Name: Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a avaliar a citocompatibilidade de sistemas de liberação de fármacos usando ensaio de hemólise ex vivo com hemácias como modelo de membrana endossomal. Este método quantifica a atividade endossomolítica em diferentes valores de pH.

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Os autores reconhecem o financiamento através do Departamento de Defesa pelo Congresso dirigiu programas de Investigação Médica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) e American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparação e Esterilização de Buffers e agentes de teste <ol><li> 150 mM de NaCl: Dissolver 4,383 g de cristais de NaCl em 500 ml de água nanopura. </li><li> Os tampões de pH: Preparar tampão fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, e 7,4 por mistura de quantidades apropriadas de fosfato monobásico e fosfato de sódio dibásico. Se as amostras são testadas a valores de pH mais baixos (isto é, pH &lt;5,6), em seguida, um tampão mais apropriado, tal como tampão de citrato, deve ser usado. Receitas tampão estão facilmente disponíveis, e um exemplo de referência tenha sido fornecido aqui 12. </li><li> Esterilizar todos os buffers acima indicadas através de um aparelho de filtração garrafa-top vácuo e re-check tampão pH. </li><li> 20% de Triton X-100 (testemunha positiva): Misturar 20 ml puro Triton X-100 em 80 ml de água nanopura. Vortex vigorosamente e sonicar a dissolver-se. Deixar a temperatura ambiente durante a noite antes da utilização. </li></ol> 2. Preparação de eritrócitos <ol><li> Obter 25 ml de sangue from um anônimo doador humano, elaborado diretamente em tubos de K 2-EDTA revestidos Vacutainer para impedir a coagulação. </li></ol> NOTA: Todos os procedimentos devem ser pré-aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional apropriado (IRB), e punção venosa e coleta de sangue deve ser realizada por um flebotomista treinado, a fim de minimizar o risco para o doador. Os procedimentos padrão de flebotomia ter sido publicado anteriormente 13. <ol start="2"><li> Centrifugar o sangue a 500 xg durante 5 min, e os níveis de hematócrito marca (vermelho, a camada inferior) e de plasma (camada superior amarelada) no tubo. </li><li> Aspirar plasma suavemente através de uma micropipeta, adicionar em água sanitária, e descartar em resíduos com risco biológico. </li><li> Encher o tubo hematócrito a linha marcada (nível original de plasma) com 150 mM de solução de NaCl. Cap e inverter algumas vezes para misturar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Repita o passo 2,3-2,4 para lavar as células do sangue novamente. Em seguida, aspire supernatformiga e substituir com PBS a pH 7,4. Inverter para misturar. </li><li> Dividir sangue uniformemente em quatro tubos, correspondendo a cada pH que será testado. Rotular os tubos de acordo com cada valor de pH a ser testado (5.6, 6.2, 6.8, 7.4). </li><li> Centrifugar os tubos de sangue a 500 xg durante 5 min. Marcar níveis em tubos, em seguida, aspirar o sobrenadante. </li><li> Encher cada tubo de linha marcada com tampão de pH apropriado (como indicado em 2.6). </li><li> Etiqueta quatro tubos de 50 ml (um por pH de teste), e pipeta de 49 ml de PBS de pH apropriado para cada tubo cónico. </li><li> Adicionar 1 ml de eritrócitos (mesmo pH) para dentro do tubo correspondente para uma diluição de 1:50. Inspecionar visualmente o sangue diluído, que deve ser turva e vai resolver, se deixado