Aplicação Clínica de

Este protocolo modifica geneticamente as células T para introduzir receptores de antígenos quiméricos específicos para antígenos tumorais e, em seguida, propaga números clinicamente significativos em células apresentadoras de antígenos artificiais projetadas. Comece com a eletrotransferência da bela adormecida. Transpor e transpor plasmídeos de DNA A em células mononucleares quiescentes isoladas do sangue do cordão umbilical ou periférico

Em seguida, meça a eficiência da transfecção usando citometria de fluxo. Em seguida, a co-cultura, as células T transfectadas durante sete dias em K 5 62 derivaram antígenos artificiais apresentando células com a adição de citocinas exógenas em estimulação de quatro semanas. Os ciclos de proliferação prosseguem para analisar a criopreservação e liberar as células T positivas para carro eletroporadas e propagadas para aplicação humana.

A bela adormecida transpõe no sistema de transposição oferece uma alternativa às abordagens de transferência de genes baseadas em vírus para a introdução estável de um gene na célula de sua escolha. Uma das principais vantagens do sistema da bela adormecida é que se pode integrar genes a um custo realmente reduzido em comparação com os plasmídeos de DNA que se integram por meio de recombinação ilegítima e não homóloga. Assim, a vantagem é que o sistema da bela adormecida pode ser usado para expressar um gene com baixo custo e alta eficiência.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão inicialmente que superar a eficiência das células T elétricas na propagação seletiva de células T positivas para o carro em células apresentadoras de antígenos artificiais. Ambas as etapas são difíceis de dominar devido à necessidade de co-cultura. Células T geneticamente modificadas em células apresentadoras de antígenos artificiais.

Este método é útil no campo da imunoterapia adotiva, particularmente na entrega efetiva de genes e no fabricante de um número clinicamente significativo de células T. A aplicação mais ampla se estende à terapia do câncer porque as células T do sistema imunológico podem ser modificadas para serem específicas do tumor. Demonstrando o procedimento estarão Margaret Dawson e Matthew Fiola.

Técnicos do meu laboratório Primeiro dilua o sangue periférico com um volume igual de P-B-S-E-D-T-A e o sangue do cordão umbilical com quatro volumes de P-B-S-E-D-T-A coloque lentamente 25 mililitros de sangue diluído em 12 mililitros de fial em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar o gradiente de fial a 400 Gs durante 30 a 40 minutos sem interrupção. Agora transfira a fração de células mononucleares para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros com P-B-S-E-D-T-A.

Aumente o volume para 50 mililitros e colha as células por centrifugação. Lave suavemente as células uma vez em 50 mililitros de cultura completa, meio e centrifugue a 400 Gs por 10 minutos. Em seguida, agrupe os pellets de células no CCM para realizar uma contagem de células.

Usando o método de exclusão triam blue. As células mononucleares agora podem ser usadas para eletroporação ou criopreservadas para uso futuro. Se estiver usando MNC criopreservado, descongele rapidamente duas vezes 10 elevado às oitavas células para uma eletroporação em escala real, transfira suavemente as células para um tubo de centrífuga de tamanho apropriado contendo pré-aquecimento.

Meios de cultura RPMI livres de fenol completos e peletizar as células por centrifugação, ressuspender as células mononucleares Em P-F-R-P-M-I realizar uma contagem de células e transferir as células para um recipiente de cultura de células de tamanho apropriado a uma concentração de 10 das seis células por mililitro. Equilibre as células em uma incubadora umidificada por duas horas. Colha o MNC por centrifugação, depois ressuspenda suavemente e combine os pellets de células em P-F-R-P-M-I e enumere as células Agora transfira duas vezes 10 para o oitavo MNC para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros e centrifugue a 200 Gs por 10 minutos sem pausas.

Aspirar o sobrenadante de modo a que não fique nenhum meio residual à volta do sedimento celular. Prepare uma placa estéril de 12 poços com 10 poços contendo quatro mililitros de P-F-R-P-M-I quente e equilibre a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, reconstitua a solução efetora Lonzo Nucleo do kit de células T humanas de acordo com as instruções do fabricante para cada reação.

