Name: Transporte pneumocócica experimental humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a estabelecer carregamento pneumocócico experimental humano usando inoculação intranasal de Streptococcus pneumoniae e lavados nasais. Este método seguro e reprodutível auxilia no desenvolvimento de vacinas.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (Grande prêmio Exploração Desafio da SBG), o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR), Centro de Pesquisa Biomédica em Doenças Microbianas, eo NIHR Rede de Pesquisa Global Local. Reconhecemos a NWDA de apoio infra-estrutural. Agradecemos ao Prof J. N Weiser, da Universidade da Pensilvânia e Prof P Hermans, da Universidade de Nijmegen para os isolados de pneumococo. Graças ao Comitê de Segurança EHPC por seu apoio e conselho, a todos os nossos voluntários para a sua participação e Mathieu Bangert para tirar as fotos.

1. Voluntários de Seleção e Triagem <ol><li> Voluntários saudáveis ​​são recrutados por meio de anúncios de cartazes e no site da Universidade de acordo com a Pesquisa NHS e orientação Comitê de Ética. </li><li> Os critérios de inclusão para participação são: <ol><li> Adultos com idade entre 18-60 anos. </li><li> Fala fluentemente Inglês e é capaz de se comunicar facilmente por tanto o telefone móvel e mensagens de texto. </li></ol></li><li> Os critérios de exclusão para a participação são: <ol><li> O contato próximo com a indivíduos de risco (crianças, adultos imunodeprimidos, idosos, saúde crônica doente). </li><li> História de tabagismo atual fumante ou significativa (anos&gt; 10 maços). </li><li> Asma ou outras doenças respiratórias. </li><li> Gravidez. </li><li> Alergia à penicilina ou amoxicilina. </li><li> Participação atual em outro ensaio clínico, a menos observacional ou não-intervencionista fase. </li><li> Incapaz de dar consentimento plenamente informado. </li></ol></li><li>Uma visita de triagem inicial, cerca de uma semana antes da inoculação, inclui uma história focada clínica e exame clínico-alvo. </li><li> Se uma anormalidade até então desconhecida é encontrada, o voluntário será excluído do estudo e investigação apropriada será organizado através da atenção primária. </li><li> Durante a visita de rastreio inicial de uma contagem de sangue completo é obtido a assegurar que a contagem de células brancas está dentro do intervalo normal, antes da visita de inoculação. A lavagem nasal é realizada para excluir portadores de pneumococos naturais (ver 6.1). </li><li> Antes da inoculação, os voluntários são instruídos sobre os riscos envolvidos com a participação no estudo e são fornecidos com um folheto informativo de emergência, termômetro digital, números de telefone de emergência e três dias de curso de amoxicilina. </li></ol> 2. Preparação de Ações de inoculação <ol><li> Preparação dos stocks de inoculação deve ser feito num ambiente limpo. As pipetas usadas só deve ser usard para a preparação do inoculo. Todo o vidro e utensílios de plástico deve ser estéril. Nós recomendamos que os estoques de inoculação ser preparado de uma sala dedicada, utilizando um fumehood dedicado e incubadora. </li><li> Estirpes pneumocócicas são inoculadas em uma placa de ágar sangue. As placas são incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. No dia a seguir todas as bactérias é raspada da placa de agar de sangue e inoculadas em um sistema de preservação do grânulo estoque. Estes estoques de contas são utilizadas para preparação da inoculação. Teste os estoques talão de contaminação e uniformidade colônia antes de preparar um estoque de inoculação. </li><li> Para preparar o stock de inoculação, inocular uma placa de ágar de sangue com dois rebordos do pneumococos do serotipo estoque desejado grânulo, listando-se a cobrir a totalidade da placa. Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO2 durante a noite. Todas as incubações adicionais irão utilizar as mesmas condições. Também incubar os meios Vegitone durante a noite para garantir a esterilidade. </li><li> O cotonete manhã seguintemeia a placa, não tendo o cuidado de remover qualquer ágar sangue, e adicionar 12 ml de pré-aquecido caldo Vegitone. Repita usando a outra metade da placa. Deixar os dois frascos de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas ou até que uma alteração na turvação torna-se aparente, o que ocorrer primeiro. </li><li> Adicionar a 12 ml a 40 ml de caldo de pré-aquecida Vegitone e misturar completamente. Repita para o outro frasco ml 12. Este é o ponto de tempo = 0. Remover 100 ul para ler a densidade óptica (DO) a 600 nm. Remover 20 pi para a quantificação de bactérias formadoras de colónias por unidade (CFU) de contagem