Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

O objetivo geral deste procedimento é produzir tumores de forma consistente e rápida na bexiga de camundongos, que podem ser usados para testar terapias contra o câncer de bexiga. Isso é feito primeiro instilando células cancerígenas na bexiga de camundongos usando cateterismo. Oito dias depois, o cateterismo é repetido para instilar um adenovírus que expressa um gene repórter de luciferase.

Então, 24 horas depois, a expressão gênica viral é medida usando um ensaio de luciferase. São obtidos resultados que mostram as condições sob as quais a expressão gênica ideal pode ser alcançada. A demonstração visual dessa técnica é crítica porque as etapas de cateterização e instalação são difíceis de aprender e devido ao potencial de danos à bexiga e/ou vazamento do material instilado.

Dois dias antes da realização do implante celular jogado em frascos T 25, um vezes 10 elevado a seis células MB 49 e alta glicose DMEM suplementado com 10% de FBS no dia do procedimento. Prepare tripsina para instalação usando meio base DMEM para diluir tripsina estéril de grau de cultura de tecidos a 0,25%. Coloque a solução em banho-maria a 37 graus Celsius para equilibrar, pré-aqueça uma almofada de aquecimento e posicione-a sob os cones nasais do sistema de anestesia que será usado para fornecer isof flúor.

Coloque uma almofada absorvente limpa sobre a almofada de aquecimento após anestesiar os ratos com 3% de flúor isof. Faça uma pinça no dedo do pé para verificar o nível de sedação. Coloque-os em decúbito dorsal na almofada de aquecimento e prenda um cone nasal com 2% de flúor.

Use um gel lubrificante não irritante para lubrificar um novo cateter venoso pediátrico estéril 20 4G. Em seguida, remova e descarte a agulha que prende o cubo do cateter. Use o polegar e o indicador da mão oposta para abrir as patas traseiras do mouse e expor o muus uretral.

Insira suavemente o cateter na uretra em um ângulo de 45 graus, alterando o ângulo para um paralelo à bancada para inseri-lo totalmente após a inserção completa. Levante o cateter com cuidado, mantendo-o paralelo à bancada e confirmado visualmente que ele está colocado na uretra e não na vagina, que está abaixo dela. Repita com os demais camundongos anestesiados.

Em seguida, reduza a concentração de flúor para 1%Anexe uma ponta a um pipetador P 200 e remova a urina da bexiga aplicando sucção na extremidade externa do cateter. Remova qualquer urina restante do centro do cateter, descarte a urina e deixe o cateter no lugar Pipete cuidadosamente 80 microlitros das viagens quentes e da solução no centro do cateter. Evitando bolhas de ar.

Conecte uma seringa cheia de ar de um CC ao cubo do cateter e pressione lentamente o êmbolo. 0,1 a 0,2 ccs para administrar a tripsina na bexiga. Deixe os conjuntos de seringa e cateter no lugar por 15 minutos.

Para preparar células para implantação. Remova o meio das células MB 49 previamente plaqueadas e adicione 500 microlitros de 0,25% de tripsina ao frasco. Quando as células se desprendem a cinco mililitros de DMEM completo para ressuspendê-las, remova uma alíquota de 50 microlitros para contar e centrifugue o restante a 1000 RPM por cinco minutos enquanto as células estão girando.

Use um hemocitômetro para contar as células e calcular as células por mililitro, bem como o volume de meio necessário para levar o pellet celular a quatro vezes 10 elevado a seis células por litro. Despeje o sobrenadante das células da centrífuga e resus. Suspenda o pellet em meio base DMEM.

Mantenha as células em temperatura ambiente. Após o tratamento de 15 minutos de viagem, retire a seringa do aeródromo do cateter, deixando-o no lugar. Use um pipetador P 200 para remover qualquer tripsina restante da bexiga por sucção e descarte imediatamente 50 microlitros de suspensão de células MB 49 no centro do cateter.

Em seguida, conecte a seringa cheia de ar CC ao centro do cateter e entregue as células à bexiga pressionando lentamente o êmbolo. 0,1 a 0,2 cc. Deixando o conjunto da seringa do cateter no lugar.

Deixe as células permanecerem na bexiga por 50 minutos. Em seguida, retire cuidadosamente o conjunto da seringa do cateter da uretra. Reduza o isof flúor para 0% e permita que os camundongos se recuperem da anestesia na almofada de aquecimento.

Quando um rato tiver recuperado seu reflexo de escrita, devolva-o à sua gaiola. Cuidado, este protocolo usa adenovírus, que é um agente infeccioso e deve ser tratado sob estritas diretrizes BSL dois. Todos os procedimentos realizados com agentes infecciosos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança institucional da Universidade Médica da Carolina do Sul.

Oito dias após o implante de camundongos com células MB 49, verificou-se hematúria colocando animais individuais sobre um pedaço branco de papel absorvente e pressionando suavemente o abdômen para borrar gotas de urina no papel. A urina rosa a vermelha indica hematúria e é um sinal de que os tumores estabeleceram o descongelamento do estoque de adenovirais no gelo e usam PBS estéril em temperatura ambiente para diluí-lo para 10, para nove ufp por 50 microlitros após anestesiar e cateterizar os camundongos e remover a urina conforme descrito anteriormente neste vídeo, pipetar imediatamente 50 microlitros de suspensão de vírus no centro do cateter, Em seguida, coloque uma seringa cheia de ar e pressione o êmbolo para entregar o vírus à bexiga. Saindo do local de montagem da seringa do cateter, permita que o vírus permaneça na bexiga por 40 minutos.

Em seguida, retire suavemente o conjunto da seringa do cateter da uretra e descarte em solução de alvejante a 10% para inativar qualquer vírus restante. Permita que o camundongo se recupere da anestesia antes de devolvê-lo à gaiola, marque as gaiolas para indicar que os camundongos instilados com o vírus do adenovírus serão eliminados na cama da gaiola por vários dias e todas as gaiolas na cama devem ser manuseadas e desinfetadas adequadamente. A hematúria é observada em quase todos os camundongos dentro de oito dias após a implantação de 200.000 células MB 49, como mostrado aqui.

O peso da bexiga mais que dobra de 34,7 mais ou menos 3,3 miligramas e camundongos sem tumor para 87,5 mais ou menos 19,2 miligramas e camundongos que foram implantados com células MB 49. Em termos de entrega de genes, a imagem de camundongos 24 horas após a instalação viral produz um sinal mais forte do que após 48 horas. A entrega de adenovirais é altamente variável entre os animais, o que deve ser levado em consideração ao planejar o tamanho do grupo para fins estatísticos.

Se um sistema de imagem de pequenos animais não estiver disponível, uma abordagem alternativa para medir a expressão do transgene da luciferase é remover e homogeneizar a bexiga para análise in vitro, conforme demonstrado aqui. A comparação entre a análise in vivo usando o sistema de pequenos animais IVUS 200 e a análise in vitro usando o kit de brilho constante indica excelente correlação entre os conjuntos de dados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cateterizar uma bexiga de camundongo e instilar células tumorais ou agentes terapêuticos.