Name: Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a preparar células dendríticas de grau clínico para imunoterapia tumoral usando monócitos autólogos diferenciados com GM-CSF e IL-4. Este método permite gerar grandes quantidades de células maduras para injeção em pacientes.

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Os autores gostariam de agradecer Andres Salazar (Oncovir, Inc.) para o dom do Poly-ICLC.

1. O isolamento e a criopreservação de PBMCs 4 <ol><li> Assepticamente espiga de uma das portas de acesso na bolsa leucaferese utilizando um conjunto de transferência de plasma. Usando uma seringa de 60 ml, a transferência da leucaferese obtidos de pacientes em um frasco de 500 ml estéril. </li><li> Ajustar o volume da leucaferese para 2x o seu volume original usando RPMI temperatura ambiente. Misture bem. </li><li> Misture delicadamente a garrafa de Ficoll-Paque PLUS. Adicionar 12 ml de Ficoll-Paque Plus em tubo de 50 ml estéril. </li><li> Suavemente camada de 30 ml do produto de leucaferese diluído a cada tubo de 50 ml estéril contendo Ficoll. Ter cuidado para não perturbar a interface entre o Ficoll e suspensão de células. </li><li> Repita os passos 1.3 e 1.4 até que toda a leucaferese foram mergulhados. </li><li> Centrifugar os tubos cónicos de 50 ml a 1000 × g durante 20 minutos à temperatura ambiente sem travagem. </li><li> Colher cuidadosamente a camada turva de PBMCs de cada tubo e transfer para novos tubos estéreis de 50 ml. </li><li> Adicionar RPMI a cada tubo para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão. </li><li> Centrifugar as células a 500 x g durante 10 min a 4 ° C, com travão integral. </li><li> Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Voltar a suspender as pelotas de células de cada tubo e adicionar meio RPMI para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão. </li><li> Centrifugar as células a 500 x g durante 6 min a 4 ° C. </li><li> Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Ressuspender piscina e juntas as suspensões de células em um tubo de 50 ml. </li><li> Levar o volume das CMSPs reunidas até 50 ml com mais meio RPMI. Misture delicadamente por inversão. </li><li> Centrifugar as células a 300 x g durante 6 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI. Misture com cuidado para assegurar a suspensão de células uniforme. </li><li> Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis. </li><li> Centrifugar as células em 300× g durante 6 min a 4 ° C. Prepare a mídia de congelamento. Meio de congelação é constituída de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO; Miltenyi Biotec) em soro AB humano (Vale Biomedical). </li><li> Remover o sobrenadante. Ressuspender as células a uma concentração final de 2 x 10 8 células / ml em meio de congelamento frio. </li><li> Faça alíquotas de 1 ml em criotubos de 1,8 ml. </li><li> Transfira os criotubos no congelador de taxa controlada e começar a correr congelamento, Programa 1. No final da corrida, a transferência dos criotubos congelados imediatamente para a fase de vapor do congelador de azoto líquido. </li></ol> 2. Dia 0: diferenciação de células dendríticas a partir de monócitos <ol><li> Adicionar 30 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para um tubo de 50 ml estéril. </li><li> Alíquotas descongelamento de PBMCs congelados por agitação suave no banho de água 37 ° C. Quando completamente descongelado, transferir os conteúdos dos frascos com o tubo de 50 ml estéril. Misture bem. </li><li> Centrifugar as células de 6 mina 500 x g à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender as células sedimentadas num pequeno volume de RPMI / 1% de plasma autólogo. Em seguida, adicionar mais RPMI / 1% de plasma autólogo até um volume final de 50 ml. Misture bem. </li><li> Centrifugar as células mais uma vez durante 6 minutos a 500 x g à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem. </li><li> Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis. </li><li> Placa de 1,40 x 10 8 células em 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para 225 centímetros 2 EasyFlask. Repetir até que todas as células foram plaqueadas. </li><li> Incubar as EasyFlasks plana no seu lado para 1-2 horas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO2 para permitir que os monócitos aderir ao balão. </li><li> Quando a incubação estiver completa, remover o EasyFlask da incubadora e lavar duas vezes para remover as células não aderentes using 30 ml de meio RPMI pré-aquecido. </li><li> Após a segunda lavagem, adicionar 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF 5-8. Para este protocolo, nós estamos usando 400 UI / ml IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF. </li><li> Incubar as EasyFlasks durante 2 dias a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2. </li></ol> 3. Dia 2: A alimentação de células dendríticas com IL-4 e GM-CSF <ol><li> Adicionar 4 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF para cada EasyFlask. Misture agitando e balançando ao seu lado. </li><li> Incubar as EasyFlasks para mais 3 dias (até ao dia 5), a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2. </li></ol> 4. Dia 5: Colheita de células dendríticas imaturas <ol><li> Colher as culturas agitando vigorosamente os frascos e pipetando cima e para baixo para voltar a suspender as células não aderentes e pouco aderente. Transferir océlulas colhidas para novos 50 ml tubos cônicos. </li><li> Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem. </li><li> Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis. </li><li> Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Placa de 1-2 x 10 6 culas por po em 3 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400 UI / ml de IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF em placas de cultura de tecidos de 6 poços. