Name: Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-01T22:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a implantar células MB49 em bexigas de camundongos para criar um modelo ortotópico de carcinoma vesical. Este método permite avaliar terapias gênicas usando vetores adenovirais e ensaios de luciferase.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 CA143505 para Christina Voelkel-Johnson.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisadas e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Medical University of South Carolina. O protocolo foi aprovado sob USDA categoria D para a dor. 1. Implantação celular <ol><li> Dois dias antes de realizar o procedimento, placa 1 x 10 6 MB49 células em frascos T-25. Use alta DMEM glucose suplementado com 10% FBS (e antibióticos, se desejar). Um frasco é suficiente para cada grupo de até cinco ratinhos que serão anestesiados e implantado em paralelo. </li><li> No dia do procedimento, preparam tripsina para instilação diluindo estéril de 0,25% de grau de cultura de tecidos com tripsina a 0,125% com um meio base de DMEM estéril (diluição de 1:2). 1,2 ml é suficiente para 10 ratinhos. Colocar num banho de água a 37 ° C para equilibrar. </li><li> Pré-aquecer uma almofada de aquecimento e posicioná-lo de acordo com as nosecones do sistema de anestesia que vão ser utilizados para entregar isoflurane. Coloque um pano absorvente limpo sobre a almofada de aquecimento. </li><li> Coloque ratos na câmara de indução de anestesia e o sistema de induzir a anestesia com 3% de isoflurano. Quando os ratos perderam a consciência, o que é verificado pela perda do reflexo toe-pitada, transferi-los para os nosecones. Certifique-se que cada animal está em decúbito dorsal e devidamente colocado sobre a almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. </li><li> Reduzir a concentração de isoflurano a 2% para manutenção da anestesia. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos para evitar a secagem. </li><li> Etapa opcional: Remover cabelo abdominal. Cabelo na parte inferior do abdome deve ser removido se in vivo bioluminescente de imagem será realizado. <ol><li> Aplique uma camada generosa de creme depilatório, como Veet, para o menor em um quadrado de pele no abdômen, tomando cuidado para não entrar em contato com a genitália externa. Espere 3 min. </li><li> Remova o cabelo esfregando a área com uma esponja seca, em seguida, usar uma esponja úmida para limpar a pele. Repetir uma vez, se necessário. </li></ol></li><li> Cateterizar a bexiga <ol><li> Lubrifique um novo estéril 24 G cateter venoso, pediátrica com um gel lubrificante não irritante, como KY. Remova e descarte a agulha. Em caso de fuga de líquido ao redor do cateter é um problema comum, ie. que ocorre com mais frequência do que em um dos dez ratinhos, cateteres furo maior (20 g) pode ser utilizado. Esta pode ser uma consideração importante em ratos mais velhos do que 8 semanas. </li><li> Segurando o hub do cateter, use o polegar eo dedo indicador de sua mão oposta para espalhar as pernas traseiras do mouse e expor o meato uretral. Inserir suavemente o cateter na uretra de um ângulo de 45 °, a alteração do ângulo de um paralelo com o banco para inseri-la totalmente. </li><li> Após a inserção completa, levantar o cateter suavemente, mantendo-o paralelamente à bancada, e confirmar visualmente que é colocada na uretra e não a vagina, o que é abaixo. Se correctamente colocado, o cateter irá ser capaz de estar emtotalmente inserida desde a vagina é mais curta do que a uretra. </li><li> Reduzir a concentração de isoflurano a 1%. </li></ol></li><li> Anexar uma ponta de uma pipeta de P200 e remover a urina da bexiga através da aplicação de sucção à extremidade externa do cateter. Remova qualquer urina restante do hub do cateter. Descarte urina e deixar cateter no lugar. </li><li> Pipetagem cuidadosa de 80 mL uma solução de tripsina a 0,125% para o cubo do cateter, evitando bolhas de ar. Anexar uma seringa cheia de ar de 1 ml para o cubo de cateter e deprimir o êmbolo devagar 0,1-0,2 mL para entregar a tripsina na bexiga. </li><li> Deixar a seringa e conjunto de cateter no lugar, durante 15 min. Repita os passos 1,8-1,11 por qualquer um dos restantes ratinhos anestesiados (até 4). Vá para a próxima etapa, durante o período de espera. DICA: Inicialmente, pode ser útil ter alguém para preparar as células (passo 1.12). </li><li> Prepare células MB49 para a implantação. As células foram plaqueadas a 1 x 10 6 por T-25 frascos de 48 horas antes da implantação (passo 1.1). <ol><li> Retirar mídia e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina para o balão. Quando as células destacar adicionar 5 ml de DMEM completo para ressuspender as células. Retirar uma aliquota de 50 ul de contagem, e centrifugar o restante a 1.000 rpm durante 5 min. Durante a fase de centrifugação continuar a passos 1.12.2 e 1.12.3. