Name: Aplicação Clínica de A Bela Adormecida Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a modificar geneticamente células T usando o sistema Sleeping Beauty para expressar CARs específicos de CD19. Este método utiliza eletrotransferência de plasmídeos e co-cultura com células artificiais apresentadoras de antígenos para imunoterapia de câncer.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Carl June (Universidade da Pensilvânia) para ajudar a geração e fornecimento de clone AAPC # 4 e Dr. Perry Hackett (Universidade de Minnesota) para obter ajuda com o sistema SB. Conceder um apoio: Cancer Center Núcleo Grant (CA16672); SR1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fundo; Gillson Longenbaugh Foundation; Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas; CLL Global Research Foundation; Departamento de Defesa; Imóveis de Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fundo de Imunoterapia Leucemia, Instituto de Terapia personalizado do câncer, leucemia e linfoma Sociedade; Fundação de Pesquisa linfoma; Irmã MDACC da Instituição Rede Fundo; Miller Foundation; Sr. Herb Simons; Sr. e Sra. Joe H. Scales, o Sr. Thomas Scott; Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer, Fundação de Pesquisa Pediátrica Câncer; assistanc Produçãoe para terapias celulares (PACT), William Lawrence e Fundação Blanche Hughes Infância.

<html> Dia 0 ou Antes 1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de PB e UCB <ol><li> Diluir PB com igual volume, e UCB com quatro volumes de PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue camada diluída (25 ml) em Ficoll (12 ml) num tubo de centrifugação de 50 ml (s) e centrifugar a 400 xg durante 30 - 40 minutos (sem travagem). </li><li> Recolher e transferir a fracção de células mononucleares (interface) utilizando uma pipeta de transferência para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Trazer o volume até 50 ml com PBS-EDTA e centrifugar a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante, gentilmente re-suspender o sedimento de células (s) em 50 ml de meio de cultura completo (CCM) e, centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Delicadamente ressuspender e piscina as pelotas de células em CCM e realizar uma contagem de células usando Trypan método de exclusão de azul (Cellometer, programa PBMC). </li><li> EMN pode agora ser utilizado para a electroporação (Nucleofection) ou criopreservados para utilização futura. </li></ol>título &quot;&gt; 2 Preparação. das Células T para Electroporation no dia 0 <ol><li> Se usar MNC criopreservado, rapidamente descongelar células suficientes para uma escala total de electroporação (2 x 10 8 a adição ~ 20% para levar em conta a perda de células durante a centrifugação e 2 horas de incubação) em banho de água a 37 ° C. Se estiver usando o recém isolado MNC avançar para o passo 2.3. </li><li> Gentilmente re-suspender as células e transferir para um tubo de centrifugação de tamanho adequado (s) pré-aquecida continha completa Fenol livre de cultura meio RPMI (PF-RPMI) e centrifugar a 200 xg durante 10 min (no freio), sobrenadante aspirado. </li><li> Re-suspender o MNC no PF-RPMI, realizar uma contagem de células (Cellometer) e transferir as células para um recipiente de tamanho adequado das células de cultura (s) a uma concentração de 10 6 células / ml. </li><li> Incubar em 37 humidificada ° C / 5% CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Transferir o MNC para tubo de centrífuga estéril (s), rotação a 200 xg durante 5 min (sem travões), aspirar o sobrenadante e r suavementee-suspender e combinar o sedimento de células (s) em meio RPMI-PF. </li><li> Realizar uma contagem de células (Cellometer) e calcular o volume de suspensão de células necessária (2 x 10 8 MNC). </li><li> Transferir o volume calculado para um tubo de centrifugação estéril de 50 mL e centrifugação a 200 xg durante 10 min (sem travagem). </li><li> Aspirar o sobrenadante para que nenhuma mídia residuais continua e suavemente volte a suspender tocando lateral do tubo. </li></ol> 3. Eletroporação (Nucleofection) de MNC (Processo de escala completa 10 Usando Cuvetes) no Dia 0 <ol><li> Pré-incubar uma placa de 12 poços estéreis com 10 poços, contendo 4 ml de RPMI morno PF-37 em uma humidificado ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Preparar e pré-aquecer a Lonza Solução Nucleofector kit de células T humanas (reconstituído por instruções do fabricante, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente em um gabinete de Biossegurança (BSC). </li><li> Prepare a solução Nucleofector / master mix DNA por adding ul 100 de completada solução