usando uma variação do método de Miles e Misra (M &amp; M) 7. Incubar ambos os frascos. <ol><li> Para o M &amp; M, dividir uma placa de ágar sangue em seis seções. Adicionar 180 ul de PBS estéril a seis poços de uma placa de 96 poços (fundo em U). Adicionar 20 ul de caldo para o bem de topo e misturar. Serialmente diluir a amostra 1:10 seis vezes e descartar 20 ul do poço sexto. Coloque três gotas 10 uL do bem superior na primeira seção doágar-sangue. Repetir para os cinco outros poços. Assegurar a placa é seca antes de ser invertidas e incubadas. </li><li> No dia seguinte, contar o número de colónias visíveis em cada secção de diluição e de gravação. Usando o ponto de diluição com uma contagem de entre 30 e 300, dividir o número de colónias visíveis por três, para obter uma média. </li><li> Multiplicar o número médio de colónias por o factor de diluição e, em seguida, dividir por 10 (o valor da queda de 10 uL). Isto dá UFC / ul. </li><li> Multiplicar esse número por 1000 para obter CFU / ml. </li></ol></li><li> Realize OD 600 leituras e quantificação de bactérias por M &amp; M método a cada hora até meados fase log precoce é alcançado, uma DO de 0,25. </li><li> Uma vez que isto é alcançado OD, adicionar 10% de glicerol esterilizado para um frasco e preparar alíquotas de 1 ml. Alíquotas de armazenar a -80 ° C. </li><li> A uma unidade mais concentrada, centrifugar a outra cuvete de 3.345 xg durante 15 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 22,5 ml de Vegitone meio e adicionar 10% de glicerol. Preparar alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C. </li><li> Deixar stocks a -80 ° C durante pelo menos 48 horas antes de descongelação e de quantificação. </li><li> Quantificar o estoque de congelados bacteriana pelo método de M &amp; M. Teste três tubos de ações individualmente para garantir a reprodutibilidade. Utilizar o valor obtido para diluir o material até a concentração desejada em solução salina de inoculo, como descrito abaixo. </li><li> Para a inoculação, a quantidade de pneumococos no inoculo é calculada antes e depois da inoculação. Esta quantificação de bactérias pelo método de M &amp; M é utilizado para determinar o número médio de pneumococos no inoculo que representa o tempo que leva a completar todo o procedimento. <ol><li> Preparar um inoculo, a diluição até à concentração desejada e realizar a quantificação pelo método de M &amp; M para o &quot;pré-inoculação&quot; count. </li><li> No nosso Centro de Pesquisa Clínica que leva a equipe de 30 minutos para completar o processo de inoculação inteiro. Pneumococcal suspensões em soro fisiológico normalmente irá mostrar uma contagem diminuída neste intervalo. Para ter em conta isto, nós Deixe o inóculo diluído à temperatura ambiente durante 30 min e, em seguida, executar uma &quot;pós-inoculação&quot; quantificação das bactérias pelo método de M &amp; M. </li><li> Tomar a média do antes e depois de determinar a concentração final inoculado. Ajuste a &quot;sessão&quot; tempo de acordo com o protocolo clínico, mas manter o intervalo tão breve quanto possível. </li></ol></li><li> Todos os novos lotes deve ser enviado para um laboratório de referência para a confirmação da pureza e identidade de estoque. </li></ol> 3. Preparação do inóculo <ol><li> Preparação do inoculo deve começar antes de 30 min o agendamento voluntário inoculação. </li><li> Pegue um dos tubos de ações feitas anteriormente fora do congelador -80 ° C, descongele-o e girar o tubo na microcentrífuga a 17.000 xg por 3 min. </li><li> Placas de agar de sangue quente na incubadora a 37 ° C. Prepararuma placa de 96 cavidades para a quantificação de bactérias pelo método de M &amp; M e preparar tubos de diluição de acordo com a dose desejada. </li><li> Remover o sobrenadante do caldo de tubo centrifugado e ressuspender o pellet em 1 ml de solução salina. Este passo remove o caldo do inóculo. </li><li> Repetir o passo de centrifugação. </li><li> Remover o sobrenadante salina e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina. </li><li> Executar conjunto de diluição para a concentração desejada de inóculo e quantificar por M &amp; M método. </li><li> Leve o inóculo para o compromisso voluntário e após a inoculação dos voluntários, repita a quantificação no laboratório. Rotular o tubo com a data e a dose de inoculo e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para garantir a consistência da inoculação para a inoculação, é importante usar as mesmas pipetas e equipamento de laboratório dedicado a cada vez. </li></ol> 4. Inoculação <ol><li> Os voluntários devem estar sentado confortavelmente em uma posição semi-deitada. </li><li&gt; Com uma pipeta