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Calcular as células / ml. Em seguida o cálculo do volume necessário para trazer o sedimento celular a 4 x 10 6 células / ml (2 x 10 5 células por 50 pi). </li><li> Decantar o sobrenadante das células centrifugadas e ressuspender o sedimento em meio base de DMEM com o volume necessário para suspender as células de 4 x 10 6 células / ml (como calculado na etapa 1.12.2). Manter as células à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Quando o ponto de tempo de 15 minutos para o tratamento de tripsina de bexigas é atingido, retirar a seringa cheia de ar a partir do cateter deixando o cateter no lugar. Tripsina gasto vai normaisly fluir de volta para fora através do cateter. Remova qualquer tripsina restante da bexiga por meio de sucção com a pipeta P200 como no passo 1.9 acima e descarte. </li><li> Imediatamente pipeta 50 ul de suspensão de células MB49 para dentro do cubo de cateter. Fixe a seringa de 1 ml cheia de ar para o hub do cateter e entregar as células da bexiga, pressionando lentamente o êmbolo 0,1-0,2 ml. Repetir esta etapa até quatro vezes adicionais para a implantação todos os cinco ratinhos. Descartar todas as células não utilizadas. </li><li> Deixando o conjunto do cateter-seringa no lugar, permitir que as células para habitar na bexiga durante 50 min. </li><li> Delicadamente, retire o conjunto do cateter-seringa da uretra. Vire a concentração de isoflurano a zero e mover cada rato uma ou duas polegadas de distância da nosecone recuperar na almofada de aquecimento. </li><li> Quando um rato recuperou o seu reflexo de endireitamento, devolvê-lo à sua jaula. </li></ol> 2. Entrega Intravesical de Adenovírus (8 dias após a implantação de células) </p&gt; ATENÇÃO: Esta parte do protocolo usa o adenovírus, que é um agente infeccioso e deve ser tratado sob as diretrizes rigorosas BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/). Todos os procedimentos realizados com agentes infecciosos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Medical University of South Carolina. <ol><li> Oito dias após a implantação de camundongos com células MB49, verifique se há hematúria. Pegar animais individuais ao longo de um pedaço de papel branco absorvente e pressione suavemente sobre o abdome para apagar gotas de urina para o papel. A urina que é cor de rosa ao vermelho indica hematúria e é um sinal de que os tumores têm estabelecido. Taxa de absorção do tumor é pelo menos 80% e com uma excelente técnica pode ser tão elevada como 100%. </li><li> Descongelar estoque adenoviral sobre gelo e dilui-se para 10 9 PFU/50 ul (2 x 10 10 UFP / ml) em estéril, PBS temperatura ambiente. </li><li> Anestesiar ratos, tal como descrito nos passos acima 1,3-1,6. </li><li> Cateterizar ratinhos, tal como descrito nas etapas 1.8 e remover a urina como no passo 1.9 </li><li> Depois de urina é retirada, imediatamente pipeta 50 ul de suspensão de vírus, para dentro do cubo de cateter. Anexar a 1 ml da seringa cheia de ar para o centro do cateter e entregar o vírus de bexiga, pressionando o êmbolo devagar 0,1-0,2 ml. </li><li> Deixando o conjunto do cateter-seringa no lugar, permitir que o vírus para habitar na bexiga durante 40 min. </li><li> Delicadamente, retire o conjunto do cateter-seringa da uretra, e descartar a solução de água sanitária a 10% para inativar os vírus restante. </li><li> Vire a concentração de isoflurano a zero e mover cada rato uma ou duas polegadas de distância da nosecone recuperar na almofada de aquecimento. </li><li> Quando um rato recuperou o seu reflexo de endireitamento, devolvê-lo à sua jaula. </li><li> Marcar gaiolas para indicar que os ratos têm sido incutido com adenovírus. Vírus será derramado na cama gaiola por vários dias e todas as gaiolas e roupas de cama devem sermanuseados e desinfectados adequadamente. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A metodologia principal descrito neste protocolo é o cateterismo de bexigas de rato, que tem amplas aplicações para a instilação de células ou qualquer agente destinado para entrega local para o epitélio da bexiga. O protocolo específico descrito acima foi otimizado para estudos de curto prazo (~ 10 dias). Implantar o número exato de células é fundamental, uma vez que um número de células maior resultará em crescimento do tumor e, possivelmente, mais rápida perda de animais devido a grande carga tumoral. Usando 200.000 ...

