Name: Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a avaliar a citocompatibilidade de sistemas de liberação de fármacos usando ensaio de hemólise ex vivo com hemácias como modelo de membrana endossomal. Este método quantifica a atividade endossomolítica em diferentes valores de pH.

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Os autores reconhecem o financiamento através do Departamento de Defesa pelo Congresso dirigiu programas de Investigação Médica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) e American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparação e Esterilização de Buffers e agentes de teste <ol><li> 150 mM de NaCl: Dissolver 4,383 g de cristais de NaCl em 500 ml de água nanopura. </li><li> Os tampões de pH: Preparar tampão fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, e 7,4 por mistura de quantidades apropriadas de fosfato monobásico e fosfato de sódio dibásico. Se as amostras são testadas a valores de pH mais baixos (isto é, pH &lt;5,6), em seguida, um tampão mais apropriado, tal como tampão de citrato, deve ser usado. Receitas tampão estão facilmente disponíveis, e um exemplo de referência tenha sido fornecido aqui 12. </li><li> Esterilizar todos os buffers acima indicadas através de um aparelho de filtração garrafa-top vácuo e re-check tampão pH. </li><li> 20% de Triton X-100 (testemunha positiva): Misturar 20 ml puro Triton X-100 em 80 ml de água nanopura. Vortex vigorosamente e sonicar a dissolver-se. Deixar a temperatura ambiente durante a noite antes da utilização. </li></ol> 2. Preparação de eritrócitos <ol><li> Obter 25 ml de sangue from um anônimo doador humano, elaborado diretamente em tubos de K 2-EDTA revestidos Vacutainer para impedir a coagulação. </li></ol> NOTA: Todos os procedimentos devem ser pré-aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional apropriado (IRB), e punção venosa e coleta de sangue deve ser realizada por um flebotomista treinado, a fim de minimizar o risco para o doador. Os procedimentos padrão de flebotomia ter sido publicado anteriormente 13. <ol start="2"><li> Centrifugar o sangue a 500 xg durante 5 min, e os níveis de hematócrito marca (vermelho, a camada inferior) e de plasma (camada superior amarelada) no tubo. </li><li> Aspirar plasma suavemente através de uma micropipeta, adicionar em água sanitária, e descartar em resíduos com risco biológico. </li><li> Encher o tubo hematócrito a linha marcada (nível original de plasma) com 150 mM de solução de NaCl. Cap e inverter algumas vezes para misturar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Repita o passo 2,3-2,4 para lavar as células do sangue novamente. Em seguida, aspire supernatformiga e substituir com PBS a pH 7,4. Inverter para misturar. </li><li> Dividir sangue uniformemente em quatro tubos, correspondendo a cada pH que será testado. Rotular os tubos de acordo com cada valor de pH a ser testado (5.6, 6.2, 6.8, 7.4). </li><li> Centrifugar os tubos de sangue a 500 xg durante 5 min. Marcar níveis em tubos, em seguida, aspirar o sobrenadante. </li><li> Encher cada tubo de linha marcada com tampão de pH apropriado (como indicado em 2.6). </li><li> Etiqueta quatro tubos de 50 ml (um por pH de teste), e pipeta de 49 ml de PBS de pH apropriado para cada tubo cónico. </li><li> Adicionar 1 ml de eritrócitos (mesmo pH) para dentro do tubo correspondente para uma diluição de 1:50. Inspecionar visualmente o sangue diluído, que deve ser turva e vai resolver, se deixado