P200 e estéreis pontas com filtro elaborar 100 ul do inóculo e insira a ponta dentro da cavidade nasal. </li><li> Lentamente expelir o inoculo para a mucosa nasal, usando um movimento circular. </li><li> É fundamental que a ponta da pipeta não entra em contacto com a mucosa nasal, como uma interrupção na integridade do epitélio pode resultar em que as bactérias que entram na corrente sanguínea. </li><li> É também vital que o inóculo não é colocado muito para trás, ou ele vai correr pela garganta, que devem residir no interior da cavidade nasal. </li><li> Repita a operação para o outro naris. </li><li> Têm o voluntário permanecer na posição de semi-deitada durante 10 min sem cheirar ou assoar o nariz. Isto permite o tempo para as bactérias se dispersar através da mucosa. </li></ol> 5. Monitoramento <ol><li> Os voluntários são monitorados diariamente após inoculação. Isso inclui uma mensagem de texto enviado diariamente pelo voluntário para investigadores antes de 2 horas. </li><li> Se o texto inão é recebido por duas horas o voluntário será contactado para garantir a sua / o seu bem-estar. Se ele / ela não responder, o próximo alocado de parentes será contactado para garantir o voluntário do bem-estar. </li><li> Voluntários são convidados a relatar quaisquer sintomas do trato respiratório superior, a cada nomeação. Corpo clínico vai pedir ao voluntário para descrever suas / seus sintomas e irá acompanhar quaisquer queixas. </li><li> Os antibióticos dadas aos voluntários são só deve ser tomada em três circunstâncias: no caso de que eles estão bem e são orientados a levá-los pela equipe de pesquisa, se eles estão carregando pneumococo no final do estudo, ou se eles são mal e não conseguiu contatar a equipe de pesquisa. O voluntário é encorajado a manter este pacote de emergência com eles em todos os momentos durante o estudo e é contactar a equipe de pesquisa em uma base diária para os próximos 7 dias. </li><li> Nossa equipe está disponível 24/7 com o contato enfermeira durante as horas de trabalho e dois médicos disponíveis de hours. Todas as consultas são tratados por chamada telefónica e / ou revisão imediata. Provisões estão disponíveis para admissão imediata e direta a uma ala de Doenças Infecciosas, se necessário. </li></ol> 6. Nasal Wash (NW) Procedimento <ol><li> Lavagens nasais (NW) são realizados a uma visita de rastreio inicial, bem como 48 horas, 7 e 14 dias pós-inoculação. O método utilizado é tomado NW de Naclerio et al. Oito voluntários naturalmente colonizado por S. pneumoniae são excluídos da inoculação e acompanhamento. </li><li> O voluntário está sentado confortavelmente ea cabeça inclinada para trás 30 ° com a vertical. </li><li> Peça ao voluntário para tomar uma respiração profunda e segurar a respiração enquanto empurrando a sua língua para cima e para trás, contra o céu da boca. Enquanto nessa posição, o voluntário é convidado a indicar que eles estão prontos. </li><li> A seringa cheia com 20 ml de solução salina é inserido no espaço nasal anterior e 5 ml de solução salina é expelido. O volunteer então se inclina para frente imediatamente e expulsa o fluido por exalar rapidamente através de seu nariz em uma bacia de alumínio. </li><li> Repetir este procedimento 3 vezes mais, de modo que cada naris foi lavado duas vezes e os 20 ml cheio tiver sido utilizado. </li><li> Piscina de todas as amostras em conjunto num tubo de centrífuga e envie para o laboratório à temperatura ambiente durante o processamento. </li></ol> 7. Nasal Wash Processamento <ol><li> Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.345 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e armazenada como alíquotas de 1 ml em tubos Eppendorf marcados à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicionam-se 100 ul de meio STGG 9 do pellet e misture bem. Certifique-se de que o volume total dentro do tubo neste ponto é determinado. Esta diluição será usada para calcular o CFU de uma carruagem NW positivo. </li><li> Placa de queda de 20 ul da STGG contendo o sedimento ressuspenso para uma placa de agar de sangue contendo gentamicina e raia a placa inteira. <ol><li> Se o NW é pós-inoculação, 10 ul de remover o STGG contendo o sedimento ressuspenso e utilização para a quantificação de bactérias por M &amp; M método. </li></ol></li><li> Adicione mais 800 ul de STGG ao tubo NW e misture bem. </li><li> Ul placa 25 sobre uma placa de agar de sangue e de 25 ul numa placa de ágar de chocolate, listando a placa inteira. </li><li> Dividir as bactérias em suspensão numa quantidade restante STGG médio em 2 criotubos e armazenar a -80 ° C. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante a noite em 5% de CO 2. </li><li> Examine as placas no dia seguinte para pneumococo e outros patógenos respiratórios potenciais. </li><li> Os pneumococos são identificados em placas por meio da morfologia de colónias. Colónias hemolíticas com morfologia alfa relator são sub-cultivadas em agar de sangue, com um disco de optoquina e incubadas durante a noite. </li><li> Presumíveis colónias de pneumococos que são optoquina sensíveis são Gram para confirmar diplococos Gram positiva e sorotipadas usando o Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit. </li></ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
