Name: Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a avaliar a competição bacteriana mediada pelo sistema de secreção tipo VI (T6SS) de Pseudomonas aeruginosa contra Escherichia coli. Este ensaio visual permite determinar rapidamente a sobrevivência das células-alvo.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust concessão WT091939MA. Alain Filloux é apoiado pela Royal Society.

1. As cepas bacterianas e Culturas <ol><li> Um engenheiro Escherichia coli célula receptora (Prey, P), transformando (usando padrão de CaCl 2 tratamento ou eletroporação) 15 E. coli DH5a células com um plasmídeo que permita a complementação do gene lacZ (Tabela 1). Placa das células transformadas em placas de ágar Luria-Bertani (LBA, agar 1,5%) contendo 5-bromo-4-cloro-indolil-β-D-galactopiranosido (X-gal) a 40 mg / ml de concentração final e antibiótico apropriado. Incubar a 37 ° C durante a noite e na manhã seguinte para selecionar transformantes azul (ver § 1.3). </li><li> Crescer as células de Pseudomonas aeruginosa de dadores que são T6SS-activo (D +) ou inactivos T6SS-(D-) (Tabela 1) em LBA durante a noite a 37 ° C. No exemplo aqui apresentado foi utilizado um P. Rets aeruginosa estirpe possuindoum H1-T6SS constitutivamente activo 16 e um mutante isogênica com uma deleção do aglomerado de genes de H1 T6SS-(Tabela 1). </li><li> No dia seguinte, preparar uma cultura durante a noite de líquido no frasco gaseificado através da inoculação de um clone azul brilhante entre a E. Os transformantes de E. coli (P) a partir da placa, conforme descrito em § 1.1, em 5 ml de caldo de soja tríptica (TSB) suplementada com o antibiótico apropriado. Crescer sob agitação a 37 ° C. Proceder igualmente com uma única colónia de (D +) e de (D -) a partir da placa, conforme descrito em § 1.2. </li></ol> 2. Ensaio de competição <ol><li> Prepare placas LBA para o experimento dia seguinte. Certifique-se estas placas são bem seco (ou perto do bico de Bunsen ou em câmara de fluxo laminar). Prepara-se uma placa de &quot;Ensaio de entrada&quot; (A-Input) para as amostras (D +), (D -), e (P </strong&gt;). Prepara-se uma &quot;Ensaio de saída&quot; (A saída) da placa para as estirpes (D - + P) e (D + + P). Dividir e rotular as placas em conformidade. </li><li> Após crescimento durante a noite (ver § 1.3), medir a densidade óptica (DO 600 nm) da cultura bacteriana de entrada (D -, D + e P) e calcular o volume necessário para obter uma densidade celular equivalente a 1 unidade de OD 600nm de cada estirpe . Cada &quot;entrada&quot; cultura de células (D -, D + e P) é inicialmente coletado em um recipiente estéril tubos de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Centrifugar as amostras bacterianas a 13.000 rpm durante 1 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. </li><li> Voltar a suspender as pílulas da D -, as culturas de D +, P e, em 100 ul de TSB fresco por pipetagem suave e inocular 10 ml de cada correspondente estirpe como uma única mancha no &quot;A entrada de&quot; prato (preparado em § 2.1). </li><li> Inocular o &quot;A saída de&quot; placa (preparado no § 2.1). Mais precisamente, misturar suavemente ul de 30 (D +) com 30 ul de (P) e 30 ul de (D -) com 30 ml (P) em dois tubos Eppendorf separados (note que as culturas utilizadas são as descritas em § 2.4) . Inocular 20 ul da mistura (D + / P) e (D - / P) como pontos individuais na &quot;A-saída&quot; placa. Permitir que os pontos de secar de um queimador de Bunsen próxima e colocar a placa numa incubadora a 37 ° C, durante um período adequado de tempo durante o qual a morte bacteriana está a ter lugar. No caso de P. aeruginosa, uma matança