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO 2 durante a noite. </li></ol> 5. Dia 6: Maturação e Antígeno Carregando de células dendríticas <ol><li> Adicionam-se 10 ug / ml de KLH a 1/3 dos poços das placas de cultura de 6 poços. Redemoinho as placas para misturar. KLH só é adicionada a 1/3 dos poços KLH porque é usado apenas para a primeira vacina DC. Subseqüente DC vacinas conTain apenas os péptidos de antigénios tumorais. </li><li> DCs podem ser estimuladas a amadurecer com diferentes estímulos. Os estímulos de maturação mais comum que tem sido usado em estudos clínicos, tem sido um cocktail de citocinas (IL-1 β, TNFa e IL-6) e prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Mais recentemente, a utilização de agonistas do receptor do tipo Toll (TLR) ganharam popularidade 11,12. Neste protocolo, adicionar 2 mg / ml de carboximetilcelulose em ácido poli-L-lisina-Polyinosinic Polycytidylic (Poli-ICLC) aos poços e misturar bem. Poli-ICLC é a formulação clínica grau de poli-CI que é estabilizado com poli-L-*-lisina e carboximetilcelulose (fabricado pela Oncovir, Inc.). </li><li> Adicionam-se 100 ug / ml de antigénios peptídicos longas (NY-ESO-1 e / ou Melan-A/MART-1) designados para os seus poços, cada poço recebe apenas um único péptido a evitar competição cruzada 13. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO &lt;sub&gt; 2 S / N. </li></ol> 6. Dia 7: Criopreservação de células dendríticas <ol><li> Preparar a solução de congelamento DC usando plasma autólogo e 10% DMSO. Centrifugar a solução de congelação DC a 2000 × g durante 20 min a 4 ° C para remover qualquer matéria em partículas. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml rotulados cónica. Armazenar a 4 ° C até utilização. </li><li> Quando a incubação durante a noite está terminado, a colheita e piscina todos os poços que contêm as DCs pulsadas com péptidos em tubos cónicos de 50 ml. </li><li> Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min. Remove-se os sobrenadantes. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Levar o volume total a 50 ml com RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem. </li><li> Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis. </li><li> Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 5 ml sterile 0,9% de NaCl, USP e transferência para novos tubos de 15 mL cónicos. Traga a cada suspensão de células para 14 ml com mais estéril a 0,9% de NaCl, USP. Tampar e misturar por inversão. </li><li> Repetir etapa anterior por duas vezes. Após a última centrifugação, remove-se os sobrenadantes, ficando tão próximo quanto possível para as pelotas de células, sem perturbar os sedimentos. </li><li> Ressuspender as células em peletes DC Solução de congelação em 4 - 20 x 10 6 células / ml e alíquotas de 1 ml a cada frasco 1,8 ml de tubo criogénico. </li><li> Usar o congelador de taxa controlada, um programa, para congelar as alíquotas de vacinas DC e transferir imediatamente para a fase de vapor de um congelador de azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 7. Lote testes de liberação <ol><li> Cada lote de vacina DC devem ser avaliados e atender aos critérios de liberação de lote específicos (Tabela 1), antes de ser liberado para injeção em pacientes no estudo, tipicamente de 5 a 6 semanas após a preparação da vacina. </li><li> Viabilidade:Avaliar a viabilidade da vacina DC utilizando um contador de células automatizado. A especificação mínima aceitável é de viabilidade&gt; 70%. </li><li> Identidade: Avaliar a identidade do DCs maduras (CD11c + CD14-CD83 +) por citometria de fluxo. A percentagem de células + CD11c deve ser&gt; 50%. A percentagem de células CD14 + e CD11c + deve ser &lt;30%, e a percentagem de CD11c +, CD14-e células CD83 + devem ser&gt; 50%. </li><li> Esterilidade: Testar a vacina DC para a presença de bactérias e fungos anaeróbio e aeróbio por cultura direta e manchas de grama. Avaliar a presença de micoplasma usando um sistema de cultura directa e ADN fluorocromo Ensaio de Coloração com a linha celular indicadora. Para estes testes, o conjunto mínimo de especificação é que não se observa o crescimento de todas as culturas. </li><li> A endotoxina: Avaliar o teor de endotoxina utilizando o ensaio de LAL cromogénico cinético Kinetic QCL-e que deve ser &lt;50 EU / ml para satisfazer os critérios mínimos. </li><li&gt; Função: Avaliar a função DC em uma reação mista de linfócitos através da incubação com as células T alogênicas. A presença de proliferação em comparação com DCs não estimuladas é reportado (Figura 3). </li></ol>