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<li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622(2012).</li>
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<li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li>
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<li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash%2C+using+culture+and+PCR%2C+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122(2011).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A plataforma EHPC tem um número de utilizações potenciais, incluindo o uso como um modelo de vacina da mucosa e como um substituto da protecção para teste de vacinas de proteínas novos. O método depende de uma técnica de inoculação consistente e de alta qualidade NW. Reprodutibilidade pode ser um problema com o inóculo. Devido à natureza variável das alíquotas congeladas bacterianas, que podem ser difíceis de replicar a dose desejada. Uma redução para metade ou dobrar a dose desejada é considerada dentro do alcance. É fundamental que a quantificação de bactérias ser feito imediatamente antes e após a inoculação, a fim de determinar com precisão a quantificação de bactérias por contagem de CFU. Por esta razão, pode ser útil, se os compromissos voluntários ocorrem simultaneamente, de modo que apenas um inoculo precisa ser preparado e o revestimento de quantificação feito antes e após a inoculação ocorre não mais do que 30 min. O método requer a NW Cooperação do voluntário e não seria um método ideal em crianças. Se o rendimento é inferior a 5 ml, o procedimento pode ser repetido usando-se a um extra de 20 ml. Uso de próteses podem reduzir o rendimento NW. Se o voluntário tem um nariz entupido / congestionado ea solução salina está se esgotando anteriormente após a inserção, assoar o nariz, insira a seringa um pouco mais para trás, e inclinar a cabeça para trás mais, se necessário. O NW é uma técnica que fica melhor com a prática. Algum volume será geralmente perdido para o objectivo é que o retorno de pelo menos 10 ml. Se o voluntário pode saborear fisiológica durante a NW então a conexão entre a nasofaringe e orofaringe posterior não tem sido adequadamente fechado pela língua do voluntário. Se a maioria dos voluntários engole da salina, explicar o procedimento novamente, enfatizando a empurrar a língua contra o céu da boca. Em seguida, repita o procedimento para aumentar o volume retornado. Se a NW contém uma substantial quantidade de muco, o melhor é removê-lo antes da centrifugação. Vortex a amostra, de modo a soltar qualquer coisa que possa ser ligado ao muco e, em seguida, remover o máximo dos pedaços grandes quanto possível, durante a remoção, como solução salina pouco quanto possível. Um estudo anterior EHPC nos EUA foi concluída com segurança e sem eventos adversos 11. Para garantir a segurança permanente da plataforma EHPC, temos um conjunto de um protocolo de emergência, que é baseada em torno de acesso 24 horas para a equipe de pesquisa. Voluntários recebem detalhes de contato, permitindo-lhes o acesso à equipe de pesquisa 24 horas por dia. Qualquer assistência médica necessária é fornecida no Royal Liverpool University Hospital. Como medida adicional de proteção, um comitê de segurança composto por médicos e cientistas de fora do grupo de pesquisa recebe um relatório de segurança semanal. O relatório contém a dose bacteriana cada voluntário recebeu e se algum dos sintomas ou doença foram notificados. Este relatório permite a segurança do diaestudo e de ser criticado externamente sem viés. O comitê de segurança também estão disponíveis 24 horas por dia, no caso improvável de uma emergência.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio a 0,9% </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Leite desnatado em pó </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Triptona soja caldo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Agar Columbia com sangue de cavalo chocolated </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-latex kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