em repouso. Se nenhuma forma de pelotas, as células têm lisadas. </li></ol> 3. Lise Ensaio 96 Configuração da Bem e Quantificação <ol><li> Preparar soluções de reserva de todos os agentes de entrega de droga experimental, a 20x a concentração final desejada para ser testado (Ensaioterá 10 ul de agente de entrega de droga + 190 ul diluídas células vermelhas do sangue, conduzindo a uma diluição de 1/20 do original de agente de libertação de fármacos para a mistura de ensaio final). Os estoques de 20, 100, e 800 ug / ml são sugeridas, resultando em concentrações de ensaio finais de 1, 5, e 40 ug / ml, respectivamente. </li><li> Pipetar 10 ul de cada solução de estoque em Fundo em V de 96 poços. Para melhores resultados, coloque cada amostra em triplicado ou quadruplicado. </li></ol> NOTA: Para facilidade, recomenda-se que uma placa de 96 poços separada deve ser preparada para cada pH a ser testado, com cada uma das amostras (a cada concentração) carregado com n = 3-4 por prato. <ol start="3"><li> Para poços de controlo positivo, adicionar 10 ul de Triton X-20% 100. </li><li> Para poços de controlo negativo, adicionam-se 10 ul de tampão de fosfato. Utilize uma solução tampão ao mesmo pH a ser testado. </li><li> Pipete 190 pi de eritrócitos diluídas (ver 2.10) a cada poço, tornando solução stock certeza célula permanecehomogénea durante a transferência. Dica: Use uma pipeta multi-canal para simplificar essa tarefa. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante uma hora (Opcional: Utilizar um agitador orbital ou oscilante). </li><li> Centrifugar as placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrócitos intactos pelota. Nota: durante a remoção da placa da centrífuga e transportá-lo para o passo seguinte, manusear com cuidado e ter a certeza de não perturbar o sedimento celular. </li><li> Utilizando uma pipeta multicanal, transferir 100 ul do sobrenadante de cada poço para uma clara, de fundo chato de placas de 96 poços. Observação: se o sedimento de células foi acidentalmente perturbado por qualquer amostra (s), pode-se re-centrifugar a placa e, em seguida, proceder à transferência de sobrenadante. </li><li> Medir a absorvância do sobrenadante com um leitor de placas. Note-se que uma gama de comprimentos de onda podem ser utilizados (400 - 541 nm). </li></ol> NOTA: leitores de placas diferentes podem ter pontos de saturação e sensibilidades diferentes, para a escolha de um comprimento de onda para measurements depende ou não de dados de hemólise de amostras experimentais podem ser confiavelmente normalizado contra hemólise máximo induzido por tratamento com detergente. Isto requer uma medição precisa dos valores de absorvância das amostras de controlo positivo. <ol start="10"><li> Usando o Microsoft Excel ou um software de análise de dados semelhante, encontre a média das leituras de absorvência de fundo a partir das amostras de controlo negativo criados para cada pH (passo 3.4). Subtrair o valor de absorvância de fundo a partir de todas as outras amostras que foram medidas naquele pH. </li><li> Após subtracção do fundo, encontrar a absorvência média do controlo positivo detergente tratados com amostras (passo 3.3.) Então normalizar todos os pontos de dados experimentais, para este valor de absorvância média, a qual deve representar 100% de hemólise. Finalmente, multiplicar cada valor bem por 100% para calcular% de hemólise, que ocorreu em cada poço individual em relação ao controlo de detergente. </li></ol>