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Os autores receberam apoio financeiro a partir do seguinte: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 e K08 AI084578 (Miller)), a Fundação Bill e Melinda Gates, Doris Duke Charitable Foundation, Instituto de Pesquisa do Câncer, Alliance for Lupus Research, eo Emerald Foundation. Nina Bhardwaj é um co-inventor em patentes relacionadas com a preparação e utilização de células dendríticas para manipular a imunidade. Os autores não têm outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro em ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito além daqueles divulgados.

Fase I e II de ensaios clínicos de DCs derivadas de monócitos têm mostrado que induzem respostas imunitárias em pacientes, no entanto o sucesso clínico tem sido limitada 1. Isto pode ser em parte devido à falta de consenso sobre a forma de gerar os DCs óptimas para a utilização de imunoterapia tumoral. Embora haja várias maneiras de gerar DCs clínico grau, estes métodos variam em termos do uso de citocinas utilizadas para diferenciar os monócitos, os estímulos utilizados para induzir a maturação, e os métodos...

<table><tbody><tr><td>Meio RPMI-1640 com L-glutamina</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES tamponado com solução salina</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Albumina humana, solução a 25% USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina estéril USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg / ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg / ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Frascos CryoTube de 1,8 ml</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Freezer de taxa controlada</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Embora estudos clínicos têm demonstrado que as vacinas DC antígeno-carregados são seguros e promissora terapia para tumores 1, sua eficácia clínica ainda não foi estabelecida. O método descrito abaixo, preparadas de acordo com as Boas Processo de Fabricação (GMP), é uma otimização do método de preparação ex vivo mais comum para a geração de um grande número de DCs para estudos clínicos 2. Nosso método utiliza o TLR sintético 3 agonista Carboxymethylcellulose ácido poli-L-lisina Polyinosinic-Polycytidylic (Poly-ICLC) para estimular os DCs. O nosso estudo anterior estabeleceu que a poli-ICLC é o estímulo da maturação individual mais potente para DCs humanas, tal como avaliado por uma sobre-regulação de CD83 e CD86, a indução da interleucina-12 (IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), o interferão-gama induzido proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e os interferões tipo I (IFN), e interleucina mínima 10 (IL-10) de produção. </p&gt; DCs são diferenciados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC congelados), obtidos por leucaferese. As PBMC são isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll e congelado em alíquotas. No dia 1, as CMSPs são descongelados e semeados em frascos de cultura de tecido para seleccionar os monócitos que aderiram à superfície plástica após 1-2 horas de incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido. Após a incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes foram cultivadas durante 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e de granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) para se diferenciarem para DCs imaturas. No dia 6, DCs imaturas são pulsadas com a proteína hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), que serve como um controlo para a qualidade da vacina e pode aumentar-se a imunogenicidade da vacina contra a 3. As DCs são estimuladas a amadurecer, carregado com antígenos peptídeos, e incubadas durante a noite. No dia 7, as células são lavadas, e congelado em alíquotas de 1 ml contendo4-20 x 10 6 células, utilizando um congelador de taxa controlada. Testes de liberação de lote para os lotes de DCs é realizada e deve atender a especificações mínimas, antes de serem injetadas em pacientes.