em repouso. Se nenhuma forma de pelotas, as células têm lisadas. </li></ol> 3. Lise Ensaio 96 Configuração da Bem e Quantificação <ol><li> Preparar soluções de reserva de todos os agentes de entrega de droga experimental, a 20x a concentração final desejada para ser testado (Ensaioterá 10 ul de agente de entrega de droga + 190 ul diluídas células vermelhas do sangue, conduzindo a uma diluição de 1/20 do original de agente de libertação de fármacos para a mistura de ensaio final). Os estoques de 20, 100, e 800 ug / ml são sugeridas, resultando em concentrações de ensaio finais de 1, 5, e 40 ug / ml, respectivamente. </li><li> Pipetar 10 ul de cada solução de estoque em Fundo em V de 96 poços. Para melhores resultados, coloque cada amostra em triplicado ou quadruplicado. </li></ol> NOTA: Para facilidade, recomenda-se que uma placa de 96 poços separada deve ser preparada para cada pH a ser testado, com cada uma das amostras (a cada concentração) carregado com n = 3-4 por prato. <ol start="3"><li> Para poços de controlo positivo, adicionar 10 ul de Triton X-20% 100. </li><li> Para poços de controlo negativo, adicionam-se 10 ul de tampão de fosfato. Utilize uma solução tampão ao mesmo pH a ser testado. </li><li> Pipete 190 pi de eritrócitos diluídas (ver 2.10) a cada poço, tornando solução stock certeza célula permanecehomogénea durante a transferência. Dica: Use uma pipeta multi-canal para simplificar essa tarefa. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante uma hora (Opcional: Utilizar um agitador orbital ou oscilante). </li><li> Centrifugar as placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrócitos intactos pelota. Nota: durante a remoção da placa da centrífuga e transportá-lo para o passo seguinte, manusear com cuidado e ter a certeza de não perturbar o sedimento celular. </li><li> Utilizando uma pipeta multicanal, transferir 100 ul do sobrenadante de cada poço para uma clara, de fundo chato de placas de 96 poços. Observação: se o sedimento de células foi acidentalmente perturbado por qualquer amostra (s), pode-se re-centrifugar a placa e, em seguida, proceder à transferência de sobrenadante. </li><li> Medir a absorvância do sobrenadante com um leitor de placas. Note-se que uma gama de comprimentos de onda podem ser utilizados (400 - 541 nm). </li></ol> NOTA: leitores de placas diferentes podem ter pontos de saturação e sensibilidades diferentes, para a escolha de um comprimento de onda para measurements depende ou não de dados de hemólise de amostras experimentais podem ser confiavelmente normalizado contra hemólise máximo induzido por tratamento com detergente. Isto requer uma medição precisa dos valores de absorvância das amostras de controlo positivo. <ol start="10"><li> Usando o Microsoft Excel ou um software de análise de dados semelhante, encontre a média das leituras de absorvência de fundo a partir das amostras de controlo negativo criados para cada pH (passo 3.4). Subtrair o valor de absorvância de fundo a partir de todas as outras amostras que foram medidas naquele pH. </li><li> Após subtracção do fundo, encontrar a absorvência média do controlo positivo detergente tratados com amostras (passo 3.3.) Então normalizar todos os pontos de dados experimentais, para este valor de absorvância média, a qual deve representar 100% de hemólise. Finalmente, multiplicar cada valor bem por 100% para calcular% de hemólise, que ocorreu em cada poço individual em relação ao controlo de detergente. </li></ol>

