cultura contendo vírus.O meio após a lavagem do rudimento é incubado em meio contendo matrigel, e combinamos com três dos mesênquimas para alterações de cultura ex vivo nos níveis de proteínas-alvo e seu efeito na morfogênese ramificada pode ser analisado usando imunoquímica e microscopia padrão ou análise de sangue ocidental. Essa técnica nos permite modificar geneticamente apenas um compartimento de tecido em um órgão complexo e monitorar as mudanças em uma explicação de órgão inteiro remontado sem criar um organismo transgênico. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela possibilita a expressão de um tipo selvagem ou proteína negativa dominante dentro do compartimento epitelial.Seguindo os procedimentos padrão, primeiro colha 13 embriões em pratos de 10 centímetros com 25 mililitros de meio. Em seguida, usando uma pinça, remova os embriões de seus sacos e transfira os embriões para um prato de 10 centímetros contendo 25 mililitros de D-M-E-M-F 12 com caneta estreptocócica sob um estereoscópio com uma base de luz transmitida, posicione o embrião em cima de um pedaço de vidro limpo. Agora separe as cabeças do embrião com um corte angular logo abaixo da mandíbula inferior ou mandíbula e isole as mandíbulas inferiores usando um corte abaixo da mandíbula superior.Em seguida, transfira as mandíbulas inferiores para três mililitros de D-M-E-M-F 12 com caneta estreptocócica em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros. Agora retorne uma mandíbula para a placa de vidro no palco e posicione-a de forma que a língua toque o vidro e aponte para a posição das 12 horas. Usando um lado de duas pinças cruzadas em um movimento de tesoura, remova e descarte o terço inferior da mandíbula.Em seguida, gire a mandíbula 90 graus em direção à mão dominante e, com um movimento de tesoura, corte a parte superior da mandíbula. Agora retire o excesso de tecido e exponha as SMGs abaixo do tecido. Haverá um de cada lado, perto da base da língua, de cada lado.Use um par de pinças para segurar o tecido próximo à língua e o outro par para afastar o SMG da língua. Neste ponto, o SMG maior e a glândula sublingual adjacente podem ser cultivados intactos com o mesênquima circundante. Caso contrário, prossiga para a próxima seção.Comece colocando pelo menos cinco plantas de glândulas salivares em um prato de micropoços de 50 milímetros com fundo de vidro com 200 microlitros de HBSS mais pasta diss. Incube as glândulas por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, aponte cuidadosamente a solução de pasta diss sem perturbar as glândulas imediatamente.Adicione 200 microlitros de mídia DMEF 12 com BSA Para neutralizar a dispa, use um par de pinças número cinco com pontas finas para separar suavemente o tecido mesênquima solto com a glândula sublingual dos brotos epiteliais e ductos da glândula submandibular maior. Tenha cuidado para deixar o epitélio o mais intacto possível. Em seguida, selecione uma ponta de pipeta de 200 microlitros de alta qualidade com uma borda lisa pré-na ponta em mídia DMEF 12 BSA.Em seguida, pipete suavemente os rudimentos epiteliais livres de mechy em uma nova placa de micropoços de 50 milímetros de diâmetro contendo 200 microlitros de D-M-E-M-F 12 mais estreptococos de caneta. Finalmente, no prato que contém os pedaços de mesênquima, descarte qualquer tecido não mesenquimal. Isso inclui as glândulas sublinguais e quaisquer botões da glândula submandibular destacados.Reserve o mesênquima restante. Primeiro, prepare 200 microlitros de meio de infecção na concentração ideal de título a partir de uma preparação viral purificada com gradiente de cloreto de césio. Agora, sob o microscópio de dissecação, remova a mídia da placa contendo os cinco rudimentos epiteliais.Em seguida, adicione rapidamente 200 microlitros do meio de infecção, mantendo os rudimentos sempre úmidos usando uma pinça. Separe os rudimentos epiteliais longe uns dos outros para evitar que grudem e permitir que se acomodem no fundo do prato. Em seguida, deixe os rudimentos incubarem no meio viral por uma hora em temperatura ambiente com o mínimo de perturbação.Verifique os rudimentos a cada 15 minutos para garantir que eles não se aproximaram. Se necessário, separe-os com uma pinça. Após a incubação sob o microscópio de dissecação, remova suavemente a mídia viral e descarte adequadamente, tomando cuidado para não romper os rudimentos.Em seguida, lave os rudimentos com 200 microlitros de mídia fresca duas vezes. Essas lavagens são essenciais para remover qualquer vírus fraco ligado ao epitélio e prevenir a infecção do mesênquima. Após a segunda lavagem com mídia a 200 microlitros de mídia, continuando 2% de matrigel, novamente, tomando cuidado para não permitir que os rudimentos se aglomerem.Em seguida, deixe os rudimentos incubarem por 20 minutos em temperatura ambiente usando uma ponta de pipeta Prewitt de 200 microlitros, coloque cinco rudimentos em cima de um filtro de membrana entalhado, que está flutuando em 200 microlitros de meio de cultura em uma placa de micropoços com fundo de vidro. Usando uma ponta de pipeta ou fórceps, remova o excesso de mídia da parte superior do filtro para que o filtro não afunde e os rudimentos epiteliais permaneçam no lugar. Em seguida, coloque todas as peças de meine derivadas de três a quatro glândulas ao redor de cada rudimento epitelial, garantindo que estejam em contato direto A recombinação do mesênquima de três a quatro glândulas com o único rudimento epitelial infectado por vírus é fundamental para o crescimento e desenvolvimento da glândula salivar submandibular recombinada.Em seguida, remova o excesso de mídia ao redor das glândulas para que o mesênquima não se afaste dos rudimentos. Agora incube as glândulas recombinadas em uma incubadora umidificada por dois a três dias inteiros usando o procedimento descrito. SMGs embrionárias intactas foram isoladas e, após o tratamento com DYS pace, o rudimento epitelial foi removido do mesênquima circundante.Imagens de campo claro revelaram que as SMGs recombinadas continuaram a sofrer morfogênese ramificada. Quando cultivado ex vivo. Para os tempos indicados, combinamos glândulas que foram cultivadas por 48 horas após o tratamento com A GFP.O adenovírus expressou GFP apenas no epitélio. Combinamos SMGs foram corrigidos, corados e fotografados. Após 72 horas, vários marcadores foram utilizados.Os núcleos são corados por dpi, o marcador epitelial eco aqui em vermelho demarca a população de células epiteliais do mesênquima circundante. As células epiteliais estão expressando GFP adenoviral A detecção da proteína da membrana basal peran em ciano localizada na periferia do epitélio demonstra que há pelo menos uma reconstituição parcial da membrana basal em glândulas recombinadas. Projeções confocais para DPI em azul e beta três tubulina em vermelho mostram que os gânglios parassimpáticos dentro do mesênquima sofrem crescimento de URI e inervam as glândulas em culturas de recombinação.Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão das técnicas de cultura de glândulas salivares submandibulares embrionárias. A remoção do mesênquima do epitélio, bem como a recombinação do mesênquima com o epitélio infectado por vírus, podem ser etapas difíceis. No entanto, esse procedimento permite a alteração da expressão proteica usando uma construção viral que é aplicada às células epiteliais.Apenas a infecção adenoviral nos permite adicionar proteínas negativas constitutivamente ativas ou dominantes ao epitélio para determinar como a manipulação de uma proteína específica alterará o crescimento e o desenvolvimento da glândula salivar submandibular embrionária.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

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