transporte pneumocócica experimental humana

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Transporte pneumocócica experimental humano (EHPC) é cientificamente importante porque nasofaríngea dos Streptococcus pneumoniae é a fonte principal de transmissão e o pré-requisito de doença invasiva. Um modelo de transporte permitirá a determinação precisa dos correlatos imunológicos de proteção, o efeito da imunização de transporte e o efeito da pressão de acolhimento sobre o patógeno no nicho da nasofaringe. Além disso, os métodos de detecção de transporte útil em estudos epidemiológicos, incluindo estudos de vacinas, podem ser comparados. Visar Nosso objetivo é desenvolver uma plataforma EHPC que é um método seguro e útil reprodutível, que poderia ser usado para baixo-selecionar candidatos vacinas pneumocócicas romance com a prevenção de transporte como um substituto de imunidade da vacina induzida. Ele vai trabalhar para testes de vacinas candidatas e descrições dos mecanismos subjacentes EHPC e proteção da vacina a partir carriage 1. Atuais vacinas conjugadas contra o pneumococo proteger as crianças contra a doença invasiva, embora novas vacinas são urgentemente necessários, como a atual vacina não confere proteção ideal contra os não-bacteriémica pneumonia e não houve evidência de substituição sorotipo com vacinas sorotipos não 2-4. Método Nós inocular com S. pneumoniae em suspensão em 100 uL de soro fisiológico. A segurança é um factor importante no desenvolvimento do modelo de EHPC e é conseguido através de um rastreio de voluntários intensivos e monitorização. Um comitê de segurança composto por médicos e cientistas que são independentes do estudo fornece feedback objetivo em uma base semanal. O inóculo bacteriano é padronizado e exige que nenhum produto de origem animal são inoculados em voluntários (à base de vegetais mídia e salinas). As doses necessárias para a colonização (10 4 -10 5) são muito mais baixos than aqueles usados ​​em modelos de animais (10 7) 5. Detecção de portador de pneumococos é reforçada por um elevado volume (de preferência&gt; 10 ml) lavagem nasal que é relativamente livre de muco. Este protocolo irá lidar com as partes mais importantes do protocolo, por sua vez. Estes são: (a) seleção de voluntários, (b) a preparação do inóculo pneumocócica, (c) a inoculação, (d) acompanhar e (e) a detecção de transporte. Resultados Nosso protocolo atual tem sido seguro em mais de 100 voluntários em uma gama de doses usando dois diferentes sorotipos bacterianos 6. Um estudo utilizando doses variando S. pneumoniae 6B e 23F está actualmente a ser realizado para determinar a dose óptima para o transporte de inoculação de 50%. A taxa prevista de 50% de transporte permite que o modelo EHPC ter alta sensibilidade para a eficácia da vacina com números de estudo de pequenas dimensões.