Nucleofector, 15 ug de transposão (superenrolado DNA plasmídeo designado como CD19RCD28/pSBSO) e 5 ug de transposase (superenrolado DNA do plasmídeo designado por pCMV-SB11) por reacção / cuvete. </li><li> Dispersa-se o sedimento de células (do passo 2.8) batendo suavemente na parte lateral do tubo de centrifugação e re-suspensão em solução Nucleofection master mix / DNA (concentração celular final: 2 x 10 7 células/100 uL). </li><li> Transferir cuidadosamente 100 ul da suspensão de células (do passo 3.4) para cada um de dez (10) cuvettes Nucleofection Lonza, tendo cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Toque a cuvete uma vez, e utilizando o programa electroporate U-014 (para as células T não estimuladas). </li><li> Transferir as cuvetes e a placa de 12 poços (Passo 3.1), para o BSC. </li><li> Colher as células electroporadas a partir de cada cuvete, usando uma pipeta de transferência Amaxa ponta fina, por adição de ~ 500 uL de meio de cultura pré-aquecido a partir do correspondente poço (placa de 12 poços preparadas em Step 3,1) e voltar a placa a 37 ° C humidificado / 5% de CO 2 incubadora durante 2 horas ± 30 minutos. </li><li> Seguindo a incubação de 2 horas da colheita, e transferir as células de todas as cavidades de um tubo de centrífuga estéril. </li><li> Lave as células por centrifugação a 140 xg durante 8 minutos, a temperatura ambiente, sem travão, aspirar e desprezar o sobrenadante, de modo que nenhum meio residual cobre o pellet celular. </li><li> Dispersa-se o pellet celular batendo suavemente na parte lateral do tubo da centrífuga e suavemente re-suspender em CCM para obter uma suspensão de célula única. </li><li> Realizar a contagem de células e ajuste a concentração celular a 10 6 células / ml em CCM. </li><li> Transferir a suspensão de célula para célula frasco de cultura (s) e colocados no incubador durante a noite. </li><li> Passos do processo 2,1-3,8 foram repetidas para o controle: EGFP transfectadas células (5 x 10 6 células / cuvete com 5 ug Amaxa controle EGFP plasmídeo super-enrolado, pmaxGFP). </li></ol> º dia de 1 de 1 e SubsequenteCiclos de estimulação 4. Análise de Expressão CAR por citometria de fluxo no 1 º dia <ol><li> Colher as células electroporadas e realizar uma contagem de células utilizando Trypan método de exclusão de azul (hemocitômetro). </li><li> Células de manchas (1-2 x 10 6) com o anticorpo específico para CD3, CD4, CD8, e de IgG humana Fcy (como uma medida da expressão CAR). </li><li> Adquirir células em FACS Calibur e analisar os dados utilizando software FCS Express para calcular a expressão do CAR. <ol><li> Calcule células + carro na cultura pela fórmula: (N º de Total de células viáveis) x (CAR% + células) = Número de carro + células </li></ol></li></ol> 5. Preparação de AAPC (clone # 4) no Dia 1. AAPC (clone # 4) foram derivadas de células K562 (linha parental Obtido a partir de American Type Culture Collection) com Co-express T Molecule célula desejada Co-estimulação <ol><li> Descongelar uma alíquota congelada de AAPC 100 Gy irradiada em um 37 °; C banho de água. </li><li> As células são lavadas duas vezes por centrifugação a 400 xg, 10 min em CCM e contados utilizando Cellometer (exclusão Trypan azul). </li><li> Calcular o número de AAPC viável necessário para a estimulação: (Número de carro + células) x 2 = N º de AAPC irradiado exigido </li></ol> 6. AAPC mediada por estimulação do CAR + Células T no dia 1 Início do 1 º e ciclos de estimulação subseqüentes <ol><li> Misturar as células electroporadas (expressando CAR) e γ-irradiado AAPC (clone # 4) em um recipiente estéril numa proporção de 1:2 (células CAR +: AAPC viável) em CCM. <ol><li> Note-se a relação de AAPC é ajustado para a expressão de CAR baseado em citometria de fluxo no dia após a electroporação. </li></ol></li><li> Adicionar IL-21 (30 ng / ml) à suspensão de células. </li><li> Alíquota em T-75 cm 2 frasco (s) e / ou bolsas de Vida Vue cultura a uma concentração de 10 6 células / ml, e retornar para o incubatou. </li></ol> Dias 3, 5 7. Continuação de Cultura CAR + Células T <ol><li> Realizar uma mudança de meio media, reabastecer IL-21, e manter as células T a uma concentração de 10 6 células / ml. </li></ol> Dia 7 8. Fim do ciclo de estimulação Primeiro AAPC mediada <ol><li> Células colheita, contar e mancha para CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e vá para a etapa 10.1. </li></ol> 9. Depleção de células CD56 + (geralmente entre 7 e 14 dias após a electroporação) <ol><li> Executar uma depleção de CD56 usando esferas paramagnéticas se CD56 + CD3 linfócitos neg ≥ 10%. </li></ol> Ciclos de estimulação # 2, # 