eficaz bacteriana é observada após 5 horas de incubação quando se compara um T6SS activas com uma estirpe T6SS defeituoso. </li></ol> 3. A observação qualitativa da tele Killing bacteriana <ol><li> Preparar as placas de LBA contendo 40 ug / ml de X-gal para a leitura do ensaio. As placas serão chamados de &quot;entrada de Leitura&quot; ou &quot;R-entrada&quot; para detectar bactérias isoladas ou &quot;saída de Leitura&quot; ou &quot;R-saída&quot; para detectar culturas mistas de bactérias e assim ler o desempenho de matar. Estas placas também devem ser bem seco. Divida o prato em quatro partes iguais em suas costas e anotar essas peças 0, 10 -1, 10 -2 e 10 -3, designando as diluições de cultura bacteriana de detectar as placas de ágar (ver § 3.3). A diluição permitirá uma avaliação semi-quantitativa da taxa de bactérias azul / branco dentro do mesmo local. </li><li> Recolher com uma agulha esterilizada os pontos individuais de bactérias do &quot;A entrada de&quot; placa (ver § 2.4) e &quot;A-saída&quot; placa (ver § 2.5) e ressuspender cada local em diferentes tubos de 1,5 ml Eppendorf contendo 1 ml de TSB. Coloque em um agitador Eppendorf bloco durante 30 minutos para voltar a suspender de forma eficiente obactérias. </li><li> Prepara-se uma série de 5 vezes 3 tubos de Eppendorf contendo 900 uL de TSB e prossiga para cada mancha ressuspenso a 10 diluições em série até 10 -3. Certifique-se de trocar a ponteira e vortex 5 segundos entre cada etapa de diluição. </li><li> Avance para a focagem de suas diluições bacterianas preparadas em § 3.3 em placas bem secas LBA contendo 40 ug / ml de X-gal, começando com o mais diluída à suspensão não diluída, tornando estes os &quot;R-&quot; placas de entrada para o &quot;A -entrada &quot;pontos e os&quot; R-saída &quot;placas para o&quot; A-saída &quot;pontos (Figura 2). Vortex brevemente cada tubo, antes de prosseguir para a mancha para manter uma suspensão homogénea bacteriana. Para a reprodutibilidade dos resultados, o ponto 20 ul, em triplicado, num quadrante (Figura 2). A secura relativa da sua placa é importante, nesta fase, uma vez que as manchas têm de permanecer separados individualmente na placa e não deslizam um contra o outro. A quantificação do ensaio de competição é também possível nesta fase do experimento. A seguir ao passo 3.3, espalhar 100 ul de uma diluição 10 -3 em placas LBA contendo 40 ug / ml de X-gal. Para a reprodutibilidade dos resultados, a uma cultura em placas em triplicado para cada ponto do &quot;A-saída&quot; placa. Colocar as placas de diluição de 37 ° C incubadora durante a noite (o que corresponde a 16 horas de incubação). Proceder à contagem das colônias azuis (as células P que permaneceram vivos). Os resultados típicos obtidos após 5 horas de competição são apresentados na Figura 3. </li><li> Deixar a placa aberta (sem tampa) dentro de uma zona estéril, para permitir a absorção do líquido em excesso, dentro de cada local. </li><li> Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante a noite. Durante este período de incubação, a morte ocorre ainda na mistura (D + / P) a partir de ambas as estirpes estão ainda em contacto. </li><li> Tire uma fotoou digitalizar suas chapas para a análise de saída (Figura 2). Onde manchas permanecem em grande parte azul indica que E. coli não foi morto por P. aeruginosa. É esse o caso quando E. coli é misturado com um p-T6SS defeituoso estirpe aeruginosa (D-) (Figura 2, a placa na parte inferior direita). </li></ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
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<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