Q Vet prepara 100 microlitros de master mix de DNA contendo solução efetora nuclear NU suplementada. 15 microgramas do plasmídeo transposto no plasmídeo e cinco microgramas do plasmídeo transposto. Em seguida, disperse o pellet de células T e ressuspenda uma mistura mestra de DNA de solução de afecção nuclear NU a uma concentração final de células duas vezes 10 das sétimas células por 100 microlitros.

Transfira cuidadosamente 100 microlitros da suspensão celular para cada uma das 10 cubetas de afeto lonza nucleo, tomando cuidado para evitar bolhas. Agora toque no qve uma vez e eletro usando o programa U 0 1 4 para células T não estimuladas. Transfira as cubetas e a placa de 12 poços Equilibrating para a capela de cultura usando uma pipeta de transferência de ponta fina amox a 500 microlitros do meio de cultura pré-aquecido do poço correspondente para cada vete.

Transfira as células eletroporadas para a placa e permita que as células se recuperem na incubadora de cultura de células por duas horas. Em seguida, transfira as células de todos os poços para um tubo de centrífuga estéril e pelete as células após uma lavagem, disperse o pellet celular suavemente e ressus-suspenda em CCM para obter uma suspensão de célula única. Depois de realizar uma contagem de células, ajuste a concentração de células para tender a seis células por mililitro na CCM.

Em seguida, transfira a suspensão celular para um frasco de cultura e coloque na incubadora durante a noite para gerar células transfectadas com EGFP. Repita o protocolo de eletroporação usando cinco vezes 10 das seis células por vete com cinco microgramas de plasmídeo EGFP de controle amox. Colha as células eletroporosas e, em seguida, faça uma contagem de células usando o método de exclusão trien blue.

Em seguida, comine uma a duas vezes 10 das seis células com anticorpo específico para CD três, CD quatro, CD oito e IgG FC gama humana como uma medida da expressão do carro. Adquira as células no calibre do fax. Analise os dados usando o software FCS express para determinar a expressão do carro.

Em seguida, calcule as células positivas do carro em cultura. O clone A PC número quatro derivaria de células K 5 62 para co-expressar moléculas co-estimulatórias de células T desejadas Descongelar uma alíquota de congelado irradiado, A A PC em um banho-maria de 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células e o CCM, enumere as células viáveis por exclusão de trip blue e calcule o número de um PC viável necessário para a estimulação.

Misturar as células electroporadas que exprimem o CAR e a gama irradiada A A PC num recipiente estéril na proporção de um para dois. Ajustar a relação A PC para a expressão de CAR com base na citometria de fluxo no dia seguinte à electroporação: Adicionar 30 nanogramas por mililitro de IL 21 à suspensão celular. Em seguida, Eloqua cuidou das seis células por mililitro em frascos T 75 ou viu sacos de cultura de vida e retornou à incubadora de cultura, a transferência elétrica de plasmídeos de DNA e a propagação de células T em gama.

Um PC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas do sangue periférico e do sangue do cordão umbilical para aplicações humanas. Nesta caracterização de células T geneticamente modificadas a partir da expressão sanguínea periférica de EGFP no dia zero do primeiro ciclo de estimulação, os controles para a eficiência da expressão de transferência gênica de CD 19 específico car são avaliados por citometria de fluxo em células T CD três positivas, CD oito positivas e CD quatro positivas em aproximadamente 24 horas após a eletroporação. E então, 28 dias após a co-cultura em A A cinética de PC da expressão de carros em células T cultivadas em um sistema funcionalmente fechado.

A propagação de células T positivas para carros derivadas do sangue periférico ao longo do tempo pode gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam o carro de forma estável. Após quatro semanas de co-cultura em AA PC, a expansão média da dobra de três células T positivas para CD é de cerca de 19.800 com 90% de expressão de carro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como eleger o desfile e propagar células T que expressam um carro desejado.

Lembre-se de monitorar o crescimento excessivo de células NK. A eletroporação e propagação de células T é normalmente realizada em quatro ciclos de estimulação de sete dias. Outras investigações, como liberação de citocinas e ensaios de citotoxicidade, podem ser realizadas para avaliar a especificidade redirecionada das células T geneticamente modificadas no campo da imunoterapia adotiva.

Essa técnica nos ajuda a entender o potencial terapêutico das células T que são infundidas em humanos.