3, # 4 e correspondente aos dias 8 → 14, Dias 15 → 21, e dias 22 → 28 10. Adição recursiva da AAPC para propagar as células T a números Clinicamente-suficientes <ol><li> Repita o stimulation processo (4 vezes), tal como descrito nos passos 4,3-8,1. </li><li> Adicionar IL-2 (50U/ml) para as culturas que começam nos dias 7, 14 e 21, e em seguida, em cada mudança de mídia (três vezes por semana, em um horário de segunda a quarta-feira e sexta-feira). </li><li> Criopreservar (arquivo) excesso de células T, conforme necessário. <ol><li> As células T congeladas usando congelador taxa controlada. </li></ol></li></ol> Dia 28 11. Fim do ciclo de estimulação Última AAPC mediada: Células T Colheita <ol><li> Criopreservar células T para testes de libertação e de infusão. </li></ol>

<ol><li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li>
<li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li>
<li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs+on+track+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li>
<li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies%3A+victories+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li>
<li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li>
<li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposition%3A+biology+and+applications+for+molecular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li>
<li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li>
<li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li>
<li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li>
<li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li>
<li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs%3A+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci.+%28Schol.+Ed%29%22%5BJournal%5D)">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li>
<li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li>
<li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li>
<li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li>
<li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19%2B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li>
<li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li>
<li>Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li>
<li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li>
<li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Transposon e sistemas de transposase, tais como a partir de 12,19 piggyBac e SB 18,20-22, são não-virais abordagens para a terapia genética, que são uma alternativa aos viral mediada por transdução do CAR grau clínico + células T. O SB foi escolhido como o sistema de transferência de genes com base no seu potencial para a terapia de gene humano 1,6,23. Nós desenvolvemos as tecnologias duais de SB transposição (para introduzir um CAR) e adição de γ recursiva irradiado AAPC (para recuperar as células T geneticamente modificadas que expressam estavelmente um CAR) para servir como plataforma de tecnologias para o fabrico de células T específicas para TAA em conformidade com cGMP para a Fase I / II de ensaios (Figura 4). Após 28 dias (quatro ciclos de 7 dias de estimulação) de co-cultura sobre γ-irradiado AAPC, que são tipicamente capazes de produzir, pelo menos, ~ 10 10 geneticamente modificados células T adequado para aplicações em seres humanos. Conforme necessário, ciclos de estimulação adicional pode ser realizada to gerar grandes números de células T geneticamente modificadas. Além disso, se as células menos CAR + T são necessários, a aproximação a electroporação e propagação pode ser reduzida para menos empregando cuvetes e levar adiante, apenas um conjunto de sub-das células T expandidas numericamente para ciclos subsequentes de proliferação de AAPC, no início de cada ciclo de estimulação. A maioria da electroporação e propagadas as células T colhidas para perfusão estavelmente expressam o CAR. A conseqüência de células CD4 + e CD8 + T que expressam nossa CAR 2 ª geração incluem as células com um fenótipo de memória / ingênuo e apresentam três características de re-direcionado especificidade. Em primeiro lugar, as células geneticamente modificadas especificamente T lisam alvos CD19 +, por outro lado, produzem IFN-γ em resposta a células CD19 + do estimulador e, em terceiro lugar, se proliferam em resposta a CD19 + células alimentadoras, todos de uma maneira dependente da CAR 13,18. Nossa abordagem para integrcomeu um transgene CAR por eletro-transferência de plasmídeos não-virais de DNA a partir do sistema SB pode ser realizado em repouso células T primárias derivadas de PB e UCB. Nós e outros autores geneticamente modificado células