O método apresentado neste artigo permite uma observação visual de T6SS mediada atividade bactericida / bacteriostase. O ensaio é efectuado sobre a superfície de uma placa de agar. Foi previamente demonstrado que T6SS dependente de ensaio realizado com matança cultura bacteriana mista líquido não é eficaz, provavelmente devido à falta de contacto constante entre as duas bactérias 8. O T6SS é acreditado para operar com um mecanismo semelhante ao utilizado por bacteriófagos para injectar o DNA em células-alvo 17. Na cultura líquido, a estrutura tubular do T6SS podem quebrar com mais facilidade, inter-bacteriana contato pode ser perdida, e as toxinas não são eficientemente entregue. Em termos de tempos de incubação, as 5 primeiras horas de contacto que descrevem entre a estirpe doadora e a presa são suficientes para observar a morte bacteriana entre P. aeruginosa e E. coli, tal como ilustrado na Figura 3 </strong&gt;. No entanto, é aconselhável ajustar o tempo de incubação através da realização de uma cinética de modo a optimizar as condições experimentais. Uma vez que este método é uma técnica baseada em cor, os resultados de saída pode ser comprometida pela pigmentação da estirpe doadora. Por exemplo, no caso do P. aeruginosa, algumas linhagens produzem níveis elevados de pigmentos de cor, tais como piocianina e pyoverdine, o que pode interferir com a leitura de ensaio, fazendo com que a distinção da presa relativamente difícil. Outros cromogénicos β-galactosidase substratos, tais como o magenta gal-gal ou o vermelho-, podem ser usados ​​em vez de X-gal (Tabela 1). O ensaio de competição pode fazer uso de outros genes repórter para a leitura. Por exemplo, o ensaio semelhante foi também realizada usando a proteína verde fluorescente marcado com presas 12. O nosso ensaio, ao passo que não quantitativas, dá uma boa indicaçãoda actividade T6SS uma vez que é baseada na sobrevivência ou a morte de uma presa repórter. Esta técnica apresenta a vantagem de ser fácil e conveniente para avaliar a actividade bactericida / bacteriostase de T6SSs de quaisquer espécies de bactérias. Até agora, a actividade do T6SS foi demonstrado contra bactérias Gram-negativas e nenhum exemplo claro de T6SS sensíveis bactérias Gram-positivas foi relatado ainda 12. É também óbvio que a incompatibilidade na cultura das diferentes espécies bacterianas para testar (por exemplo, temperatura de crescimento, oxigenação, meios específicos), deve ser considerado. O nosso ensaio pode também ser utilizado para avaliar quais dos componentes T6SS são absolutamente essenciais uma vez que mesmo vestígios de uma toxina secretada pode ser suficiente para matar a presa. Mesmo fraca actividade dos T6SS poderia então ser claramente detectado pelo nosso ensaio, em comparação com o padrão de secreção procedimento de teste dependente da T6SS blot utilizando sobrenadante de cultura e ocidentalanálise. No entanto, uma adequada colónia formadora de unidade de contagem (UFC) é ainda necessário para a quantificação exacta desta actividade T6SS.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETS (D +) (T6SS ativos) </td><td> Tensão laboratório </td><td></td><td> Descrito na referência 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ Rets Δ H1-T6SS (D -) (T6SS inativos) </td><td> Este estudo </td><td></td><td> O cluster H1 T6SS-(englobando os genes para PA0070 PA0095) foi eliminado por troca alélica seguindo o procedimento descrito na referência 18. O fragmento mutante foi gerado com o seguinte conjunto de iniciadores: Os primers dos fragmentos acima: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, e 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Os primers de Down fragmento: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E. coli DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec final A1 A1 HSD R17 (r k -, m k +) pho um sup E44 λ-thi -1 Gir A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Este vector expressa o peptídeo α de β-galactosidase usado para α-complementação. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Utilize a 40 ug / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck-químicos </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (caldo de caseína de soja) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex Genius agitador 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 medidor de densidade celular </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> Research Organics </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Strain, material, plasmídeo e do reagente utilizado. </td></tr></tbody></table>