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</ol>

Aprovação IRB: Procedimentos que envolvem seres humanos tenham sido aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Vanderbilt (IRB; Protocolo # 111251). Não há conflitos de interesse declarados.

pH-responsivos polímeros ou outros agentes destinados a função endosomolytic pode ser rápida e eficazmente rastreados com base na lise de células vermelhas do sangue em valores de pH encontrados no endossoma (Figura 1, pH 6,8 - endossomo precoce, a pH 6,2 - endossoma tardio, pH 5,6 - lisossoma). 14-17 hemólise dependente do pH foi usado para analisar a capacidade de mediar a libertação transportadoras endossomal da terapêutica biomacromolecular péptidos (por exemplo, siRNA, ODNs, pro...

Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. 1 No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima 2. Recentemente, um certo número de materiais foram especificamente concebidos para aproveitar a acidificação dos endossomas para facilitar a entrega citosólica da sua carga. Um exemplo desta abordagem utiliza sintéticos, as nanopartículas de polímeros de micelas cujo núcleo é zwitteriónicos e carga neutra a um pH fisiológico (isto é, 7.4). No entanto, a pH 6,0- 6,5, os polímeros tornam-se protonado e adquirem uma carga positiva, que desestabiliza o núcleo micelar, e os segmentos de polímeros expostos interagir com e romper a membrana endossomal. Esta actividade tem sido mostrado para promover a fuga endossomal de péptidos e ácidos nucleicos baseados em terapêutica, o que lhes permite aceder aos seus alvos citosólicas. 3,4 Outros exemplos de métodos desenvolvidos para mediar fuga endossomal que interromper a barreira da membrana incluem as &quot;&quot; péptidos fusogénicos ou proteínas que podem mediar a fusão da membrana, ou a formação de poros transientes na bicamada fosfolipídica. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo, tais como poli (ácido propylacrylic) são outra abordagem bem estudada e, nestes polímeros, o estado de protonação do ácido carboxílico pendente dita transição em um hidrofóbico, estado da membrana disruptiva em gamas de endo-lisossomais pH 6,7. Um sistema modelo útil para a triagem comportamento endosomolytic é o e-x dependente do pH in vivo ensaio de hemólise. 8 Neste sistema modelo, a membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. Este modelo generalizável tem sido utilizado por outros para avaliar o comportamento de células endosomolytic penetrantes péptidos e outros sistemas de entrega de genes poliméricos. 8-11 Nesta experiência, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pH definidos que imitam extracelulares (7,4), no início endossomais (6,8), e no final endo-lisossomal (&lt;6,8) ambientes. A quantidade de hemoglobina libertada durante o período de incubação é quantificada como uma medida da lise dos glóbulos vermelhos, que é normalizado para a quantidade de hemoglobina libertada nas amostras de controlo positivo lisadas com detergente. De rastreio de uma pequena biblioteca de materiais de teste potencialmente endosomolytic, pode-se inferir que as amostras que não produzem hemólise, a pH 7,4, mas bainha significativamente elevadosolysis a pH &lt;6,5, serão os candidatos mais eficazes e cytocompatible para a entrega da droga citosólica. Os materiais que se enquadram nestes critérios seria de esperar que permanecem inertes e não indiscriminadamente destruir bicamadas lipídicas (isto é, que poderia causar a citotoxicidade) até serem expostos a uma queda no pH local na sequência de internalização em endo-lisossomais compartimentos. Neste protocolo, os eritrócitos são isoladas a partir de um dador humano e co-incubou-se a pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 com experimentais agentes de entrega de droga endosomolytic. Eritrócitos intactos são sedimentadas e os sobrenadantes (que contêm hemoglobina libertada a partir de eritrócitos lisados) são analisadas para a característica de absorção de hemoglobina através de um leitor de placa (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sangue agulhas para coleta, 20,5 calibre- </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tubo Adaptador Titular / Agulha </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Marca álcool isopropílico Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Para coleta de sangue </td&gt; </tr><tr><td> Ácido clorídrico (cone.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Para o ajuste do pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Controle positivo </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 estéril Unidade de frascos de filtro descartável com SFCA Membrana </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740 44A- </td><td></td></tr><tr><td> BD placas de 96 poços, de fundo chato de poliestireno tecido, a cultura tratada com </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772 2C- </td><td> Por placa de leitura no final do ensaio. </td></tr><tr><td> BD placas de 96 poços, de fundo redondo de poliestireno de tecido, a cultura tratada com </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Por incubação de células vermelhas do sangue com agentes experimentais. </td></tr></table&gt;

ex vivo blood red ensaio hemólise celular de avaliação de ph-responsivos agentes endosomolytic para entrega citosólico de drogas biomacromolecular

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Bicamadas de fosfolipídios que formam endo-lisossômico vesículas podem representar uma barreira para a entrega de medicamentos biológicos para alvos intracelulares. Para ultrapassar esta barreira, uma série de transportadores de drogas sintéticas têm sido desenvolvidos para a perturbação activa da membrana endossomal e entregar a carga para dentro do citoplasma. Aqui, nós descrevemos o ensaio de hemólise, a qual pode ser usada como uma rápida, tela de alto rendimento para a actividade e cytocompatibility endosomolytic de sistemas de entrega de drogas intracelulares. No ensaio de hemólise, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pHs definidos que imitam extracelulares, cedo endossomais e lisossomais tarde endo-ambientes. Após um passo de centrifugação a pelota intactas as células vermelhas do sangue, a quantidade de hemoglobina libertada para o meio é medida por espectrofotometria (405 nm para melhor a gama dinâmica). A interrupção por cento de glóbulos vermelhos é então quantificada em relação ao controle positivo samples lisadas com detergente. Neste sistema modelo da membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. O resultado desejado é a hemólise insignificante a um pH fisiológico (7,4) e hemólise robusto na gama de pH a partir de endo-lisossomal aproximadamente pH 5-6,8.