K562 para servir como AAPC para propagar eficientemente números clinicamente suficiente de células T para infusão de 24,25. A AAPC e ambiente de cultura de tecidos (por exemplo, a adição de IL-21) foram foram modificadas para gerar paciente e doador-derivado de células CD19-T específicas para a infusão após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (Tabela 1) 13,18. Nós podemos produzir CAR + células T de PB simplesmente obtidas por punção venosa que evita o custo, desconforto e inconveniência de se obter a partir de PB MNC por aférese. A capacidade de derivar um grande número de células T + CAR de pequenos números de MNC é particularmente atraente para a infusão de células T após transplante alogénico da UCB. O pequeno tamanho e anonimato do doador neonatal impede re-Aceder a este indivíduo em um ponto de tempo mais tarde, e apenas um número limitado de colheita MNC estão disponíveis como material de partida para a fabricação de células T para evitar interferir com a hematopoiese. Outros avanços para o processo de fabricação estão em andamento para incluir um dispositivo de electroporação elevado rendimento acoplado com um biorreactor WAVE totalmente fechada para minimizar a manipulação. No agregado, o SB e AAPC plataformas são atraentes para gerar CD19 específico CAR + células T que podem ser adaptados para gerar grandes números de células T geneticamente modificadas que podem reconhecer alternativas da superfície celular TAAs em conformidade com cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> DNA expressando GFP plasmídeo (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol livre de RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 humana recombinante </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 recombinante humano (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de células T humanas (Solução Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS Reagente CD56 </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> Conjugado com FITC para rato mAb específico para CD3 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-conjugado com o mAb de rato específico para CD4 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 conjugadopara rato mAb específico para CD8 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugados com F (ab &#39;) 2 de fragmento de anticorpo de cabra específico para o humano Fcy </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Descartáveis </td></tr><tr><td> Placa de 12 poços </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 balão </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Sacos de Cultura </td><td> Vue Vida </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 tubo de centrífuga ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Equipamentos </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom Bioscience </td><td> Visão Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend Centrífuga RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Congelador taxa controlada </td><td> Cunha </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> CIS bio Internacional </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expressão de moléculas (endógena e Introduzido) </td></tr><tr><td> Linha Celular </td> &lt;Nome&gt; td comum </td><td> Tipo de célula </td><td> Moléculas expressas </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresso com a membrana ligada a IL-15 </td></tr></tbody></table> Meios de cultura completos (CCM) (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS a 10% 1% GlutaMAX Tampão de Citometria de Fluxo (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) PBS FBS 2% 0,1% Azida de sódio </td></tr></tbody></table>

aplicação clínica de<em&gt; a bela adormecida</em&gt; artificial e antigen presenting cells para modificar geneticamente células t de sangue do cordão umbilical e periférica

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

A potência das células de grau clínico T pode ser melhorado através da combinação de terapia de genes com a imunoterapia de engendrar um produto biológico, com o potencial de reconhecimento (i) superior de antigénios associados a tumores (TAAs), (ii) após a infusão de persistência, (iii) potencial de migração para o local do tumor, e (iv) a capacidade de reciclar as funções efectoras dentro do microambiente do tumor. A maioria das abordagens para a manipulação genética de células T modificadas para aplicação em seres humanos usaram lentivírus dos retrovírus e para a expressão estável de CAR 1-3. Esta abordagem, apesar de compatível com Boas Práticas de Fabricação (BPF), pode ser caro, uma vez que conta