um ensaio visual para o monitor t6ss mediada competição bacteriana

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Sistemas de secreção de tipo VI (T6SSs) são nanomáquinas moleculares que permitem bactérias Gram-negativas e para o transporte de proteínas para injectar uma ampla variedade de células de 1,2-alvo. O T6SS é composta por 13 componentes do núcleo e exibe semelhanças estruturais com a cauda de bacteriófagos tubo 3. O fago usa um tubo e um dispositivo de puncionar para penetrar o envelope celular das bactérias alvo e injectar o DNA. Propõe-se que o T6SS é um dispositivo de bacteriófago invertido criação de um caminho específico no envelope da célula bacteriana para dirigir efectores e toxinas para a superfície. O processo pode ser levado mais longe e o dispositivo pode perfurar T6SS outras células com as quais a bactéria estiver em contacto, assim injectar os efectores para estes alvos. O tubo de cauda e partes do dispositivo de punção dos T6SS são feitos com Hcp e proteínas VgrG, respectivamente 4,5. A versatilidade do T6SS tem sido demonstrada através datudies usando vários patógenos bacterianos. Os T6SS Vibrio cholerae pode remodelar o citoesqueleto das células hospedeiras eucarióticas injectando uma &quot;evoluiu&quot; VgrG carregando uma actina C-terminal de ligação cruzada de domínio 6,7. Outro exemplo notável foi recentemente documentado usando Pseudomonas aeruginosa, que é capaz de atacar e eliminar as bactérias de uma maneira dependente da T6SS, promovendo assim o estabelecimento de bactérias em nichos microbianos específicos e ambiente competitivo 8,9,10. Neste último caso, três T6SS-secretadas proteínas, ou seja, Tse1, Tse2 Tse3 e têm sido identificados como as toxinas injectados na bactéria alvo (figura 1). A célula do dador é protegido contra o efeito prejudicial destes efectores por meio de um mecanismo de anti-toxina, mediados pelas proteínas Tsi1, Tsi2 e Tsi3 imunidade 8,9,10. Esta actividade anti-microbiana pode ser monitorizado quando T6SS-proficientes bactérias são co-cultivados em sOlid superfícies em competição com outras espécies bacterianas ou com T6SS-inactivos bactérias da mesma espécie 8,11,12,13. Os dados disponíveis enfatizou uma abordagem numérica para o ensaio de competição de bactérias, incluindo demorada contagem CFU que depende em grande parte responsáveis ​​antibióticas. No caso de estirpes resistentes aos antibióticos, como P. aeruginosa, estes métodos podem ser inadequadas. Além disso, com a identificação de cerca de 200 diferentes loci T6SS em mais de 100 genomas bacterianos 14, uma ferramenta de rastreio conveniente é altamente desejável. Foi desenvolvido um ensaio que é fácil de utilizar e requer materiais e reagentes de laboratório padrão. O método oferece uma técnica rápida e qualitativa para monitorizar a actividade bactericida dependente do T6SS / bacteriostase usando uma estirpe repórter como presa (neste caso, a Escherichia coli DH5a), permitindo uma complementação do gene lacZ. No geral, este método é graphic e permite a rápida identificação de fenótipos relacionados T6SS em placas de agar. Este protocolo experimental pode ser adaptado para outras estirpes ou espécies bacterianas, tomando em consideração as condições específicas, tais como meios de crescimento, a temperatura ou o tempo de contacto.