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</ol>

Aprovação IRB: Procedimentos que envolvem seres humanos tenham sido aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Vanderbilt (IRB; Protocolo # 111251). Não há conflitos de interesse declarados.

pH-responsivos polímeros ou outros agentes destinados a função endosomolytic pode ser rápida e eficazmente rastreados com base na lise de células vermelhas do sangue em valores de pH encontrados no endossoma (Figura 1, pH 6,8 - endossomo precoce, a pH 6,2 - endossoma tardio, pH 5,6 - lisossoma). 14-17 hemólise dependente do pH foi usado para analisar a capacidade de mediar a libertação transportadoras endossomal da terapêutica biomacromolecular péptidos (por exemplo, siRNA, ODNs, pro...

Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. 1 No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima 2. Recentemente, um certo número de materiais foram especificamente concebidos para aproveitar a acidificação dos endossomas para facilitar a entrega citosólica da sua carga. Um exemplo desta abordagem utiliza sintéticos, as nanopartículas de polímeros de micelas cujo núcleo é zwitteriónicos e carga neutra a um pH fisiológico (isto é, 7.4). No entanto, a pH 6,0- 6,5, os polímeros tornam-se protonado e adquirem uma carga positiva, que desestabiliza o núcleo micelar, e os segmentos de polímeros expostos interagir com e romper a membrana endossomal. Esta actividade tem sido mostrado para promover a fuga endossomal de péptidos e ácidos nucleicos baseados em terapêutica, o que lhes permite aceder aos seus alvos citosólicas. 3,4 Outros exemplos de métodos desenvolvidos para mediar fuga endossomal que interromper a barreira da membrana incluem as &quot;&quot; péptidos fusogénicos ou proteínas que podem mediar a fusão da membrana, ou a formação de poros transientes na bicamada fosfolipídica. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo, tais como poli (ácido propylacrylic) são outra abordagem bem estudada e, nestes polímeros, o estado de protonação do ácido carboxílico pendente dita transição em um hidrofóbico, estado da membrana disruptiva em gamas de endo-lisossomais pH 6,7. Um sistema modelo útil para a triagem comportamento endosomolytic é o e-x dependente do pH in vivo ensaio de hemólise. 8 Neste sistema modelo, a membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. Este modelo generalizável tem sido utilizado por outros para avaliar o comportamento de células endosomolytic penetrantes péptidos e outros sistemas de entrega de genes poliméricos. 8-11 Nesta experiência, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pH definidos que imitam extracelulares (7,4), no início endossomais (6,8), e no final endo-lisossomal (&lt;6,8) ambientes. A quantidade de hemoglobina libertada durante o período de incubação é quantificada como uma medida da lise dos glóbulos vermelhos, que é normalizado para a quantidade de hemoglobina libertada nas amostras de controlo positivo lisadas com detergente. De rastreio de uma pequena biblioteca de materiais de teste potencialmente endosomolytic, pode-se inferir que as amostras que não produzem hemólise, a pH 7,4, mas bainha significativamente elevadosolysis a pH &lt;6,5, serão os candidatos mais eficazes e cytocompatible para a entrega da droga citosólica. Os materiais que se enquadram nestes critérios seria de esperar que permanecem inertes e não indiscriminadamente destruir bicamadas lipídicas (isto é, que poderia causar a citotoxicidade) até serem expostos a uma queda no pH local na sequência de internalização em endo-lisossomais compartimentos. Neste protocolo, os eritrócitos são isoladas a partir de um dador humano e co-incubou-se a pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 com experimentais agentes de entrega de droga endosomolytic. Eritrócitos intactos são sedimentadas e os sobrenadantes (que contêm hemoglobina libertada a partir de eritrócitos lisados) são analisadas para a característica de absorção de hemoglobina através de um leitor de placa (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sangue agulhas para coleta, 20,5 calibre- </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tubo Adaptador Titular / Agulha </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Marca álcool isopropílico Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Para coleta de sangue </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Para coleta de sangue </td&gt; </tr><tr><td> Ácido clorídrico (cone.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Para o ajuste do pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Controle positivo </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 estéril Unidade de frascos de filtro descartável com SFCA Membrana </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740 44A- </td><td></td></tr><tr><td> BD placas de 96 poços, de fundo chato de poliestireno tecido, a cultura tratada com </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772 2C- </td><td> Por placa de leitura no final do ensaio. </td></tr><tr><td> BD placas de 96 poços, de fundo redondo de poliestireno de tecido, a cultura tratada com </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Por incubação de células vermelhas do sangue com agentes experimentais. </td></tr></table&gt;

ex vivo blood red ensaio hemólise celular de avaliação de ph-responsivos agentes endosomolytic para entrega citosólico de drogas biomacromolecular

