Name: 电穿孔轴突轨迹跟踪和突触目标的后脑在鸡胚 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习电穿孔技术标记鸡胚后脑特定神经元并追踪其轴突投射与突触靶点的方法。该技术结合免疫荧光染色和显微分析，可揭示不同发育阶段的神经连接模式，为发育神经生物学研究提供重要工具。

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感谢 Yuval Gottlieb-Dror 博士提供电穿孔示意图。本工作获得了以色列国家心理生物学研究所和下萨克森-以色列研究合作项目向 DSD 提供的资助，以及以色列科学基金会、以色列卫生部和卓越中心—遗产传承生物医学科学合作计划向 AK 提供的资助。

1. 后脑电穿孔
1.1 蚕卵处理
<ol>
	<li>将鸡蛋水平放置于加湿的孵育箱中（37-38.5 °C）。孵育65-70小时后，当胚胎发育至16-17（HH）期（25-30个体节）时，进行电穿孔操作。</li>
	<li>从孵育箱中取出鸡蛋；保持其水平位置。</li>
</ol>
1.2 准备工作
<ol>
	<li>拉制玻璃毛细管（直径 0.5 mm）。</li>
	<li>将弯曲的 L 形金质 Genetrodes 电极（直径 3 mm）通过适配器连接至脉冲发生器。电穿孔参数包括：25 伏电压、5 次脉冲、脉冲时长 45 毫秒、脉冲间隔 300 毫秒。</li>
	<li>准备口吸移液管、10 ml 注射器针头、石蜡膜条、软毛刷、锋利的解剖剪刀以及 25 ml 无菌 PBS 溶液。此用量通常足以处理一个蛋盘（18 枚蛋）。</li>
	<li>配制适量的 DNA 质粒混合物（每种 5 μg/μl），并加入约 0.025% 的 Fast Green 染料以可视化 DNA 注射过程。通常，一个蛋盘的注射量约为 4 μl 即可。</li>
</ol>
1.3 窗口化、注射与电穿孔
<ol>
	<li>用 70% 乙醇清洁蛋壳。</li>
	<li>每次操作一个鸡蛋，以尽量减少胚胎暴露在空气中的时间。</li>
	<li>用剪刀尖在蛋的极部开一个小孔，并用注射器吸出 3–4 ml 蛋白液。不要移除过多蛋白液，以免降低胚胎活力。</li>
	<li>使用解剖剪在蛋壳上部中央打开一个大小为 2.5 × 2 cm 的小椭圆形窗口。</li>
	<li>在整个操作过程中，向胚胎表面滴加数滴 PBS，以防止干燥。</li>
	<li>用口吸移液管将少量 DNA 混合液吸入玻璃毛细管中。</li>
	<li>将蛋放置成胚胎尾端朝向操作者。此阶段无需注射墨汁，因胚胎已清晰可见；避免墨汁注射可提高胚胎存活率。手持毛细管以约 45° 角穿刺进入后脑尾部。不要移除胚胎周围的任何膜组织。小心将 DNA 溶液注入后脑室腔内，并在吹出时避免产生气泡。DNA 溶液会向前扩散。</li>
	<li>DNA 注射后立即在目标位置精确放置平行电极，使其对准预定的前后（AP）和背腹（DV）方向的后脑区域。将电极轻微向腹侧推进，但不要接触心脏，以免降低存活率。启动电穿孔仪。电极表面应出现气泡，以表明具有良好的电导性（图 1A）。</li>
	<li>小心取出电极，并滴加数滴 PBS 以冷却胚胎并清除气泡。用一片 Parafilm 封闭蛋壳开口，防止孵化过程中干燥。用软毛刷在 PBS 中清洗电极。</li>
	<li>将蛋放入孵育器中，孵育所需时间。电穿孔后 2–3 天胚胎存活率约为 90%，至 12 天后存活率下降至约 50%。</li>
</ol>
2. 胚胎分析
2.1 平铺制备与免疫荧光
<ol>
	<li>在E6.5之前可进行后脑的平铺制备，以便在显微镜或体视显微镜下清晰观察轴突。</li>
	<li>小心地将胚胎从周围的膜和血管中分离出来。将胚胎放入一个小的 硅胶-包被 含有 PBS 的培养皿。用钨针将胚胎背侧朝上固定在培养皿中。使用锋利的玻璃毛细管在后脑的背侧 roof-plate 上做切口。</li>
	<li>使用锋利的镊子和显微剪，夹住头部上部，从头侧向尾侧非常小心地拉出后脑组织。分离后脑后，去除残留的腹侧组织，以获得干净的标本。</li>
	<li>在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）溶液孵育后脑1-2小时。用PBT（PBS/0.1% Triton X-100）洗涤后脑以去除PFA。</li>
	<li>用于扁平封片后脑的免疫荧光染色时，加入500 μl封闭液（含5%山羊血清的PBT），室温孵育2小时。随后加入1st 4 °C 条件下抗体过夜孵育。用 PBT 洗涤（15 分钟 × 3 次）。孵育 2nd 在室温下用抗体孵育2小时。用PBT洗涤（每次15分钟，共3次）。</li>
	<li>将脑干背侧朝上放置于载玻片上。在脑干上滴加荧光封片剂。使用玻璃毛细管或钨针将脑干在载玻片上压平。</li>
	<li>在每个角落添加少量润滑剂，以防止盖玻片挤压组织。小心地将盖玻片置于后脑上方，避免产生气泡。为增强固定效果，可在盖玻片边缘涂抹指甲油。</li>
</ol>
2.2 冷冻切片与免疫荧光
<ol>
	<li>在任何阶段均可对脑干进行冷冻切片以观察轴突的走行。然而，由于胚胎整体标本在 E6.5 之后变得过厚，难以清晰观察轴突，因此此后应优先采用切片方法。此外，要显示突触结构，必须对组织进行切片，并在显微镜下采用高倍镜观察。</li>
	<li>解剖胚胎并去除所有周围组织。用PBS冲洗。使用显微剪刀和尖头镊子在延髓尾侧部分进行切割。在小脑与中脑之间做一较宽切口，取出整个脑干。组织应包含延髓、脑桥和小脑。</li>
	<li>在4%多聚甲醛中4 °C过夜（ON）固定脑干，用PBS冲洗（每次10分钟，共3次），然后在30%蔗糖溶液中4 °C过夜孵育至组织沉底。</li>
	<li>将后脑置于包埋盒中，用OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋剂包埋，并于-20 °C条件下冷冻，具体操作参见其他文献。 11.</li>