Temos experiência de inocular 159 pessoas, dos quais 35 têm realizado pneumococo. A dose mais baixa que conseguida com o uso de transporte serotipo 6B era 11100 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi de 313.000 ufc/100 ul por naris. A dose mais baixa que conseguimos com o uso de transporte 23F sorotipo foi 9000 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi 84.500 ufc/100 ul por naris. Nosso método de avaliação de transporte é uma lavagem nasal, escolhido por um estudo recente 10 mostrou que 91% dos voluntários encontrou lavagem nasal para ser mais confortável do que swab de nasofaringe, a lavagem nasal também foi mais fácil detectar patógenos por meio de cultura microbiológica. Flora microbiana recuperados em placas de ágar sangue inoculados com NW pode ser variável e difícil de ler. A gentamicina é usado na primeira placa de ágar de sangue para seleccionar para pneumococo. A placa de agar de chocolate e a placa de ágar de sangue segundo são utilizados para detectar caminho respiratória outro potencialOgens que podem ajudar ou dificultar a colonização pneumocócica. Um exemplo de uma placa de agar de sangue inoculadas com NW que é fácil de ler é mostrado na Figura 1A, com uma placa de difícil contendo vários tipos de flora é mostrado na Figura 1b. A cada nomeação voluntários foram solicitados a descrever os sintomas do trato respiratório superior, se presente, e comparações entre portadores e não-portadores foram destaque. Das 145 pessoas recentemente inoculados com o pneumococo, 28 queixaram-se de sintomas (Tabela 1). Oito deles eram portadores, 20 não eram. Os sintomas mais comuns eram não específicas sintomas nasais (Tabela 1). Dos casos em que não foram relatados sintomas sistêmicos, como febre e / ou mal-estar, nenhuma das investigações realizadas mostraram evidência de doença pneumocócica e os sintomas eram compatíveis com a infecção viral concomitante, exceto em um caso de amigdalite. Dois positiv pneumocócicavoluntários de e foram tratados com antibióticos. Se queixou de dor de garganta e dor de ouvido e, depois de se encontrar com o médico do estudo, foi aconselhado a tomar antibióticos como precaução. O outro voluntário foi diagnosticado clinicamente com amigdalite. Todos os voluntários tiveram resolução rápida dos sintomas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Figura 1. Placa de agar de sangue inoculadas com NW. Placas de agar de sangue inoculadas com NW pode ser difícil de ler. 1a é um exemplo de uma placa que é fácil de ler com pneumococos claramente visível. 1b é uma placa com vários co-colonizadoras flora tornando mais difícil detectar se pneumococo está presente. <table border="1"><tbody><tr><td> Os sintomas </td><td></td><td> Transporte (n = 32) </td><td> Não Transporte (n = 112) </td></tr><tr><td> Todossintomas </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Sistêmico </td><td> Febre </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> * Mal-estar </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Local </td><td> Orelhas </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nariz </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Garganta </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Caracterização de voluntários relataram sintomas seguindo S. pneumoniae 6B inoculação. Todas as reclamações foram analisadas pelo comitê de segurança externa e, após investigações completas, sem sintomas foram atribuídos à doença pneumocócica. Os sintomas mais comuns foram dor de garganta, nariz e recheado síndrome gripal.

Transporte pneumocócica Experimental humano oferece um modelo natural de transporte e um modelo potencial para uso no desenvolvimento de vacinas. Esta técnica é útil mas complexo e envolve o risco clínico através da introdução de um agente patogénico para um ser humano. Nós desenvolvemos um protocolo detalhado.