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Bicamadas de fosfolipídios que formam endo-lisossômico vesículas podem representar uma barreira para a entrega de medicamentos biológicos para alvos intracelulares. Para ultrapassar esta barreira, uma série de transportadores de drogas sintéticas têm sido desenvolvidos para a perturbação activa da membrana endossomal e entregar a carga para dentro do citoplasma. Aqui, nós descrevemos o ensaio de hemólise, a qual pode ser usada como uma rápida, tela de alto rendimento para a actividade e cytocompatibility endosomolytic de sistemas de entrega de drogas intracelulares. No ensaio de hemólise, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pHs definidos que imitam extracelulares, cedo endossomais e lisossomais tarde endo-ambientes. Após um passo de centrifugação a pelota intactas as células vermelhas do sangue, a quantidade de hemoglobina libertada para o meio é medida por espectrofotometria (405 nm para melhor a gama dinâmica). A interrupção por cento de glóbulos vermelhos é então quantificada em relação ao controle positivo samples lisadas com detergente. Neste sistema modelo da membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. O resultado desejado é a hemólise insignificante a um pH fisiológico (7,4) e hemólise robusto na gama de pH a partir de endo-lisossomal aproximadamente pH 5-6,8.

<html> Tipicamente, os agentes que exibem um comportamento dependente do pH ideal hemolítica têm o maior potencial para a entrega de drogas citosólica, ácidos nucleicos ou outras moléculas bioactivas. Isto é exemplificado pelo agente # 1, como mostrado na Figura 2, o qual exibe a hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (&lt;6,5). Alguns agentes podem exibir níveis significativos de comportamento hemolítica em gamas de pH fisiológ...

Um ensaio de hemólise podem ser usados ​​como um meio rápido, tela de alto rendimento de cytocompatibility sistemas de entrega de drogas e atividade endosomolytic para entrega intracelular de carga. O ensaio mede a ruptura das membranas dos eritrócitos em função do pH do meio ambiente.

Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar quantitativamente o potencial de ruptura da membrana de vetores de entrega de fármacos para a entrega intracelular de biológicos, utilizando glóbulos vermelhos como modelo biológico da membrana endossomal. Este vídeo foi produzido pelo Laboratório de Terapêutica Avançada da Universidade Vanderbilt. Todos os procedimentos envolvendo seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Vanderbilt.Primeiramente, uma breve introdução ao endossomo, hemólise e hemólise. Os transportadores de produtos biológicos são internalizados pelas células em endossomos por meio de endocitose não específica ou mediada por receptores. Após a endocitose.A carga é degradada nos lisossomos ou transportada para exocitose de volta ao espaço extracelular. Como mostrado, no entanto, a diminuição do pH em um endossomo pode ser aproveitada com veículos de fármacos sensíveis ao pH, que, devido ao ambiente ácido, se tornam disruptores da membrana, criando poros fisicamente e/ou desestabilizando a membrana endossomal; com o endossomo rompido, a carga do fármaco pode ser liberada no citoplasma e difundir-se até os locais-alvo no citoplasma, mitocôndrias ou núcleo. Neste ensaio, eritrócitos são utilizados como modelo da membrana endossomal em pH fisiológico.Os veículos ideais de entrega permanecerão estáveis e não perturbarão a membrana do glóbulo vermelho. No entanto, ao diminuir o pH, o veículo de entrega se tornará instável, resultando em interações hidrofóbicas que destroem a membrana do glóbulo vermelho, liberando a hemoglobina. A hemoglobina pode então ser isolada dos glóbulos vermelhos e quantificada espectrofotometricamente por meio da absorbância em 405, 450 ou 541 nanômetros.Valores mais altos de absorbância correlacionarão-se com comportamento endolítico mais potente. Isso pode ser visualizado por microscopia com lapso de tempo em pH fisiológico. As hemácias permanecem estáveis na presença do veículo do fármaco.No entanto, em um pH mais baixo característico da via endossomal, os veículos de entrega rompem e destroem rapidamente as membranas das hemácias. Os materiais necessários para este estudo incluem cloreto de sódio 150 milimolar, preparado com 500 mililitros de água deionizada e 4,383 gramas de cloreto de sódio, filtrado esterilmente por meio de um aparato de filtração a vácuo com frasco de boca larga. Em seguida, soluções de salina tamponada com fosfato nos pH 7,4, 6,8, 6,2 e 5,6 foram preparadas pela mistura das quantidades adequadas de tampões fosfato monossódico e dissódico e filtradas esterilmente utilizando um aparato de filtração a vácuo com frasco de boca larga.O pH foi monitorado com um medidor de pH e ou tiras de pH, utilizando vários métodos para garantir a precisão das medições. O Triton X 20% foi preparado dissolvendo 20 mililitros de Triton X-102 em 80 mililitros de água nano pura, agitando vigorosamente e sonicando para dissolver após a aprovação do comitê de ética em pesquisa. Solicite ao seu enfermeiro do estudo ou ao flebotomista que colete 25 mililitros de sangue total de um doador anônimo em tubos a vácuo revestidos com EDTA potássico para prevenir a coagulação.Neste vídeo, é utilizada uma agulha de coleta de 20,5 gauge conectada a um adaptador para vacutainer. O sangue coletado é centrifugado a 500 vezes a gravidade durante cinco minutos. Após a centrifugação, as camadas de plasma e de glóbulos vermelhos devem estar evidentes.Tenha cuidado para não perturbar as camadas agitando. Marque os níveis do plasma e, em seguida, aspire suavemente com uma micropipeta ou aspirador a vácuo e descarte na água sanitária. Substitua o plasma por cloreto de sódio 150 milimolar, completando até a linha marcada.Tampe o tubo e inverta várias vezes para misturar suavemente. Centrifugue pela segunda vez a 500 G durante cinco minutos, seguido pela aspiração do sobrenadante. Substitua o sobrenadante até a marca com cloreto de sódio 150 milimolar e inverta várias vezes para misturar suavemente. Centrifugue pela terceira vez a 500 G durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante e substitua até a marca com PBS de pH 7,4.Divida igualmente a amostra de sangue em quatro tubos. Um para cada pH a ser testado, incluindo o pH fisiológico de 7,4, o pH endossomal precoce de 6,8, o pH endossomal tardio de 6,2 e o pH de endossomo tardio ou lisossomal de 5,8. Repita a centrifugação pela quarta e última vez a 500 G por cinco minutos.Marque os níveis do sobrenadante e aspire suavemente, descartando o sobrenadante em água sanitária. Substitua o sobrenadante por PBS com pH apropriado. Os estoques finais de hemácias são preparados diluindo as soluções estoque 50 vezes em tampão com pH apropriado.Neste caso, um mililitro de hemácias concentradas foi adicionado a 49 mililitros de PBS, invertendo suavemente o frasco várias vezes para misturar as hemácias antes do preparo do sangue. Prepare soluções estoque dos veículos de entrega com concentração 20 vezes maior. Para polímeros, sugerimos 2100 e 800 microgramas por mililitro como concentrações iniciais para testes; após diluição, a concentração final será de 105 e 40 microgramas por mililitro. Para incubação, utilize placas cônicas ou com fundo redondo para que as hemácias intactas possam ser removidas por centrifugação. Pipete 10 microlitros da solução de polímero 20 vezes concentrada em cada poço.Sugerimos amostras em pelo menos triplicata ou quádrupla para otimizar os resultados. O Triton X lisará todas as células e pode ser usado