	<li>将OCT包埋块置于冷冻切片机中，调整至所需的切片方向，切片厚度为12 μm。</li>
	<li>干燥载玻片。每张载玻片上加入 100 μl 封闭液，室温孵育 2 小时。每张载玻片加入 100 μl 抗体（用封闭液稀释至所需浓度），孵育时间为 1st 和 2nd 抗体孵育分别在4 °C过夜或室温2小时进行。每次孵育时，轻轻在切片上覆盖Parafilm条以防止干燥。抗体之间用PBS洗涤（每次10分钟，共3次）。如需染核，可加入1:1,000的DAPI（4'-6-二脒基-2-苯基吲哚），用PBS稀释后室温孵育20分钟。最后用PBS冲洗。</li>
	<li>使用荧光封片剂封片。分析前室温干燥1小时。</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+precerebellar+nuclei+in+the+rat%3A+II.+The+intramural+olivary+migratory+stream+and+the+neurogenetic+organization+of+the+inferior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive.</a> J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).</li>
<li>Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+neurons+of+the+proprioceptive%2C+interoceptive%2C+and+arousal+hindbrain+networks+share+a+developmental+requirement+for+Math1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).</li>
<li>Storm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bHLH+transcription+factor+Olig3+marks+the+dorsal+neuroepithelium+of+the+hindbrain+and+is+essential+for+the+development+of+brainstem+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei.</a> Development. 136, 295-305 (2009).</li>
<li>Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+segmentation+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain.</a> Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).</li>
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<li>Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Hox+expression+in+the+vertebrate+hindbrain%3A+influence+of+paraxial+mesoderm+and+rhombomere+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition.</a> Neuron. 16, 487-500 (1996).</li>
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<li>Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+hodological+and+cytoarchitectonic+organization+in+the+vestibular+complex+of+the+11-day+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo.</a> J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).</li>
<li>Marin, F., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+fate+of+rhombomeres+in+quail%2Fchick+chimeras%3A+a+segmental+analysis+of+hindbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在鸡胚神经系统发育过程中，in ovo 电穿孔是一种可行、可靠且有效的工具，可用于研究细胞命运决定及轴突导向20。本实验方案描述了一种在鸡胚后脑 E2.75 期进行电穿孔的方法，利用增强子元件实现特定中间神经元的条件性标记。该策略结合 PiggyBac 介导的转座系统，将外源基因插入鸡基因组，从而可在胚胎发育的较晚阶段追踪轴突路径、投射模式及突触形成位点。
此前用于标记鸡后脑轴突/突触的方法包括经典的逆行或顺行染料标记或组织移植实验21-23。这些研究对后脑上行和下行轴突束的通路提供了重要的发现。然而，这些基于细胞水平的方法忽略了某些轴突路径和投射。此外，投射至已报道的纤维束中的神经元亚群的分子特性也无法被揭示。我们结合电穿孔与持续性遗传示踪的方法，能够独特地追踪选定后脑神经元从命运决定阶段到轴突导航及其投射靶区的整个发育过程10。值得注意的是，我们此前已应用该方法在较短时间内追踪脊髓背侧中间神经元的轴突走向8,9。
...