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos e 15.000 mortes esperadas em 2012 1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida requerem acompanhamento, o que faz com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. Cancro da bexiga que invadiu a camada muscular podem metastizar para o fígado, o pulmão ou o osso através do sistema linfático. Terapia Multimodal de tumores avançados resultados em apenas 20-40% de sobrevida após 5 anos. Portanto, as estratégias de tratamento eficazes destinadas a reduzir a recorrência ea progressão do câncer superficial da bexiga, bem como melhorar os resultados terapêuticos em pacientes com doença avançada são urgentemente necessários. Desenvolvimento de novas terapias requer modelos pré-clínicos para avaliar a eficácia após a avaliação inicial in vitro. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do câncer e capacidade de resposta, o que evidencia a necessidade de pré-clínicosal modelos em que os tumores surgem ou pode ser estabelecido no órgão de origem. Uma das abordagens é o desenvolvimento de modelos transgénicos em que os tumores surgem espontaneamente ou pode ser induzida de uma forma específica do órgão. Um excelente protocolo de um modelo de câncer de bexiga transgênico foi recentemente publicado 2. A desvantagem de modelos transgénicos é que os tumores tendem a desenvolver-se lentamente e com menos uniformidade do que o desejado. Além disso, o custo de manutenção de uma colónia de reprodução tem de ser considerado. Uma alternativa aos modelos transgénicos é o implante ortotópico de células tumorais, o que tem a vantagem de prazos curtos para o estabelecimento do tumor em ratinhos disponíveis comercialmente. Enquanto algumas linhas celulares de cancro da bexiga humano pode ser cultivado ortotopicamente (temos utilizado com sucesso UM-UC-3), pode ser desejável estabelecer tumores em ratinhos imunocompetentes. Duas linhas celulares de cancro da bexiga murino, que crescem ortotopicamente são MBT-2 e MB49 3. Desde MBT-2 células estão contaminados com replicandotipo C retrovírus 4, escolhemos MB49 células para os nossos estudos. É importante notar que a MB49 células foram isoladas a partir de um rato macho e implantes ortotópicos são por razões anatómicas realizados em ratos fêmeas. Este tem a vantagem de facilitar a identificação das células implantadas por meio de marcadores do cromossomo Y, mas a incompatibilidade de gênero pode ser um inconveniente para os estudos imunológicos. O epitélio da bexiga é revestida por um (GAG) da camada de glicosaminoglicano, o qual funciona como uma barreira para a infecção por micro-organismos. Esta barreira também pode interferir com a implantação de células tumorais e de vários métodos têm sido desenvolvidos para superar esta dificuldade (Tabela 1). Eletrocautério tem sido amplamente utilizado como um meio físico para romper a camada de GAG 5-13 e um eletrocautério demonstrando protocolo foi recentemente publicado na Jove 14. No entanto, se uma unidade de electrocautério não estar disponível, meios químicos para destruir o GAG camada tais como nitrato de prata, ou poli-L-lisina também pode ser utilizada 15-24. Os tumores são estabelecidos de forma eficaz através de uma breve exposição da bexiga a um pequeno volume de nitrato de prata (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 seg) ou mais, o contacto com poli-L-lisina (100 ul de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabela 1). Aqui, descrevemos um método que utiliza a tripsina para facilitar a implantação de células MB49. Em uma tentativa de melhorar as abordagens terapêuticas para o câncer de bexiga, a terapia gênica tem atraído atenção significativa. De um ponto de vista clínico, o cancro da bexiga é um alvo ideal para terapia génica devido ao fácil acesso do órgão e a capacidade para distribuir localmente a carga útil. Os vetores virais que foram exploradas para a terapia genética câncer de bexiga incluem um vírus herpes simplex oncolítico 25, 26 retrovírus, vírus de canários 27, o vírus vaccinia, AAV, e adenovirus 28. Na segunda parte do nosso protocolo, que descrevem um método para a entrega viral que é virtualmente idêntico ao da instilação das células tumorais. De interesse no nosso laboratório é o desenvolvimento de novas abordagens para a entrega do gene, que avaliam através bioluminescência, utilizando um vector adenoviral que expressa um transgene da luciferase. No entanto, a metodologia de cateterização da bexiga pode ser utilizada para a entrega dos vários agentes e, portanto, tem ampla aplicabilidade.

