Transporte pneumocócica experimental humana

O objetivo deste procedimento é estabelecer o transporte pneumocócico humano experimental. Isso é feito primeiro diluindo e quantificando as bactérias no inóculo. Na segunda etapa, o voluntário é inoculado por via intranasal com Streptococcus pneumoniae.

Em seguida, o voluntário faz uma lavagem nasal nos dias dois, sete e 14 após a inoculação. Finalmente, a microbiologia clássica é usada para determinar se o voluntário está carregando o occus inoculado. Em última análise, o transporte pneumocócico humano experimental pode ser obtido usando este método seguro e reprodutível.

A principal vantagem desta técnica sobre os modelos de carruagem murina existentes é que esta técnica oferece um modelo de carruagem no hospedeiro natural do pneumococo, o humano. Além disso, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo pneumocócico, como quais são os correlatos imunológicos da proteção? Qual é o efeito imunizante do transporte e qual é o efeito da pressão do hospedeiro sobre o patógeno no nicho nasofaríngeo?

As aplicações desta técnica incluem seu uso como um método para selecionar novas vacinas pneumocócicas. Planejamos usar a prevenção do transporte como um substituto da imunidade induzida pela vacina. Demonstrando a técnica clínica estarão a irmã Angie Wright e o enfermeiro encarregado David Shaw.

30 minutos antes da consulta de inoculação voluntária agendada com um tubo de estoque de inóculo retirado do freezer de 80 graus Celsius negativos. Em seguida, gire o inóculo em uma microcentrífuga por três minutos a 17.000 vezes. G, enquanto o tubo está girando, aqueça algumas placas de ágar sangue em uma incubadora de 37 graus Celsius.

Em seguida, retire o caldo do inóculo da centrífuga e lave o pellet em um mililitro de solução salina. Repita a etapa de centrifugação e lavagem. Execute um conjunto de diluição para a concentração de inóculo desejada e, em seguida, quantifique a quantidade de bactérias no inóculo por um método semelhante a milhas e misra.

As colônias crescidas se tornarão visíveis no dia seguinte. Leve o inóculo ao voluntário, que deve estar sentado confortavelmente em posição semi-reclinada. Em seguida, usando um P 200 perpe e pontas de filtro estéreis.

Puxe 100 microlitros do inóculo para a ponta do perpe e insira a ponta dentro da cavidade nasal. Expulse lentamente o inóculo para a mucosa nasal usando movimentos circulares. Não coloque a ponta da pipeta muito para trás, ou o inóculo escorrerá pela garganta.

Repita a inoculação para as outras narinas para evitar que bactérias entrem na corrente sanguínea. Tenha cuidado para não romper a mucosa com a pipeta. Em seguida, faça com que o voluntário permaneça na posição semi-reclinada por 10 minutos para permitir que as bactérias se dispersem pela mucosa.

Depois de administrar o inóculo aos voluntários, repita a quantificação bacteriana no laboratório. Em seguida, rotule o tubo com a data e a dose do inóculo e armazene o inóculo a 80 graus Celsius negativos. Antes de iniciar a lavagem nasal, peça ao voluntário que se sente confortavelmente com a cabeça inclinada para trás 30 graus em relação à vertical.

Em seguida, peça ao voluntário que respire fundo enquanto empurra a língua para cima e para trás contra o céu da boca. Faça com que o voluntário sinalize quando esta posição for alcançada. Agora lave a cavidade nasal quatro vezes com 20 mililitros de solução salina, descarregando cinco mililitros de solução salina de cada vez no espaço nasal anterior.

Faça com que o voluntário se incline imediatamente para a frente e expire rapidamente pelo nariz em uma tigela de alumínio para expelir o fluido após cada descarga salina de cinco mililitros. Depois de lavar a cavidade nasal com os quatro 20 mililitros, reunir todas as amostras coletadas em um tubo de centrífuga. Agora centrifugue as amostras de lavagem nasal voluntária por 10 minutos a 3.345 vezes G.Remova o supinato e armazene-o como alíquotas de um mililitro em tubos einor rotulados a 80 graus Celsius negativos.

Adicione 100 microlitros de meio STGG ao pellet e misture bem e, em seguida, determine o volume total no tubo. Em seguida, uma gota de 20 microlitros do pellet ressuspenso em uma placa de ágar sangue contendo gentamicina e risca toda a placa. Se a lavagem nasal for pós-inoculação, use 10 microlitros do STGG contendo o pellet ressuspenso.

Para quantificação bacteriana pelo método de milhas e Misra, adicione mais 800 microlitros de STGG ao tubo de lavagem nasal e misture bem. Em seguida, coloque 25 microlitros da solução de células bacterianas STGG em outra placa de ágar sangue e 25 microlitros em uma placa de ágar chocolate, riscando a totalidade de ambas as placas. Em seguida, congele as bactérias restantes em dois frascos criogênicos a 80 graus Celsius negativos.

Incube as placas de 37 graus Celsius durante a noite em 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, examine as placas em busca de pneumococo e outros possíveis patógenos respiratórios. Placas de ágar sangue, inoculadas com lavagens nasais, podem ser difíceis de ler.

Esta imagem mostra um exemplo de uma placa fácil de ler com os pneumococos claramente visíveis. Esta placa, no entanto, contém muitas flora cocolonizadora, tornando mais difícil determinar se os pneumococos estão presentes em todas as consultas. Os voluntários foram solicitados a descrever quaisquer sintomas do trato respiratório superior, se presentes, e a comparação entre portadores e não portadores foi destacada.

Das 145 pessoas recentemente inoculadas com pneumococo, 28 queixaram-se de sintomas, conforme resumido nesta tabela. Oito desses voluntários eram portadores, 20 não. Todas as queixas foram analisadas pelo Comitê de Segurança Externo e após investigações completas.

Nenhum sintoma foi atribuído à doença pneumocócica. Os sintomas mais comuns foram dor de garganta, nariz entupido e doença semelhante à gripe. Ao tentar este procedimento, é importante ter um plano de segurança muito completo, que cubra todas as etapas do método, especialmente para a segurança dos voluntários.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer o transporte pneumocócico humano experimental e detectar o transporte usando uma lavagem nasal.