后脑是神经系统的关键中继枢纽，通过上行和下行神经网络在中枢神经系统与周围神经系统之间进行通信。它调控多种基本功能，包括呼吸、意识、听觉和运动协调1-3。在早期胚胎发育过程中，脊椎动物的后脑沿其前后（AP）轴暂时划分为一系列重复的菱脑节，在这些菱脑节中形成不同类型的神经元，并产生多个脑干核团中心4。后脑还沿其背腹（DV）轴分为基板和翼板，在不同DV位置上特定的神经前体细胞被确定并分化3,5,6。目前尚不清楚早期AP和DV特异性的神经元模式如何调控功能性脑干神经环路的建立。
为了探究这一基础科学问题，需要借助特定工具来标记早期后脑中特定的神经元亚群，并在更晚的发育阶段示踪其轴突走向及连接性。我们此前曾利用特定增强子元件以及基于Cre/LoxP的条件性表达系统，在早期鸡胚中追踪背侧脊髓中间神经元的轴突轨迹7-9。在本研究中，我们聚焦于后脑区域，并改进了实验方案，采用改良的电穿孔策略结合PiggyBac介导的DNA转座技术，实现对晚期胚胎后脑中间神经元、轴突及其突触靶点的标记。这一新策略使我们能够在后脑的一侧标记不同的神经元亚型，并在电穿孔后2至12天的不同胚胎发育阶段，追踪其轴突投射路径及突触形成位点。基于该方法，我们标记了后脑中最背侧的中间神经元亚群（dA1/Atoh1+细胞），并揭示了两种不同的对侧上行轴突投射模式，每种模式起源于不同的前后（AP）位置，并在不同的索束中延伸。研究发现，dA1轴突投射至听觉核团、中脑以及小脑的多个层状结构，并在这些区域形成突触10。
结合鸡胚电穿孔、神经元的遗传示踪以及对发育较晚期投射位点的分析，为研究大脑神经网络的形成以及阐明调控神经环路建立的分子机制提供了一个独特的平台。

<table><tbody><tr><td>L形金质Genetrodes 3 mm电极</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0162</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器，ECM 830</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>OCT（最佳切割温度）包埋剂</td><td>Tissue-Tek Sakura</td><td>4583 O.C.T. Compound</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>任意商业供应商</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

电穿孔法标记鸡胚后脑以示踪轴突投射路径及突触靶点

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

对鸡胚神经管进行电穿孔具有多种优势，例如可快速高效地将外源基因导入神经元细胞。本文提供了一种独特的方法，用于在 E2.75 时期对禽类后脑进行 DNA 电穿孔，以特异性标记一部分神经前体细胞，并追踪其轴突投射及突触靶标在后续发育阶段（直至 E14.5）的动态变化。我们采用了多种新型遗传工具，包括特异性增强子元件、基于 Cre/Lox 的质粒以及 PiggyBac 介导的 DNA 转座系统，以驱动 GFP 在后脑特定亚型细胞（背侧最上方的中间神经元亚群，dA1）中表达。在胚胎发育的早期和晚期，于脑干多个区域追踪了 dA1 轴突的走行路径及其靶向分布。该策略为在胚胎后脑中靶向特定细胞以及在多个发育阶段追踪神经环路形成提供了先进的技术手段。