<table><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Camundongos fêmeas de 6-8 semanas </td><td>Jackson Laboratories</td><td>Nome da cepa: C57BL/6J Número de estoque: 000664</td><td> </td></tr><tr><td> Tripsina* </td><td>MediaTech</td><td>MT25-053-CI</td><td> Obtido através de Fisher </td></tr><tr><td> DMEM* </td><td>MediaTech</td><td>MT10-017-CV</td><td> Obtido através de Fisher </td></tr><tr><td> FBS </td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td> InactivatedHeat-inactivated </td></tr><tr><td> T25 frascos* </td><td>Corning Costar</td><td>Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63</td><td> Obtido através de células Fisher </td></tr><tr><td> MB49 </td><td>N/A</td><td>N/A</td><td> Obtido do Dr. Boehle (ver referência11) </td></tr><tr><td> Puralube Vet Ointment* </td><td>Pharmaderm</td><td>Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869</td><td> Obtido através da Fisher </td></tr><tr><td> Creme depilatório: Veet </td><td>farmácia local</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Lubrificante: K-Y Jelly </td><td>farmácia local</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Cateteres* </td><td>Exel International</td><td>Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21</td><td> Obtido através de Fisher </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td>Terrell</td><td>NDC 66794-011-25</td><td> Obtido através de </td></tr><tr><td> seringas TB de ponta deslizante de 1 ml de ponta deslizante </td><td>Becton Dickinson</td><td>BD309659 Fisher:14-823-434</td><td> </td></tr><tr><td> D-Luciferina </td><td>Gold Biotechnologies</td><td>L-123-1</td><td> </td></tr><tr><td> Ad-CMV-Luc </td><td>VectorBiolabs</td><td>1000; Solicite amplificação em larga escala e purificação de CsCl para uso in vivo</td><td> Agente infeccioso que requer contenção BSL2 </td></tr><tr><td> Steady-Glo&nbsp; Sistema de ensaio de luciferase </td><td>Promega</td><td>E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) ou E2550 (10 x 100 ml)</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">*disponível através de vários fornecedores</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPAMENTO</td></tr><tr><td> Sistema de anestesia </td><td>Sistemas EZ, Euthanex Corporation</td><td>Sistema de anestesia: EZ7000 5 portas Dispositivo de reinalação de camundongo: EZ109</td><td> Obtido através da Fisher </td></tr><tr><td> Xenogen IVIS 200 </td><td>Caliper Life Sciences</td><td>http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm</td><td> </td></tr><tr><td> FLUOstar Optima </td><td>BMG Labtech</td><td>http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2</td><td> </td></tr></tbody></table>