como controle positivo numa concentração final de 1%. PBS em pH 7,4 pode ser usado como controle negativo. Pipete 190 microlitros de hemácias diluídas para cada poço, garantindo que a solução de hemácias seja mantida homogênea, o que pode exigir leve agitação ou mistura para mantê-las em suspensão.Observe que, uma vez adicionadas as hemácias, você já poderá observar o início da lise para compostos extremamente hemolíticos. Incube por uma hora a 37 graus Celsius para permitir a ocorrência da lise após uma hora. Remova as placas para centrifugação e centrifugue as placas a 500 G para sedimentar as hemácias.Em seguida, transfira cuidadosamente 100 microlitros do sobrenadante para uma placa de 96 poços com fundo plano. É fundamental não perturbar o pellet de hemácias, portanto, certifique-se de manipular com cuidado. Meça a absorbância de cada poço com um leitor de placas a 450 nanômetros.Se a hemoglobina estiver muito concentrada e forem obtidas leituras de ABSORBÂNCIA elevadas, as placas também podem ser lidas a 541 nanômetros. Alternativamente, se a hemoglobina estiver muito diluída e forem obtidas leituras de absorbância baixas, as placas podem ser lidas a 405 nanômetros para maximizar a absorbância. Para analisar os dados, o percentual de hemólise pode ser calculado assumindo que o PBS não lisará nenhuma hemácia e que o Triton X lisará 100% das hemácias.A equação apresentada fornecerá a porcentagem de homólise para cada amostra. Programas como o Microsoft Excel podem ser usados para analisar rapidamente experimentos provenientes de centenas de poços. Abaixo estão resultados representativos em várias concentrações ao longo das faixas de pH discutidas.Essa formulação apresenta uma resposta ideal de pH e demonstra não ter atividade hemolítica em pH fisiológico, mas exibe um comportamento de comutação em pH endossomal, resultando em significativa ruptura da membrana, conforme indicado pela seta vermelha. Acabaram de assistir ao vídeo do nosso laboratório descrevendo o ensaio de hemólise de eritrócitos dependente de pH. Este é um ensaio relativamente barato, de fácil utilização e de alto rendimento, que pode ser usado para triagem de bibliotecas combinatórias de séries de polímeros projetados para entrega endolítica de fármacos biológicos.Descobrimos que este ensaio é altamente preditivo para a entrega citosólica e bioatividade de uma variedade de biológicos, incluindo proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos. No entanto, deve-se mencionar que existem algumas limitações potenciais deste ensaio. Acredita-se que seja uma boa ferramenta preditiva para polímeros ou peptídeos que realmente desestabilizem fisicamente a membrana endossomal.No entanto, não é uma boa ferramenta preditiva para ser usada com polímeros ou outros sistemas que atuam por um mecanismo baseado no efeito esponja de prótons. Além disso, deve-se considerar que a composição da bicamada lipídica das hemácias não imita exatamente a das membranas endossomais ou lisossomais. Em termos de composição lipídica e teor de colesterol, deve-se sempre estar preparado para acompanhamento.Qualquer resultado de hemólise de glóbulos vermelhos com técnicas e ensaios complementares. Por exemplo, a microscopia fluorescente utilizada em conjunto com corantes endossomais ou lisossomais pode ser empregada em estudos de colocalização para visualizar a saída de fármacos biológicos das vias endolisossomais. Além disso, a medição da bioatividade ou dos efeitos downstream do fármaco ou biológico entregue deve sempre ser a etapa final.Por fim, lembre-se de sempre manipular e descartar resíduos biológicos perigosos corretamente, conforme definido pela sua instituição. Isso conclui nosso vídeo. Boa sorte em seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve um ensaio in vitro para determinar a hemólise ou lise de glóbulos vermelhos induzida por ionóforo de cálcio em uma amostra humana. O ensaio mede a porcentagem de hemólise quantificando a hemoglobina liberada pelos eritrócitos rompidos.

Ensaio de hemólise: um método in vitro para medir a lise induzida por ionóforo de cálcio em eritrócitos humanos

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de ligação da Anexina V para medir o grau de eriptose, morte celular programada por eritrócitos, usando coloração fluorescente com Anexina V. Os eritrócitos apoptóticos demonstram translocação de fosfatidilserina do folheto interno para o externo da membrana celular, fazendo com que a Anexina V marcada com fluoróforo se ligue à fosfatidilserina translocada, emitindo assim um sinal fluorescente.

Ensaio de ligação de anexina V: uma técnica baseada em fluorescência para identificar eritrócitos apoptóticos por meio da marcação de fosfatidilserina

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Um ensaio baseado em fluorescência in vitro para medir a eficiência de resselamento da membrana plasmática

O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

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Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

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Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

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Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

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Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular (Vídeo) | JoVE Journal

Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

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