com a produção e liberação de clínica-grade vírus recombinante a partir de um número limitado de unidades de produção. A transferência de plasmídeos electro-não-virais é uma alternativa atraente para a transdução de ADN uma vez que as espécies podem ser produzidos ao grau clínico em cerca de 1/10 de o custo de recombinformiga vírus GMP-grade. Para melhorar a eficiência da integração nos adaptamos Bela Adormecida (SB) transposon e transposase para aplicação humana 4-8. O nosso sistema SB utiliza dois plasmídeos de ADN, que consistem de um transposão que codifica para um gene de interesse (por exemplo, 2 ª geração CD19 específico transgene CAR, designado CD19RCD28) e uma transposase (por exemplo, SB11), que insere o transgene no dinucleótido TA repete 9-11 . Para gerar números suficientes de clinicamente geneticamente modificados células T que usamos K562 células derivadas de antigénios artificiais que apresentam (AAPC) (clone # 4) modificados para expressar um TAA (por exemplo, CD19), assim como as moléculas de co-estimulação de células T CD86, CD137L, uma ligada à membrana versão de interleucina (IL) -15 (péptido fundido a modificação região Fc de IgG4) e CD64 (Fc-receptor γ 1) para o carregamento de anticorpos monoclonais (mAb) 12. Neste relatório, demonstrar os procedimentos que podem ser realizados em compliance com cGMP para gerar CD19 específico CAR + células T adequadas para aplicação em seres humanos. Isto foi conseguido através da electro-transferência síncrona de dois plasmídeos de ADN, de um transposão SB (CD19RCD28) e uma transposase SB (SB11) seguido por recuperação de integrantes estáveis ​​pelas adições cada-7-dia (ciclo de estimulação) de γ-irradiado AAPC (clone # 4), na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 13. Tipicamente quatro ciclos (28 dias de cultura contínua) são realizadas para gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam estavelmente o CAR. Esta metodologia de fabrico de grau clínico de células T específicas para CD19 pode ser aplicada a células T derivadas do sangue periférico (PB) ou sangue de cordão umbilical (UCB). Além disso, esta abordagem pode ser aproveitado para gerar células T para diversos tipos de tumores, emparelhando a especificidade do CAR introduzida com a expressão do TAA, reconhecido pela CAR, na AAPC.

Relatamos que a transferência de electro-de cosmídeos e propagação de células T em γ-irradiado AAPC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas de PB e UCB para aplicações em seres humanos. Estas células T geneticamente modificadas de expressar uma CAR introduzida que reconhece o CD19 TAA, independente do complexo de histocompatibilidade principal. Os plasmídeos derivados de SB DNA para expressar o transposão (i), uma 2 ª geração CAR (CD19RCD28) que os sinais por meio de CD28 e CD3 ε-14, e (ii) transposase, SB11 15, foram descritos anteriormente 13, 16,17 . Os plasmídeos utilizados no presente estudo foram produzidas comercialmente por Waisman unidade de biomanufatura clínica (Madison, WI). A AAPC (clone # 4), derivada de células K562 (linha parental obtida American Type Culture Collection), co-express de células T desejados moléculas co-estimuladoras (cada molécula introduzida em 3 a 90% na superfície das células de AAPC),como previamente descrito 12. Aqui, mostramos que as células T específicas para CD19 podem ser gerados a partir de células mononucleares (MNC) a partir de derivados PB ou SB UCB utilizando transposição para introduzir o CAR, seguido pela adição de AAPC para numericamente expandir as células T de uma forma dependente do CAR (Figuras 1 , 4) 13,18. Dez cuvetes (2x10 7 MNC / cuvete) são electroporados para cada destinatário, utilizando 15 ug de ADN do plasmídeo (CD19RCD28/pSBSO) que codifica para a transposão (CAR) e 5 ug de ADN do plasmídeo (pCMV-SB11) que codifica para a transposase (SB11). O número de cubetas pode ser reduzido se MNC estão limitando ou reduzidas para o trabalho de laboratório. O dia da electroporação é definido como &quot;0 Dia&quot; ciclo de estimulação # 1. Como controles para a citometria de fluxo e as condições de cultura, as células T autólogas são electroporated simulado (sem ADN de plasmídeo) e numericamente expandido em γ-irradiado AAPC (clone # 4) que tinha sido pré-carregada com OKT3 para atravessar link-CD3 das células T para sustentar proliferação. Nós routinely avaliar a eficiência de electrotransferência e viabilidade das células T no dia após a electroporação (Figura 2B). A expressão de GFP de controlo de ADN de plasmídeo (designado pmaxGFP) e CAR, neste ponto de tempo inicial reflicta a expressão da proteína a partir do plasmídeo