um modelo de cancro da bexiga para ortotópico gene estudos de entrega

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital e novas abordagens terapêuticas que podem reduzir a recorrência ea progressão são necessários. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor e a resposta terapia. Por conseguinte, é muitas vezes desejável para crescer as células de tumor no órgão a partir do qual se originou. Este protocolo descreve um modelo ortotópico de cancro de bexiga, em que as células de carcinoma de bexiga de murino MB49 são instilada na bexiga através do cateterismo. Implantação de células de tumor bem sucedida, neste modelo requer a interrupção da camada de glicosaminoglicano de protecção, que pode ser realizada por meios físicos ou químicos. No nosso protocolo da bexiga é tratada com tripsina antes da instilação de células. Cateterização da bexiga podem também ser usados ​​para entregar agentes terapêuticos uma vez que os tumores estão estabelecidos. Este protocolo descreve o fornecimento de uma construção adenoviral que expressa um gene repórter da luciferase. Enquanto our protocolo foi otimizado para estudos de curto prazo e se concentra na entrega gene, a metodologia de rato cateterismo vesical tem amplas aplicações.

Hematúria é observado em quase todos os ratos num período de 8 dias após a implantação de 200.000 células MB49. Como mostrado na Figura 1, o peso da bexiga mais do que duplica de 34,7 ± 3,3 mg (gama 31-37 mg, n = 4) não tumorais em ratinhos portadores de 87,5 ± 19,2 mg (gama de 77-120 mg, n = 10) em ratinhos que foram implantados com células MB49. Em termos de entrega de genes, descobrimos que imagiologia ratinhos 24 horas após a instilação viral produz um sinal mais forte do que depois de 48 horas <str...