Transporte pneumocócica experimental humana

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

O objetivo deste procedimento é estabelecer o transporte pneumocócico humano experimental. Isso é feito primeiro diluindo e quantificando as bactérias no inóculo. Na segunda etapa, o voluntário é inoculado por via intranasal com Streptococcus pneumoniae.Em seguida, o voluntário faz uma lavagem nasal nos dias dois, sete e 14 após a inoculação. Finalmente, a microbiologia clássica é usada para determinar se o voluntário está carregando o occus inoculado. Em última análise, o transporte pneumocócico humano experimental pode ser obtido usando este método seguro e reprodutível.A principal vantagem desta técnica sobre os modelos de carruagem murina existentes é que esta técnica oferece um modelo de carruagem no hospedeiro natural do pneumococo, o humano. Além disso, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo pneumocócico, como quais são os correlatos imunológicos da proteção? Qual é o efeito imunizante do transporte e qual é o efeito da pressão do hospedeiro sobre o patógeno no nicho nasofaríngeo?As aplicações desta técnica incluem seu uso como um método para selecionar novas vacinas pneumocócicas. Planejamos usar a prevenção do transporte como um substituto da imunidade induzida pela vacina. Demonstrando a técnica clínica estarão a irmã Angie Wright e o enfermeiro encarregado David Shaw.30 minutos antes da consulta de inoculação voluntária agendada com um tubo de estoque de inóculo retirado do freezer de 80 graus Celsius negativos. Em seguida, gire o inóculo em uma microcentrífuga por três minutos a 17.000 vezes. G, enquanto o tubo está girando, aqueça algumas placas de ágar sangue em uma incubadora de 37 graus Celsius.Em seguida, retire o caldo do inóculo da centrífuga e lave o pellet em um mililitro de solução salina. Repita a etapa de centrifugação e lavagem. Execute um conjunto de diluição para a concentração de inóculo desejada e, em seguida, quantifique a quantidade de bactérias no inóculo por um método semelhante a milhas e misra.As colônias crescidas se tornarão visíveis no dia seguinte. Leve o inóculo ao voluntário, que deve estar sentado confortavelmente em posição semi-reclinada. Em seguida, usando um P 200 perpe e pontas de filtro estéreis.Puxe 100 microlitros do inóculo para a ponta do perpe e insira a ponta dentro da cavidade nasal. Expulse lentamente o inóculo para a mucosa nasal usando movimentos circulares. Não coloque a ponta da pipeta muito para trás, ou o inóculo escorrerá pela garganta.Repita a inoculação para as outras narinas para evitar que bactérias entrem na corrente sanguínea. Tenha cuidado para não romper a mucosa com a pipeta. Em seguida, faça com que o voluntário permaneça na posição semi-reclinada por 10 minutos para permitir que as bactérias se dispersem pela mucosa.Depois de administrar o inóculo aos voluntários, repita a quantificação bacteriana no laboratório. Em seguida, rotule o tubo com a data e a dose do inóculo e armazene o inóculo a 80 graus Celsius negativos. Antes de iniciar a lavagem nasal, peça ao voluntário que se sente confortavelmente com a cabeça inclinada para trás 30 graus em relação à vertical.Em seguida, peça ao voluntário que respire fundo enquanto empurra a língua para cima e para trás contra o céu da boca. Faça com que o voluntário sinalize quando esta posição for alcançada. Agora lave a cavidade nasal quatro vezes com 20 mililitros de solução salina, descarregando cinco mililitros de solução salina de cada vez no espaço nasal anterior.Faça com que o voluntário se incline imediatamente para a frente e expire rapidamente pelo nariz em uma tigela de alumínio para expelir o fluido após cada descarga salina de cinco mililitros. Depois de lavar a cavidade nasal com os quatro 20 mililitros, reunir todas as amostras coletadas em um tubo de centrífuga. Agora centrifugue as amostras de lavagem nasal voluntária por 10 minutos a 3.345 vezes G.Remova o supinato e armazene-o como alíquotas de um mililitro em tubos einor rotulados a 80 graus Celsius negativos.Adicione 100 microlitros de meio STGG ao pellet e misture bem e, em seguida, determine o volume total no tubo. Em seguida, uma gota de 20 microlitros do pellet ressuspenso em uma placa de ágar sangue contendo gentamicina e risca toda a placa. Se a lavagem nasal for pós-inoculação, use 10 microlitros do STGG contendo o pellet ressuspenso.Para quantificação bacteriana pelo método de milhas e Misra, adicione mais 800 microlitros de STGG ao tubo de lavagem nasal e misture bem. Em seguida, coloque 25 microlitros da solução de células bacterianas STGG em outra placa de ágar sangue e 25 microlitros em uma placa de ágar chocolate, riscando a totalidade de ambas as placas. Em seguida, congele as bactérias restantes em dois frascos criogênicos a 80 graus Celsius negativos.Incube as placas de 37 graus Celsius durante a noite em 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, examine as placas em busca de pneumococo e outros possíveis patógenos respiratórios. Placas de ágar sangue, inoculadas com lavagens nasais, podem ser difíceis de ler.Esta imagem mostra um exemplo de uma placa fácil de ler com os pneumococos claramente visíveis. Esta placa, no entanto, contém muitas flora cocolonizadora, tornando mais difícil determinar se os pneumococos estão presentes em todas as consultas. Os voluntários foram solicitados a descrever quaisquer sintomas do trato respiratório superior, se presentes, e a comparação entre portadores e não portadores foi destacada.Das 145 pessoas recentemente inoculadas com pneumococo, 28 queixaram-se de sintomas, conforme resumido nesta tabela. Oito desses voluntários eram portadores, 20 não. Todas as queixas foram analisadas pelo Comitê de Segurança Externo e após investigações completas.Nenhum sintoma foi atribuído à doença pneumocócica. Os sintomas mais comuns foram dor de garganta, nariz entupido e doença semelhante à gripe. Ao tentar este procedimento, é importante ter um plano de segurança muito completo, que cubra todas as etapas do método, especialmente para a segurança dos voluntários.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer o transporte pneumocócico humano experimental e detectar o transporte usando uma lavagem nasal.

