Eletroporação Zona Neonatal subventricular

O objetivo deste procedimento é marcar e manipular geneticamente os constituintes moleculares das células-tronco neurais da zona subventricular. Isso é feito inserindo primeiro uma pipeta de vidro carregada com DNA no ventrículo lateral de um P zero P. O segundo passo é expelir o DNA para o líquido cefalorraquidiano do ventrículo lateral. A próxima corrente é aplicada ao P. Isso permite a transferência de DNA para células-tronco neurais que revestem os ventrículos laterais.

Em última análise, uma combinação de técnicas moleculares, incluindo imuno-histoquímica, biologia molecular, microscopia e eletrofisiologia, é usada para visualizar mudanças no destino, proliferação, migração e maturação de células-tronco neurológicas da zona subventricular. A eletroporação da zona subventricular neonatal pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese, como quais vias moleculares são responsáveis por regular a proliferação, diferenciação, migração e maturação de células-tronco neuronais e sua progênie. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como camundongos transgênicos, é que ela permite a marcação rápida e robusta de células-tronco de neurônios da SVZ de maneira eficiente e econômica.

Primeiro, certifique-se de que o DNA para eletropurificado seja de alta pureza e concentração e livre de endotoxinas. Puxe tubos capilares de vidro de sílica BO polidos a fogo de 10 centímetros em pipetas. Um extrator de pipeta PP oito 30 ghhi PC 10 definido para puxar uma tração ponderada de uma etapa a 70.5 graus Celsius é usado aqui Depois de puxar a pipeta, use uma pinça circular para quebrar a ponta.

Em seguida, inspecione a pipeta sob um microscópio de dissecação para garantir que não haja bordas irregulares. Se necessário, a ponta pode ser chanfrada usando uma pedra de amolar. Em seguida, coloque as pipetas derramadas sob uma lâmpada UV por 15 minutos.

Decorridos os 15 minutos, marque a pipeta a dois milímetros da borda da ponta com um marcador de ponta fina. Finalmente, prepare uma solução verde rápida de 0,1 peso por volume misturando solução salina estéril filtrada a 0,9% com anestesia verde seca e rápida. Um filhote de zero a um dia de idade, uma placa de Petri de vidro pré-resfriada a quatro graus Celsius e colocada no gelo oeste Após aproximadamente cinco minutos, determine o estado de anestesia utilizando a resposta de beliscamento do pé.

Se não ocorrer movimento, inicie a injeção intraventricular. Combine a solução verde rápida com a solução de DNA e alíquota de um a dois microlitros no biofilme. É importante que isso seja feito imediatamente antes da injeção, pois a combinação de solução verde rápida com DNA pode resultar em rápida evaporação e cristalização com o subsequente bloqueio de pipetas de vidro, aspirar todo o volume da alíquota com uma seringa de microfilme e carregar a pipeta de vidro em um injetor pressurizado a ar.

Agora, segure e segure suavemente a cabeça do filhote entre o polegar e o indicador da última mão dominante. Em seguida, acenda a lâmpada e segure a cabeça do filhote do lado de fora do feixe de luz. Se os ventrículos não estiverem claramente visíveis, umedeça a cabeça com solução salina estéril para ajudar a reduzir a quantidade de luz refletida pelo couro cabeludo.

Em seguida, usando a mão dominante, insira a agulha no ventrículo lateral do lado próximo. O local da injeção deve ser aproximadamente equidistante da sutura OID e do olho, e dois milímetros laterais à sutura sagital. Insira a pipeta puxada até a marca de dois milímetros para um pop P zero, que deve garantir a penetração no ventrículo lateral.

O enchimento do LCR na pipeta pode ocorrer devido à liberação de pressão intracraniana. Se isso acontecer, afrouxe o aperto na cabeça do POP para reduzir a pressão e auxiliar na injeção do plasmídeo. Uma vez que a pipeta esteja inserida de maneira ideal, injete aproximadamente 0,5 microlitros de plasmídeo no ventrículo lateral.

Defina a tensão do gerador de operação elétrica para cinco pulsos quadrados, 50 milissegundos por pulso e 100 volts com intervalos de 50 milissegundos. A especificidade espacial da operação do eletro plasma é dada pela direção da transferência de carga, portanto, deve-se considerar a localização dos eletrodos, dada a diversidade das células da SVZ. As pessoas relataram mudanças em termos de destino celular e proliferação nas localizações dorsal ventral a CAU.

Após a injeção do mergulho do plasmídeo, a pinça eletrodos em PBS para maximizar a transferência de carga e ajudar a prevenir queimaduras causadas pela resistividade. Em seguida, coloque o eletrodo positivo na parede lateral dorsal do crânio perto da orelha e mergulhe a lateral à injeção de citoplasma. Em seguida, coloque o eletrodo negativo no hemisfério contralateral ventral lateral ao focinho pop.

Esta figura mostra a orientação correta dos eletrodos negativo e positivo em relação aos eixos x, y, Z no filhote injetado. Inicie a transferência de corrente pressionando o pedal do pedal de pulso e varra os eletrodos de dorsal para lateral usando intervalos de ângulo de cerca de 25 graus. Quando a eletroporação estiver concluída, coloque todos os filhotes eletroporados em uma almofada de aquecimento por cinco minutos.

Gire suavemente os filhotes a cada 30 segundos com estimulação leve. Esta imagem mostra o ventrículo lateral de um camundongo neonatal 24 horas após a eletroporação de um vetor codificador de EGFP. As células eletro classificadas fluorescem em verde.

Aqui vemos o ventrículo lateral marcado com LV 28 dias após a eletroporação de Cree Recombinase e GFP codificando plasmídeos em camundongos carregando um código de parada a montante da recombinação de tomate TD induz a expressão de tomate TD visto em vermelho, diluição sucessiva de plasmídeo resultando em poucas células SVZ positivas para EGFP restantes ou tomate TD expresso genomicamente é permanentemente expresso. A diluição do plasmídeo, DNA mostrado em verde é aparente, uma vez que mais células na camada de células granulares do bulbo olfatório rotulado OB, expressaram o marcador genômico TD tomate mostrado em vermelho. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular e manipular células-tronco da SVZ.