Os resultados típicos são mostrados na Figura 1 com as estirpes e os reagentes descritos na Tabela 1. As placas mostradas nesta figura foram verificados após uma incubação de um dia para o outro. Os &quot;Leitura-Input&quot; placas mostram um padrão de diluição em série para as estirpes utilizadas neste ensaio. Como esperado, a E. coli rapina pontos (P) com superexpressão do gene lacZ azul aparecem no meio suplementado com X-gal, enquanto que a P. doador aeruginosa (D +, T6SS ativa) e (D -, inativos T6SS) permanecem branco. Os &quot;Leitura-saída&quot; placas em que a mistura entre a presa e uma estirpe T6SS ativa (D + / P) foi flagrada mostram o desaparecimento do azul presa, assim, indicando que foi morto. Isto demonstra a capacidade do doador para outcompete a presa. A persistência da cor azul na (D - / P placa) demonstra a incapacidade de um doador T6SS inativo para matar a presa azul. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Matança de E. coli por T6SS-proficiente P. aeruginosa. P. aeruginosa injeta toxinas no E. coli célula alvo de uma forma dependente da T6SS (indicado pela seta branca). Duas toxinas Tse1 e Tse3 (laranja e círculos vermelhos) são injetados na E. periplasma coli e degradar o peptidoglicano 9. A toxina Tse2 (círculo amarelo) é injetado no E. coli citoplasma e tem uma atividade bacteriostática 8,10. A ação combinada das toxinas mata as células-alvo (relâmpago e crânio). A sobrevivência de células alvo pode ser detectada por monitorização da actividade de a-galactosidase produzida β (ver também a Figura 2). P. umeruginosa é protegida contra a actividade das toxinas pelas proteínas de imunidade Tsi1, Tsi2 e Tsi3 (laranja, quadrados amarelos e vermelhos, respectivamente) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Figura 2. Ensaio de placa de agar para monitorar T6SS dependente de morte bacteriana Nesta figura são mostradas na parte superior do &quot;input&quot; Leitura placas constituídas por diluições em série do D -., D + e células de entrada P. As células de entrada P são azuis devido ao α-complementação do gene lacZ e assim produzido β-galactosidase que cliva X-gal. Na parte mais inferior é mostrada a &quot;Leitura-Output&quot; placas constituídas por uma série de diluições da mistura de bactérias entre um activo (D + / P) </strong&gt;, ou um inactivo (D - / P), T6SS doador P. aeruginosa com a estirpe de E. coli presa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Quantificação da morte de E. coli por P. aeruginosa, após 5 horas de incubação. O gráfico apresenta a contagem de CFU de E. coli descrito no passo 3.4. Os resultados aqui apresentados mostram uma diferença de 3 vezes entre o T6SS + e as T6SS-estirpes, sugerindo que a maior parte da morte tem lugar durante as 5 primeiras horas de contacto.

Descreve-se um ensaio qualitativo para monitorar competição bacteriana mediada pela<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Tipo de sistema de secreção VI (T6SS). O ensaio baseia-se na sobrevivência / morte de células de Escherichia coli que transportam um alvo<em&gt; LacZ</em&gt; Repórter. Esta técnica é ajustável para avaliar a actividade bactericida / bacteriostase de T6SS-proficientes microorganismos.