最近，该方案被用于揭示鸡胚后脑中间神经元 dA1 亚群的轴突形态及其投射位点10。为了特异性地标记这些轴突，研究人员确认了一段增强子元件（Atoh1）在后脑 dA1 细胞中表达，该元件此前已被鉴定为脊髓 dI1 神经元的特异性标记物8,12,1310。将该元件克隆至 Cre 重组酶上游，并在 E2.75 时期与一种 Cre 依赖的胞质 GFP 报告质粒（pCAGG-LoxP-Stop-LoxP-cGFP；图 1BI）共同进行电穿孔转染。电穿孔 48 小时后，通过整体脑组织铺片法分析后脑，结果显示了两种对侧上升的轴突投射模式（图 2A）；其中一条纤维束仅来源于位于菱脑节 6-7 的 dA1 神经元，沿背侧索延伸；另一条则起源于菱脑节 2-5 的神经元，并沿外侧索延伸。
为了在发育的后期阶段绘制 dA1 中间神经元的轴突投射图谱，采用了 PiggyBac 转座方法14,15。将报告基因 Cre 条件性肉豆蔻酰化 GFP（mGFP）表...

神经元网络如何在胚胎大脑中建立是发育神经生物学中的一个基本问题。在此，我们将电穿孔技术与新型遗传工具相结合，如在禽类后脑中使用Cre/Lox质粒和PiggyBac介导的DNA转座系统，以标记背侧中间神经元，并在不同发育阶段追踪其轴突投射及突触靶点。