Entre 10 - 20% a partir de PBMCs diferenciarem em DCs no final do período de cultura. DCs maduras são CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + e CCR7 + (Figura 1). Eles expressam altos níveis de moléculas MHC classe II, as moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e eu e. Poli-ICLC também induziu níveis baixos de PDL-1, em comparação com outros agonistas de TLR 14. Além disso, estas DCs segregam grandes quantidades de poli-IC-maturados de IL-12 (Figura 2 e 15,16) e induzem a p...

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a preparação de células dendríticas de grau clínico para imunoterapia. Isso é realizado primeiramente congelando células mononucleares do sangue periférico isoladas da leucoaférise. Na segunda etapa, as alíquotas congeladas de pbmc são descongeladas e os monócitos são diferenciados em células dendríticas na presença de G-M-C-S-F e IL-4 por cinco dias.Em seguida, as células dendríticas são colhidas, estimuladas com peptídeos e amadurecidas durante a noite com o agonista da TLR3 poly ICLC. Na etapa final, as células dendríticas maduras são colhidas e congeladas em alíquotas. Essas alíquotas congeladas de células dendríticas maduras podem ser descongeladas, transferidas para seringas e injetadas de volta nos pacientes como parte de sua imunoterapia.Demonstrarão o procedimento Merited Sedia e Farra Hassan, ambos técnicos de pesquisa do meu laboratório. Usando um conjunto de transferência de plasma, comece espigando assépticamente uma das portas de acesso na bolsa de leucaférese. Em seguida, utilize uma seringa de 60 mililitros para transferir a leucaférese para um frasco estéril de 500 mililitros. Depois, usando RPMI à temperatura ambiente, ajuste o volume da leucaférese para duas vezes seu volume original e misture bem. Após misturar suavemente um frasco de Ficoll-Paque, adicione 12 mililitros da solução em tubos cónicos estéreis de 50 mililitros e, em seguida, sobreponha cuidadosamente 30 mililitros do produto de leucaférese diluído em cada tubo de Ficoll.Tenha cuidado para não perturbar a interface entre a camada de gradiente de densidade e a suspensão celular. Centrifugue os tubos por 20 minutos a 1000 ×g e temperatura ambiente sem frenagem. Em seguida, retire cuidadosamente a camada turva de PBMC de cada tubo e transfira para novos tubos estéreis de 50 mililitros.Em seguida, adicione RPMI a cada tubo até um volume final de 50 mililitros e, então, misture suavemente as suspensões celulares por inversão. Após centrifugar as células por 10 minutos a 500 Gs e 4 graus Celsius, remova os sobrenadantes de cada tubo e re-suspenda os pellets celulares de cada tubo em RPMI até um volume final de 50 mililitros. Após misturar os tubos suavemente por inversão, determine o número e a viabilidade das células.Em seguida, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em meio de congelação recém-preparado, numa concentração final de duas vezes 10 elevado a oito células por mililitro. Transfira um mililitro Eloqua da solução celular para frascos criogênicos de 1,8 mililitro. Em seguida, transfira os frascos criogênicos para um congelador de taxa controlada e inicie o processo de congelamento. Ao final do processo, transfira imediatamente os frascos criogênicos congelados para a fase de vapor de um congelador de nitrogênio líquido.No dia seguinte, descongele as alíquotas de pBMCs congeladas em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação suave. Assim que completamente descongeladas, transfira o conteúdo dos frascos para tubos cónicos estéreis de 50 mililitros contendo 30 mililitros de RPMI e plasma autólogo centrifugado. Re-suspenda cuidadosamente o pellet celular em um pequeno volume de RPMI acrescido de plasma autólogo.Em seguida, adicione mais RPMI mais plasma autólogo até um volume final de 50 mililitros. Após misturar completamente as suspensões, plaque 1,4 vezes 10 à oitava potência de células em 40 mililitros de RPMI mais plasma autólogo em um frasco Easy de 225 centímetros quadrados. Incube o frasco Easy na posição horizontal por uma a duas horas a 37 graus Celsius no incubador de cultura de tecidos contendo 5% de dióxido de carbono, para permitir que os monócitos adiram ao frasco. Ao final da incubação, lave o frasco Easy duas vezes com 30 mililitros de RPMI pré-aquecido