integrado e epissomal. Normalmente, o dia após a eletroporação medimos expressão EGFP em ~ expressão 60% e CARRO em ~ 40% (Figura 2) com T viabilidade celular entre 40-50%. Adições recursivas de γ-irradiado AAPC, na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 recuperar as células T que expressam estavelmente CARRO (CD19RCD28). CD3 neg células CD56 + NK estão esgotados a partir da cultura usando esferas paramagnéticas CD56-específicos, se a percentagem das células NK é ≥ 10% e, especialmente, se a percentagem de CAR expressado nas células T é baixa. Isto impede que o esgotamento rápido crescimento excessivo das células NK, que interfere com a capacidade de sustentar a AAPC proliferation da CAR + células T. Em certas ocasiões, a depleção de células NK de CAR + células T é realizada durante os últimos dois ciclos de estimulação, mas introduz-se uma perda de células desejadas devido a co-expressão de CD56 em alguns CAR + células T. As células T foram cultivadas em um sistema funcionalmente fechado usando sacos de cultura Vue Vida passado dia 14. Um subconjunto de células geneticamente modificadas e propagadas T são tipicamente criopreservadas no Dia 14 ou Dia 21 (fim dos ciclos de estimulação # 2 ou # 3) de co-cultura em AAPC para servir como uma fonte de material de arquivo para análises futuras e ser descongelado, se problemas imprevistos posteriormente ocorrer durante o processo de fabricação. As células T são tipicamente colhidas em ou cerca do dia 28 de cultura (Figura 3) que expressam rotineiramente&gt; CAR de 90% e são&gt; 80% de viabilidade (Figura 2C e D). Nós já haviam demonstrado que, após quatro semanas de co-cultura sobre AAPC a média de expansão vezes maior de células T CD3 + é 19.800 ± 11.313 com CA<html> R expressão + sendo 90% ± 7,5 13. Estas células T são criopreservadas e sofrer em processo e testes de liberação que informa sobre a segurança e potencial terapêutico do produto fabricado. Testes de liberação é realizada em conformidade com as alterações laboratoriais clínicos de melhora (CLIA) para gerar um certificado de análise antes da infusão para destinatários em ensaios clínicos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passos delineando o processo de electroporate e propagar CAR + células T de PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Caracterização das células T geneticamente modificadas de PB. (A) A expressão de GFP no Dia 0 do ciclo de estimulação primeiro a avaliar a eficiência da transferência de genes. A expressão de CD19-specific CARRO (CD19RCD28), tal como avaliado por citometria de fluxo em células CD3 +, CD8 + e células T CD4 + em (B), aproximadamente, 24 horas após a electroporação e (C) 28 dias após a co-cultura em AAPC. Expressão semelhante da CAR foi observado com as células T derivadas de SCU. (D) Cinética de expressão CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagação da PB-derived CAR+ T células Rate. De expansão numérica de células CD3 + e + CAR células T derivadas de PB repetido por co-cultura em γ-irradiada na presença de AAPC solúvel recombinante humano IL-2 e IL-21. Setas ascendentes indicam as adições de γ-irradiado AAPC que marcam o início de cada ciclo de estimulação. Células UCB derivado carro + T apresentam taxas semelhantes de expansão numérica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Esquemática do processo de fabricação usando SB e sistemas AAPC modificar geneticamente e propagar CAR + células T derivadas de PB e UCB. CD19 específico CAR + células T foram geradas pela transferência de electro-SB-derivados plasmídeos de ADN super-enrolado e subsequente co-cultura em K562-derived AAPC (clone # 4), na presença of IL-2 humana recombinante solúvel e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> A origem das células T </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> Infusão de células T </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> # IND </td></tr><tr><td> Autólogo (paciente derivado) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Depois de transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Alogênico (doador-derivada) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Após o transplante alogênico de sangue de cordão umbilical </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabela 1. Os ensaios clínicos, sob os auspícios da FDA em MDACC para infundir CD19 específico CAR células T + propagado em AAPC. As células T são prestados específico para CD19 através da expressão forçada de SB transposon codifica para uma CAR 2 ª geração, CD19RCD28 designado, que os sinais através de CD28 e CD3-ε. ** Teste descrito na referência 5.