鸡胚神经管的电穿孔具有多种优势，例如可快速高效地将外源基因导入……

本实验的总体目标是对鸡胚后脑中特定的神经元亚群进行标记，并示踪其轴突的投射路径及靶区。该目标通过以下步骤实现：首先在胚胎发育第2.75天的蛋壳中央打开一个小型椭圆形窗口，随后将DNA质粒注射至后脑的脑室腔内。随后对后脑进行单侧电穿孔，以在目标神经元群体中表达相应载体，并将鸡蛋继续孵育。最后，从整个胚胎中解剖出脑干，用于整体封片制备或组织切片。最终，通过免疫荧光染色和显微镜分析，可以获得在不同发育阶段后脑、脑干和小脑中轴突投射及突触靶点的结果。该方法有助于回答发育神经生物学领域中的关键问题，例如在胚胎发育过程中，特定的神经元细胞如何投射其轴突并形成突触连接。为准备电穿孔，将样本在37至38.5摄氏度下孵育65至70小时，直至达到16至17期。在卵孵化的同时，拉制玻璃毛细管，并使用适配器夹具将弯曲的L形金电极连接至脉冲控制器。将电穿孔参数设置为25伏、5次脉冲、45毫秒脉冲时长和300毫秒脉冲间隔。准备口吸管、10毫升注射器针头、对苯甲醛条、软毛刷、锋利的解剖剪刀以及25毫升无菌PBS。配制适量的DNA质粒混合物，并加入快绿染料以可视化注射的DNA。当卵达到适当的发育阶段时，将其从培养箱中取出并保持水平位置。用70%乙醇清洁卵壳。每次操作一个卵，以尽量减少胚胎暴露。用剪刀尖刺破气室放气。在卵的钝端打一个小孔，用注射器抽出3至4毫升蛋清。使用解剖剪，在蛋壳的上水平极处开一个小型椭圆形窗口。在整个过程中，需滴加数滴 PBS 液于胚胎表面，以防干燥。使用口吸管将少量 DNA 混合物吸入玻璃毛细管中。随后，将胚胎置于后端朝上的位置进行间接观察。然后将毛细管保持约45度角，插入胚胎的菱脑区域。操作过程中不得损伤胚胎周围的膜组织，且避免产生任何气泡。小心呼气，将DNA溶液注入菱脑的管腔内。在注射DNA后，溶液将立即向前扩散。将平行电极准确放置于目标的前后位（AP）和背腹位（DV）的后脑区域。在不接触心脏的情况下，将电极轻微向腹侧推进，并施加电脉冲。电极上应覆盖气泡以指示导电性，小心取出电极，并滴加数滴 PBS 以冷却胚胎并去除气泡。使用封口条妥善封闭蛋壳开口，防止孵化过程中干燥，用软毛刷蘸 PBS 清洗电极，将蛋放入培养箱中孵育所需时间。电穿孔后两天至三天，胚胎存活率约为 90%，电穿孔后 12 天存活率降至约 50%。为了制备后脑的平铺切片，需小心解剖胚胎，将其从周围的膜和血管中分离出来。将胚胎置于含有 PBS 的小型硅化培养皿中，使胚胎背面向上。使用钨针将其固定在培养皿上。然后使用锋利的玻璃毛细管，用尖头镊子和显微剪刀在后脑的背侧顶板上做一个切口。抓住头部的上部，从头端到尾端非常小心地牵拉出后脑组织。分离后脑后，去除残留的腹侧组织。将后脑置于4%多聚甲醛（PFA）溶液中，在室温下孵育一至两小时。随后用PBT洗涤以去除PFA。按照文本方案中所述的免疫荧光制备步骤操作后，将后脑背侧朝上放置在载玻片上。在后脑组织上滴加荧光封片介质，并使用玻璃毛细管或钨针将后脑在载玻片上压平。在盖玻片的每个角落添加少量封片油，以防止盖玻片压迫组织。小心地将盖玻片覆盖在后脑上，避免产生气泡以确保贴合。在盖玻片边缘涂抹指甲油固定。脑干的冷冻切片可在 E 6.5 之后的任何发育阶段进行。由于在整体胚胎标本中轴突难以观察，且胚胎整体较厚，因此应优先采用切片方法。此外，要观察突触连接，必须对组织进行切片，并在显微镜下使用高倍镜观察。为制备冷冻切片样品，需解剖胚胎并去除脑组织周围的所有其他组织。用PBS冲洗。然后使用微型剪刀和尖头镊子在延髓的脑桥区域切开胚胎。在小脑与中脑之间做一宽切口，并完整移除整个脑干。组织应包含延髓、脑桥和小脑。在以下示例中，一个在菱脑检查区中间神经元DA1亚群中表达的增强子元件被克隆至Cre重组酶的上游，并与一个依赖Cre的细胞质GFP报告质粒共电穿孔。在E4.5阶段进行整体装片制备，可观察到两条对侧上行轴突投射模式，用于描绘DA1中间神经元在发育后期的轴突投射路径。将一个pre-con非条件性GFP报告基因盒克隆到两个piggyback臂之间，同时包含A TOH一个creen增强子和转座子载体。利用该策略，电穿孔后的C precon条件性MG FP被整合到鸡的染色体中，从而仅在D一个神经元中移除终止盒，实现GFP的长期表达。在DA一个细胞中。GFP 的甲磺酰化形式使其与膜结合，从而定位于轴突膜上，而不是在细胞质中扩散。在 E 13.5 期收集的脑干组织，经矢状切面分析发现，多巴胺能神经元的轴突在小脑中聚集，并向外部颗粒层（EGL）延伸，该层由 ZI-1 阳性细胞标记。还分析了D型轴突在小脑中的突触靶点。在E2.75胚胎中电转染突触小泡蛋白2报告质粒，同时转入Hone Cree增强子和piggyback转座子。该方法可实现GFP报告基因在DA型轴突终末突触前的表达。在E 13.5时期对小脑进行切片，并使用通用突触前标记物synaptic taman以及标记bikini层的calbindin进行染色。该切片的高倍镜视野显示，在包括bikini层在内的多个小脑区域中，SV2 GFP阳性突触小泡呈阳性。该结果揭示了小脑中DA1 hind brainin中间神经元的突触连接。观看本视频后，您应充分了解如何在胚胎发育第2.75天将DNA电穿孔转入禽类哈因克氏区（Hein），以特异性标记一部分神经元细胞。该技术可实现对已标记神经元细胞的轴突投射及突触连接在多个发育阶段进行追踪观察。

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