<html> Tipicamente, os agentes que exibem um comportamento dependente do pH ideal hemolítica têm o maior potencial para a entrega de drogas citosólica, ácidos nucleicos ou outras moléculas bioactivas. Isto é exemplificado pelo agente # 1, como mostrado na Figura 2, o qual exibe a hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (&lt;6,5). Alguns agentes podem exibir níveis significativos de comportamento hemolítica em gamas de pH fisiológ...

Um ensaio de hemólise podem ser usados ​​como um meio rápido, tela de alto rendimento de cytocompatibility sistemas de entrega de drogas e atividade endosomolytic para entrega intracelular de carga. O ensaio mede a ruptura das membranas dos eritrócitos em função do pH do meio ambiente.

Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar quantitativamente o potencial de ruptura da membrana de vetores de entrega de fármacos para a entrega intracelular de biológicos, utilizando glóbulos vermelhos como modelo biológico da membrana endossomal. Este vídeo foi produzido pelo Laboratório de Terapêutica Avançada da Universidade Vanderbilt. Todos os procedimentos envolvendo seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Vanderbilt.Primeiramente, uma breve introdução ao endossomo, hemólise e hemólise. Os transportadores de produtos biológicos são internalizados pelas células em endossomos por meio de endocitose não específica ou mediada por receptores. Após a endocitose.A carga é degradada nos lisossomos ou transportada para exocitose de volta ao espaço extracelular. Como mostrado, no entanto, a diminuição do pH em um endossomo pode ser aproveitada com veículos de fármacos sensíveis ao pH, que, devido ao ambiente ácido, se tornam disruptores da membrana, criando poros fisicamente e/ou desestabilizando a membrana endossomal; com o endossomo rompido, a carga do fármaco pode ser liberada no citoplasma e difundir-se até os locais-alvo no citoplasma, mitocôndrias ou

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Este vídeo descreve um ensaio in vitro para determinar a hemólise ou lise de glóbulos vermelhos induzida por ionóforo de cálcio em uma amostra humana. O ensaio mede a porcentagem de hemólise quantificando a hemoglobina liberada pelos eritrócitos rompidos.

Ensaio de hemólise: um método in vitro para medir a lise induzida por ionóforo de cálcio em eritrócitos humanos

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de ligação da Anexina V para medir o grau de eriptose, morte celular programada por eritrócitos, usando coloração fluorescente com Anexina V. Os eritrócitos apoptóticos demonstram translocação de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana celular, fazendo com que a Anexina V marcada com fluoróforo se ligue à fosfatidilserina translocada, emitindo assim um sinal fluorescente.

Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a eficiência de reselamento da membrana plasmática em células de mamíferos. As células são expostas a uma toxina bacteriana formadora de poros, que forma poros na membrana celular. Na presença de íons de cálcio extracelulares, o poro causa influxo de cálcio, induzindo eventos de resselamento da membrana. A eficiência de reselagem é avaliada usando corante de iodeto de propídio de ligação ao DNA, que só entra nas células sem uma membrana resselada.

Um ensaio baseado em fluorescência in vitro para medir a eficiência de resselamento da membrana plasmática

Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

mitocôndrias de células endoteliais são fundamentais para manter a integridade do cérebro-barreira sangue. Nós introduzimos um protocolo para medir a função bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais.

Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

Este trabalho apresenta um fluxo de trabalho de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, bem como o potencial e morfologia da membrana mitocondrial, denominados conjuntamente como morfofunção mitocondrial, em células vivas aderentes, 6) -clorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM-H 2 DCFDA) e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Um protocolo para a indução da eritupse, a morte celular programada em eritrócitos, usando o ionóforo de cálcio, ionomicina, é fornecido. A eittose bem-sucedida é avaliada monitorando a fosfateina da localização no folheto exterior da membrana. Foram examinados fatores que afetam o sucesso do protocolo e condições ideais fornecidas.

Indução de eryptose em glóbulos vermelhos usando um ionóforo de cálcio

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Aprenda a avaliar a citocompatibilidade de sistemas de liberação de fármacos usando ensaio de hemólise ex vivo com hemácias como modelo de membrana endossomal. Este método quantifica a atividade endossomolítica em diferentes valores de pH.

Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular (Vídeo) | JoVE Journal

Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

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