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Este protocolo modifica geneticamente as células T para introduzir receptores de antígenos quiméricos específicos para antígenos tumorais e, em seguida, propaga números clinicamente significativos em células apresentadoras de antígenos artificiais projetadas. Comece com a eletrotransferência da bela adormecida. Transpor e transpor plasmídeos de DNA A em células mononucleares quiescentes isoladas do sangue do cordão umbilical ou periférico.Em seguida, meça a eficiência da transfecção usando citometria de fluxo. Em seguida, a co-cultura, as células T transfectadas durante sete dias em K 5 62 derivaram antígenos artificiais apresentando células com a adição de citocinas exógenas em estimulação de quatro semanas. Os ciclos de proliferação prosseguem para analisar a criopreservação e liberar as células T positivas para carro eletroporadas e propagadas para aplicação humana.A bela adormecida transpõe no sistema de transposição oferece uma alternativa às abordagens de transferência de genes baseadas em vírus para a introdução estável de um gene na célula de sua escolha. Uma das principais vantagens do sistema da bela adormecida é que se pode integrar genes a um custo realmente reduzido em comparação com os plasmídeos de DNA que se integram por meio de recombinação ilegítima e não homóloga. Assim, a vantagem é que o sistema da bela adormecida pode ser usado para expressar um gene com baixo custo e alta eficiência.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão inicialmente que superar a eficiência das células T elétricas na propagação seletiva de células T positivas para o carro em células apresentadoras de antígenos artificiais. Ambas as etapas são difíceis de dominar devido à necessidade de co-cultura. Células T geneticamente modificadas em células apresentadoras de antígenos artificiais.Este método é útil no campo da imunoterapia adotiva, particularmente na entrega efetiva de genes e no fabricante de um número clinicamente significativo de células T. A aplicação mais ampla se estende à terapia do câncer porque as células T do sistema imunológico podem ser modificadas para serem específicas do tumor. Demonstrando o procedimento estarão Margaret Dawson e Matthew Fiola.Técnicos do meu laboratório Primeiro dilua o sangue periférico com um volume igual de P-B-S-E-D-T-A e o sangue do cordão umbilical com quatro volumes de P-B-S-E-D-T-A coloque lentamente 25 mililitros de sangue diluído em 12 mililitros de fial em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar o gradiente de fial a 400 Gs durante 30 a 40 minutos sem interrupção. Agora transfira a fração de células mononucleares para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros com P-B-S-E-D-T-A.Aumente o volume para 50 mililitros e colha as células por centrifugação. Lave suavemente as células uma vez em 50 mililitros de cultura completa, meio e centrifugue a 400 Gs por 10 minutos. Em seguida, agrupe os pellets de células no CCM para realizar uma contagem de células.Usando o método de exclusão triam blue. As células mononucleares agora podem ser usadas para eletroporação ou criopreservadas para uso futuro. Se estiver usando MNC criopreservado, descongele rapidamente duas vezes 10 elevado às oitavas células para uma eletroporação em escala real, transfira suavemente as células para um tubo de centrífuga de tamanho apropriado contendo pré-aquecimento.Meios de cultura RPMI livres de fenol completos e peletizar as células por centrifugação, ressuspender as células mononucleares Em P-F-R-P-M-I realizar uma contagem de células e transferir as células para um recipiente de cultura de células de tamanho apropriado a uma concentração de 10 das seis células por mililitro. Equilibre as células em uma incubadora umidificada por duas horas. Colha o MNC por centrifugação, depois ressuspenda suavemente e combine os pellets de células em P-F-R-P-M-I e enumere as células Agora transfira duas vezes 10 para o oitavo MNC para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros e centrifugue a 200 Gs por 10 minutos sem pausas.Aspirar o sobrenadante de modo a que não fique nenhum meio residual à volta do sedimento celular. Prepare uma placa estéril de 12 poços com 10 poços contendo quatro mililitros de P-F-R-P-M-I quente e equilibre a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, reconstitua a solução efetora Lonzo Nucleo do kit de células T humanas de acordo com as instruções do fabricante para cada reação.Q Vet prepara 100 microlitros de master mix de DNA contendo solução efetora nuclear NU suplementada. 