Research

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Medicine

Medicina

A colonização da nasofaringe murina com Streptococcus pneumoniae e a subsequente extração de células aderentes ou recrutadas é descrita. Esta técnica envolve a lavagem da nasofaringe e a coleta do fluido através das nares e é adaptável para várias leituras, incluindo quantificação celular diferencial e análise da expressão mRNA in situ.

Caracterização de Respostas Inflamatórias Durante Colonização Intranasal com Streptococcus pneumoniae

Os ensaios in vitro de adesão pode ser utilizado para estudar a ligação de Streptococcus pneumoniae a monocamadas de células epiteliais e para investigar possíveis intervenções, tais como o uso de probióticos para inibir a colonização de pneumococo.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Streptococcus pneumoniae forma lesões microscópicas discretas e não purulentas no coração. Está delineado o protocolo para um modelo murino de formação de microlesões cardíacas. São fornecidas instruções sobre visualização de microlesões usando microscopia, discriminação entre microlesões precoces e tardias e métodos para detectar remodelação cardíaca em corações de animais convalescentes.

Visualização de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Um método para estabelecer infecções pulmonares em roedores imunocompetentes é descrito. Com proficiência, este método pode ser realizado de forma rápida e fácil para induzir infecção estável com muitos isolados de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae e A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

Aqui, descrevemos uma cepa 519/43 do sorotipo 1 de S. pneumoniae que pode ser geneticamente modificada usando sua capacidade de adquirir naturalmente DNA e um plasmídeo suicida. Como prova de princípio, um mutante isogênico no gene da pneumolisina (plys) foi feito.

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Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Aprenda a estabelecer carregamento pneumocócico experimental humano usando inoculação intranasal de Streptococcus pneumoniae e lavados nasais. Este método seguro e reprodutível auxilia no desenvolvimento de vacinas.

Transporte pneumocócica experimental humana

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