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a capacidade de duas espécies bacterianas de competir entre si quando prosperam no mesmo nicho. Em particular, avaliaremos o papel do sistema de secreção tipo seis ou tipo seis neste processo de competição. Isso é obtido preparando placas de entrada de ensaio com células doadoras com um tipo seis ativo ou células de presa, que se tornarão placas de escala OnX azuis.Em seguida, são preparadas placas de saída de ensaio nas quais as cepas doadoras e de louvor são combinadas. Em seguida, as placas são incubadas para permitir que ocorra a atividade do tipo seis. Em seguida, a diluição em série é preparada a partir das placas de entrada e saída, e as culturas diluídas são identificadas nas placas de entrada e saída de leitura.São obtidos resultados que mostram diferenças na dominância da cor azul em cada mancha com base em uma simples observação visual indicando a sobrevivência das células da presa em cada caso. Quanto mais azul significa mais sobrevivência da presa e, portanto, baixa atividade de morte das células doadoras. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a contagem de unidades formadoras de colônias, é que este método é fácil, não demorado e permite uma avaliação direta da atividade do tipo seis contra uma determinada presa.Portanto, essa técnica avalia a atividade do selo bacteriano em culturas mistas e, portanto, pode ajudar a entender por que algumas infecções polimicrobianas crônicas acabam sendo dominadas por uma única espécie bacteriana, como é o caso da canela de pseudomona nos pulmões de pacientes com fibrose cística. Para iniciar células doadoras de arógeno pseudomonas macroscópicas que são tipo seis D ativo positivo ou tipo seis D inativo negativo em ágar LB ou placas LBA durante a noite a 37 graus Celsius. No exemplo aqui apresentado, usamos uma cepa Pseudomonas aerogen RET S, possuindo um H um tipo seis constitutivamente ativo, e um mutante isogênico com uma deleção do engenheiro de cluster de genes H um tipo seis, uma célula receptora de E coli ou presa transformando DH cinco alfa com um plasmídeo, permitindo a complementação alfa do gene ausente.Isole a bactéria de um estoque de glicerol em LB com XGL e um antibiótico apropriado e incube durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Selecione e escolha transformantes azuis e prepare uma cultura noturna em cinco mililitros de caldo de soja tríptico ou TSB com antibiótico cultivado sob agitação a 37 graus Celsius para o experimento do dia seguinte, prepare placas LBA rotuladas como entrada de ensaio para cepas, D positivo, D, negativo e P e saída de ensaio para D negativo mais P e D positivo mais P. medir a densidade óptica e calcular o volume necessário para obter uma densidade celular equivalente a uma unidade OD 600. Colete cada cultura em um microtubo estéril de 1,5 mililitro.Depois de pilotar as amostras bacterianas a 13.000 RPM por um minuto e Resus suspender os pellets em 100 microlitros de TSB fresco, inocular 10 microlitros de cada cepa como um único ponto na placa de entrada A. Em seguida, misture suavemente 30 microlitros de D positivo com 30 microlitros de P e em um segundo tubo, 30 microlitros de D negativo com 30 microlitros de P. Em seguida, inocule a saída A da placa com um ponto de 20 microlitros de cada mistura. Depois de permitir que as manchas sequem perto de abus e queimador, incube a placa a 37 graus Celsius para permitir que ocorra a morte bacteriana.Para analisar o desempenho de morte bacteriana, prepare placas de LBA contendo 40 microgramas por mililitro de xal. Para a leitura do ensaio, rotule a entrada de leitura das placas para detectar bactérias isoladas ou a saída para detectar culturas bacterianas mistas na parte de trás de cada placa dividida em quatro partes iguais e rotule a seção zero 10 para menos um, 10 para menos dois e 10 para menos três. Cada diluição permitirá uma avaliação semiquantitativa da proporção de bactérias branco-azuladas no mesmo local.Usando uma alça estéril, colete as manchas bacterianas individuais da placa de entrada A e da placa de saída A e ressuspenda cada mancha em microtubos separados de 1,5 mililitro contendo um mililitro de TSB. Agite os tubos por 30 minutos para ressuspender as bactérias enquanto as culturas estão tremendo. Prepare cinco conjuntos de três microtubos, cada um contendo 900 microlitros de TSB.Em seguida, começando com cada ponto ressuspenso, prepare diluições seriadas dez vezes usando pontas frescas e faça um vórtice breve entre as diluições para cada diluição em placas LVA xal, começando com a amostra mais diluída e terminando com a amostra não diluída. O revestimento dos tubos de entrada A nas placas de entrada R e a diluição da saída A nas placas de saída R por ponto de reprodutibilidade é de 20 microlitros em triplicado dentro de cada quadrante. Para quantificar o ensaio de competição nesta fase, coloque 100 microlitros das diluições de 10 a menos três das amostras de saída A em triplicado em placas LBA xga, incube durante a noite a 37 graus Celsius e conte as colônias azuis na área estéril, deixe as placas abertas para permitir que o excesso de líquido seja absorvido e o ganho da incubadora durante a noite a 37 graus Celsius, momento em que a matança ainda está ocorrendo.Como ambas as cepas ainda estão em contato para a imagem de análise de saída ou escanear as placas. Manchas que permanecem em grande parte azuis indicam que a E. coli não foi morta. Como é típico quando cultivado com a cepa de posis defeituosa tipo seis mostrada, aqui está a diluição em série para as placas de entrada de leitura para as cepas usadas neste ensaio.Como esperado, os pré-pontos P de E. coli que expressam o gene ausente aparecem em azul no meio suplementado com XGL, enquanto as cepas de narizes de aérgeno p do doador D tipo seis ativo e D negativo tipo seis inativo permanecem brancos. As placas de saída de leitura nas quais a mistura entre a presa e uma cepa ativa tipo seis D positiva P foi detectada mostram o desaparecimento da presa azul, indicando assim que ela foi morta. Isso demonstra a capacidade do doador de superar a presa.A persistência da cor azul na placa D negativa demonstra a incapacidade de um doador tipo seis inativo de matar a presa azul. Portanto, ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os requisitos para o crescimento ou para a atividade de secreção do tipo seis podem variar de uma espécie bacteriana para outra e, portanto, pode ser necessário um pouco de ajuste da configuração experimental. Além disso, você também deve se lembrar de que, se quiser avaliar a atividade da secreção do tipo seis em uma única espécie, também é muito importante comparar estritamente a atividade de um mutante de secreção do tipo seis com a cepa parental sempre que possível.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como configurar um ensaio visual para avaliar a sobrevivência das pré-células depois que elas estão em contato com a cepa proficiente do tipo seis ou defeituosa do tipo seis.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Speare, L., et al. Ensaio de Coincubação para Quantificar Interações Competitivas entre Isolados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio de co-incubação usado para estudar como as cepas bacterianas competem em um ambiente compartilhado. É amplamente aplicado em microbiologia para identificar mecanismos, como morte dependente ou independente de contato, que impulsionam essas interações.