para remover as células não aderidas.Após a segunda lavagem, adicione 40 mililitros de RPMI acrescido de plasma autólogo com IL-4 e G-M-CSF às células e, em seguida, incube o frasco EASI por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Cinco dias depois, agite vigorosamente os frascos e pipete para cima e para baixo para ressuspender. As células não aderentes e fracamente aderentes são transferidas para novos tubos cónicos de 50 mililitros.Após centrifugar as células, suspendemos os pellets celulares em 50 mililitros de RPMI acrescido de plasma autólogo. Após misturar e lavar as células, novamente placa-se de um a dois vezes 10 elevado à sexta células por poço em três mililitros de RPMI com plasma autólogo, IL-4 e G-M-CS-F em placas de cultura de tecidos de seis poços. Em seguida, incuba-se as placas a 37 graus Celsius no incubador de cultura celular contendo 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, adiciona-se 10 microgramas por mililitro de KLH a um terço dos poços das placas de cultura de seis poços e mistura-se as placas por agitação suave em movimento circular.Em seguida, adicione dois microgramas por mililitro de poli ICLC aos poços e misture bem. A seguir, adicione 100 microgramas por mililitro de antígenos peptídicos longos aos poços designados, sendo que cada poço deve receber apenas um único peptídeo para evitar competição cruzada. Incube então as placas durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de dióxido de carbono no sétimo dia, colete e reúna todos os poços contendo células dendríticas.Pulsado com os peptídeos no dia seis em novos tubos cónicos de 50 mililitros. Após centrifugar as células, ressuspenda os pellets celulares aspirados em cinco mililitros de RPMI mais plasma autólogo e, em seguida, complete o volume total para 50 mililitros com RPMI mais plasma autólogo, misturando bem as suspensões celulares. Após calcular o número total de células viáveis, centrifugue os tubos, ressuspenda cada pellet em cinco mililitros de cloreto de sódio estéril e lave cada suspensão celular mais duas vezes em 14 mililitros de cloreto de sódio estéril.Após cada lavagem, misture os tubos após a segunda lavagem. Resuspenda os pellets celulares em solução de congelamento para células dendríticas a uma concentração de quatro a vinte vezes 10 elevado a seis células por mililitro e alíquotas de um mililitro de cada suspensão celular em tubos criogênicos de 1,8 mililitro. Por fim, utilizando o congelador de taxa controlada, congele as alíquotas das vacinas de células dendríticas e, em seguida, transfira imediatamente as alíquotas para a fase de vapor de um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.Entre 10 a 20% das CMBs iniciais diferenciam-se em células dendríticas ao final do período de cultura. A maturação das células dendríticas em resposta ao poli ICLC, representada pelas linhas em negrito, foi avaliada com base na expressão de CD83, CD40 e CCR7, e comparada às células dendríticas não estimuladas, representadas pelos tons cinza. Como demonstrado nestes gráficos de barras, as DCs maduras com poli ICLC neste experimento, diferenciadas a partir de três doadores saudáveis, secretam grandes quantidades de IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-alfa. Essas células maduras com poli ICLC também induzem proliferação de linfócitos T alogênicos, evidenciada pela expressão de CFSE, bem como produção de interferon-gama após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem o uso de células dendríticas para imunoterapia em câncer e doenças infecciosas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Avaliada em hospedeiros de imunocompetente sintônico, a vacina de células dendríticas baseadas em células dendríticas baseadas em câncer (CSC) demonstrou imunidade antitumoral significativamente maior do que as vacinas tradicionais de DC pulsadas com células tumorais a granel heterogêneas.

Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Aprenda a preparar células dendríticas de grau clínico para imunoterapia tumoral usando monócitos autólogos diferenciados com GM-CSF e IL-4. Este método permite gerar grandes quantidades de células maduras para injeção em pacientes.

Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

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