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir de forma consistente e rápida tumores na bexiga de camundongos, os quais podem então ser utilizados para testar terapias contra o câncer de bexiga. Isso é realizado primeiramente por meio da instilação de células cancerígenas na bexiga de camundongos utilizando cateterização. Oito dias depois, repete-se a cateterização para instilar um adenovírus que expressa um gene repórter de luciferase.Então, 24 horas depois, a expressão gênica viral é medida utilizando um ensaio de luciferase. São obtidos resultados que mostram as condições nas quais pode ser alcançada a expressão gênica ótima. A demonstração visual desta técnica é fundamental porque os passos de cateterização e instilação são difíceis de aprender e porque existe o risco de danificar a bexiga e/ou causar vazamento do material instilado.Dois dias antes de realizar a implantação celular em frascos T25, semeie um vezes 10 à sexta potência de células MB49 em DMEM de alta glicose suplementado com 10% de FBS no dia do procedimento. Prepare a tripsina para a instalação diluindo tripsina estéril 0,25% grau para cultura de tecidos em meio básico de DMEM. Coloque a solução em banho-maria a 37 graus Celsius para equilibrar, pré-aqueça uma manta térmica e posicione-a sob os cones nasais do sistema de anestesia que será usado para administrar isoflurano.Coloque uma gaze limpa e absorvente sobre o aquecedor após anestesiar os camundongos com 3% de isoflurano. Realize um aperto no dedo do pé para verificar o nível de sedação. Posicione-os em posição supina sobre o aquecedor e fixe uma cone nasal com 2% de isoflurano.Use um gel lubrificante não irritante para lubrificar um novo cateter venoso pediátrico estéril de 20 4G. Em seguida, remova e descarte a agulha segurando o conector do cateter. Use o polegar e o indicador da mão oposta para separar as patas traseiras do camundongo e expor o muco uretral.Insira suavemente o cateter na uretra em um ângulo de 45 graus, alterando o ângulo para um paralelo à bancada a fim de inseri-lo completamente após a inserção total. Levante o cateter suavemente, mantendo-o paralelo à bancada, e confirme visualmente que ele está posicionado na uretra e não na vagina, que se encontra abaixo. Repita o procedimento com os demais camundongos anestesiados.Em seguida, reduza a concentração de isofluorano a 1%. Afixe uma ponteira a uma pipeta P-200 e remova a urina da bexiga aplicando sucção à extremidade externa do cateter. Remova qualquer urina remanescente no conector do cateter, descarte a urina e mantenha o cateter no lugar. Pipete cuidadosamente 80 microlitros da solução de trips aquecida no conector do cateter, evitando bolhas de ar.Acople uma seringa de um CC cheia de ar ao conector do cateter e pressione lentamente o êmbolo. Use de 0,1 a 0,2 ccs para administrar a tripsina na bexiga. Mantenha a seringa e os conjuntos do cateter no lugar durante 15 minutos.Para preparar as células para implante, remova o meio das células MB 49 previamente semeadas e adicione 500 microlitros de tripsina a 0,25% ao frasco. Quando as células se desprendem, adicione cinco mililitros de DMEM completo para ressuspender as células, retire uma alíquota de 50 microlitros para contagem e centrifugue o restante a 1000 RPM durante cinco minutos enquanto as células estão em rotação.Utilize um citômetro de hemácias para contar as células e calcular o número de células por mililitro, bem como o volume de meio necessário para levar o pellet celular a quatro vezes 10 à sexta células por litro. Remova o sobrenadante das células centrifugadas e ressuspenda. Suspenda o pellet em meio basal DMEM.Mantenha as células em temperatura ambiente. Após o tratamento com tripsina por 15 minutos, desprenda a seringa do cateter, deixando o cateter no lugar. Use uma pipeta P200 para remover, por sucção, qualquer tripsina remanescente da bexiga e descarte imediatamente. Pipete 50 microlitros de suspensão de células MB49 na extremidade do cateter.Em seguida, conecte a seringa de 1 cc cheia de ar ao hub do cateter e administre as células na bexiga ao pressionar lentamente o êmbolo. 0,1 a 0,2 cc. Mantendo o conjunto de cateter e seringa no lugar.Deixe as células permanecerem na bexiga por 50 minutos. Em seguida, retire cuidadosamente o conjunto cateter-seringa da uretra. Reduza o isoflurano para 0% e permita que os camundongos se recuperem da anestesia sobre a placa aquecida.Quando um camundongo recuperar seu reflexo de escrita, devolva-o à sua gaiola. Cuidado: este protocolo utiliza adenovírus, que é um agente infeccioso e deve ser manipulado sob rigorosas diretrizes de BSL 2. Todos os procedimentos realizados com agentes infecciosos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade Médica da Carolina do Sul.Oito dias após o implante de células MB 49 em camundongos, verificou-se a presença de hematúria colocando cada animal sobre uma folha de papel absorvente branca e pressionando suavemente o abdômen para coletar gotas de urina no papel. A urina que apresenta coloração rosa a vermelha indica hematúria e é um sinal de que os tumores se estabeleceram. Deixe o estoque adenoviral descongelar sobre gelo e utilize PBS estéril à temperatura ambiente para diluí-lo a 10^9 pfu por 50 microlitros. Após anestesiar e cateterizar os camundongos e remover a urina conforme descrito anteriormente neste vídeo, pipete imediatamente 50 microlitros da suspensão viral na extremidade do cateter, conecte uma seringa contendo ar e pressione o êmbolo para administrar o vírus na bexiga. Mantenha o conjunto cateter-seringa no lugar para permitir que o vírus permaneça na bexiga por 40 minutos.Em seguida, retire cuidadosamente o conjunto cateter-seringa da uretra e descarte em solução de 10% de hipoclorito para inativar qualquer vírus remanescente. Permita que o camundongo se recupere da anestesia antes de devolvê-lo à sua gaiola; marque as gaiolas para indicar que os camundongos foram instilados com adenovírus, pois o vírus será eliminado na cama da gaiola por vários dias e todas as gaiolas com cama devem ser manuseadas e desinfetadas adequadamente. Hematúria é observada em quase todos os camundongos dentro de oito dias após a implantação de 200.000 células MB 49, conforme mostrado aqui.O peso da bexiga mais que duplica, passando de 34,7 ± 3,3 miligramas em camundongos sem tumor para 87,5 ± 19,2 miligramas em camundongos implantados com células MB 49. Em termos de entrega gênica, a imagem dos camundongos 24 horas após a instalação viral produz um sinal mais forte do que após 48 horas. A entrega por adenovírus é altamente variável entre os animais, o que deve ser levado em consideração ao planejar o tamanho do grupo para fins estatísticos.Se um sistema de imagem para pequenos animais não estiver disponível, uma abordagem alternativa para medir a expressão do transgene de luciferase é remover e homogeneizar a bexiga para análise in vitro, conforme demonstrado aqui. A comparação entre a análise in vivo utilizando o sistema para pequenos animais IVIS 200 e a análise in vitro utilizando o kit de luminiscência contínua indica excelente correlação entre os conjuntos de dados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cateterizar a bexiga de um camundongo e instilar células tumorais ou agentes terapêuticos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Tumores de bexiga são estabelecidos em camundongos fêmeas, de uma forma minimamente invasiva através de cateterismo, cauterização local, ea adesão posterior de células de carcinoma aos locais queimar.

Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

Estabelecer um modelo de tumor de bexiga ortotópico para avaliar os efeitos antitumorais de sarna intravesical entregue e acompanhamento do crescimento tumoral por ultra-som e de imagem de bioluminescência.

Um modelo de tumor de bexiga ortotópico e Avaliação de Tratamento de sarna intravesical

Neste vídeo, descrevemos o transplante ortotópico de organoides tumorais de bexiga cultivados para a bexiga murina para estudar o papel do ambiente do órgão no desenvolvimento de tumores.

Modelo de Organoide de Tumor de Bexiga: Um Método para Transplante Ortotópico de Organoides de Bexiga para Bexiga Murina Receptora

Neste vídeo, descrevemos o procedimento intravesical de entrega de células cancerígenas na bexiga de um modelo de camundongo. Esse procedimento ajuda a gerar um modelo de tumor ortotópico de bexiga que pode ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas.

Modelagem de tumor ortotópico de bexiga em modelo de camundongo: um procedimento para administração intravesical de células cancerígenas na bexiga murina

A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Este protocolo fornece medidas experimentais detalhadas para estabelecer uma cultura in vitro tridimensional de organoides tumorais da bexiga derivados do câncer de bexiga induzido pelo cancerígeno. Métodos culturais, incluindo passaging, engenharia genética e transplante ortotópico de organoides tumorais são descritos.

Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

Este protocolo descreve o processo de geração e caracterização de organoides uroteliais de camundongos que abrigam exclusões em genes de interesse. Os métodos incluem a colheita de células uroteliais de camundongos, transdução ex vivo com expressão de Adenovírus conduzindo Cre com um promotor de CMV, e caracterização in vitro , bem como caracterização in vivo .

Ex Vivo Modelo organoide de deleções genéticas mediadas por Adenovírus-Cre em células uroteliais de camundongos

Aprenda a implantar células MB49 em bexigas de camundongos para criar um modelo ortotópico de carcinoma vesical. Este método permite avaliar terapias gênicas usando vetores adenovirais e ensaios de luciferase.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

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