15 microgramas do plasmídeo transposto no plasmídeo e cinco microgramas do plasmídeo transposto. Em seguida, disperse o pellet de células T e ressuspenda uma mistura mestra de DNA de solução de afecção nuclear NU a uma concentração final de células duas vezes 10 das sétimas células por 100 microlitros.Transfira cuidadosamente 100 microlitros da suspensão celular para cada uma das 10 cubetas de afeto lonza nucleo, tomando cuidado para evitar bolhas. Agora toque no qve uma vez e eletro usando o programa U 0 1 4 para células T não estimuladas. Transfira as cubetas e a placa de 12 poços Equilibrating para a capela de cultura usando uma pipeta de transferência de ponta fina amox a 500 microlitros do meio de cultura pré-aquecido do poço correspondente para cada vete.Transfira as células eletroporadas para a placa e permita que as células se recuperem na incubadora de cultura de células por duas horas. Em seguida, transfira as células de todos os poços para um tubo de centrífuga estéril e pelete as células após uma lavagem, disperse o pellet celular suavemente e ressus-suspenda em CCM para obter uma suspensão de célula única. Depois de realizar uma contagem de células, ajuste a concentração de células para tender a seis células por mililitro na CCM.Em seguida, transfira a suspensão celular para um frasco de cultura e coloque na incubadora durante a noite para gerar células transfectadas com EGFP. Repita o protocolo de eletroporação usando cinco vezes 10 das seis células por vete com cinco microgramas de plasmídeo EGFP de controle amox. Colha as células eletroporosas e, em seguida, faça uma contagem de células usando o método de exclusão trien blue.Em seguida, comine uma a duas vezes 10 das seis células com anticorpo específico para CD três, CD quatro, CD oito e IgG FC gama humana como uma medida da expressão do carro. Adquira as células no calibre do fax. Analise os dados usando o software FCS express para determinar a expressão do carro.Em seguida, calcule as células positivas do carro em cultura. O clone A PC número quatro derivaria de células K 5 62 para co-expressar moléculas co-estimulatórias de células T desejadas Descongelar uma alíquota de congelado irradiado, A A PC em um banho-maria de 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células e o CCM, enumere as células viáveis por exclusão de trip blue e calcule o número de um PC viável necessário para a estimulação.Misturar as células electroporadas que exprimem o CAR e a gama irradiada A A PC num recipiente estéril na proporção de um para dois. Ajustar a relação A PC para a expressão de CAR com base na citometria de fluxo no dia seguinte à electroporação: Adicionar 30 nanogramas por mililitro de IL 21 à suspensão celular. Em seguida, Eloqua cuidou das seis células por mililitro em frascos T 75 ou viu sacos de cultura de vida e retornou à incubadora de cultura, a transferência elétrica de plasmídeos de DNA e a propagação de células T em gama.Um PC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas do sangue periférico e do sangue do cordão umbilical para aplicações humanas. Nesta caracterização de células T geneticamente modificadas a partir da expressão sanguínea periférica de EGFP no dia zero do primeiro ciclo de estimulação, os controles para a eficiência da expressão de transferência gênica de CD 19 específico car são avaliados por citometria de fluxo em células T CD três positivas, CD oito positivas e CD quatro positivas em aproximadamente 24 horas após a eletroporação. E então, 28 dias após a co-cultura em A A cinética de PC da expressão de carros em células T cultivadas em um sistema funcionalmente fechado.A propagação de células T positivas para carros derivadas do sangue periférico ao longo do tempo pode gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam o carro de forma estável. Após quatro semanas de co-cultura em AA PC, a expansão média da dobra de três células T positivas para CD é de cerca de 19.800 com 90% de expressão de carro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como eleger o desfile e propagar células T que expressam um carro desejado.Lembre-se de monitorar o crescimento excessivo de células NK. A eletroporação e propagação de células T é normalmente realizada em quatro ciclos de estimulação de sete dias. Outras investigações, como liberação de citocinas e ensaios de citotoxicidade, podem ser realizadas para avaliar a especificidade redirecionada das células T geneticamente modificadas no campo da imunoterapia adotiva.Essa técnica nos ajuda a entender o potencial terapêutico das células T que são infundidas em humanos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Aprenda a modificar geneticamente células T usando o sistema Sleeping Beauty para expressar CARs específicos de CD19. Este método utiliza eletrotransferência de plasmídeos e co-cultura com células artificiais apresentadoras de antígenos para imunoterapia de câncer.

Aplicação Clínica de A Bela Adormecida Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicação Clínica de

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