Ensaio de Coincubação para Estudo de Interações Competitivas entre Cepas Bacterianas

Fonte: Perinbam, K., e Siryaporn, A. Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseado em imagem usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um método rápido baseado em imagens para avaliar a virulência bacteriana, incubando amebas com bactérias presas à superfície ou planctônicas, aplicando uma pastilha de agarose de calceína-acetoximetil (calceína-AM) e imagens de fluorescência para detectar danos à célula hospedeira.

Um ensaio rápido baseado em imagem para triagem de virulência bacteriana induzida por superfícies

Este vídeo demonstra um método baseado em microscopia de fluorescência para estudar a competição bacteriana no nível de uma única célula. Este método fornece informações sobre a estrutura e função das comunidades bacterianas.

Ensaio de co-incubação bacteriana: uma técnica baseada em microscopia de fluorescência para visualizar a competição bacteriana intraespecífica no nível de célula única

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos presentes no soro. Essa abordagem combina soro isolado com bactérias patogênicas e proteínas exógenas do complemento. Após a incubação, as bactérias são cultivadas em uma placa de ágar e as colônias produzidas são quantificadas para medir o título bactericida sérico.

Um ensaio bactericida sérico para a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos

As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Dois ensaios para triagem de alto rendimento baseada em microscopia de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção por Brucella são descritos. O ensaio de entrada detecta os fatores do hospedeiro necessários para a entrada de Brucella e o ensaio de endpoint aqueles necessários para a replicação intracelular. Embora aplicável para abordagens alternativas, a triagem de siRNA em células HeLa é usada para ilustrar os protocolos.

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

O ensaio de inibição do crescimento diferido pode ser usado para avaliar o efeito de competição de um isolado bacteriano sobre outro. A inibição é quantificada medindo a zona de clareamento ao redor do isolado produtor de inibidor ou avaliada qualitativamente determinando a extensão visível da inibição.

Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.

Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri

Este manuscrito descreve um método para o uso de microscopia de fluorescência unicelular para visualizar e quantificar a competição bacteriana na cocultura.

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Aprenda a avaliar a competição bacteriana mediada pelo sistema de secreção tipo VI (T6SS) de Pseudomonas aeruginosa contra Escherichia coli. Este ensaio visual permite determinar rapidamente a sobrevivência das células-alvo.

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