Name: Eletroporação Zona Neonatal subventricular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação da zona subventricular neonatal para manipulação genética de células-tronco neurais em roedores. Este método permite o marcamento rápido e eficiente para estudos de neurogênese.

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Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (prêmio de desenvolvimento Idéia, W81XWH-10-1-0041, AB), CT de células-tronco de subvenção (AB), e um Instituto Nacional de Saúde NRSA 10668225 (DMF). O presente material é baseado no trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou Inovações CT, Inc. A financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, a coleta de dados e análise, a decisão de publicar, ou a preparação do manuscrito.

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais. 1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro <ol><li> Gerar alta pureza (OD 260/280&gt; 1,80) elevada concentração (ug / uL&gt; 2,5) endotoxinas sem DNA. </li><li> Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22. </li><li> Colocar 10 centímetros de fogo polidas tubos capilares de vidro de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) em um modelo de PP-830 PC-10 Narishige pipeta de vidro com um puxador de fio de Kanthal. Definir puxador para puxar uma etapa uma ponderada em 70,5 ° C. Quebrar dicas com fórceps circulares e inspecionar sob um microscópio de dissecação para as bordas recortadas. Dicas de bisel e coloque sob uma lâmpada UV por 15 min. Pipetas puxados deve ser marcado menos 2 mm a partir da borda da ponta. </li><li> Prepare 0,1% em peso / volume rápido verde solutipela mistura estéril filtrada solução salina 0,9% com o verde de secagem rápida. </li></ol> 2. Seção 2. Preparação Animal, vidro Pipeta Carregando e Injeção plasmídeo <ol><li> Remover dia pós-natal 0-1 filhotes individualmente a partir de gaiolas, lugar para uma placa de Petri de vidro pré-refrigerada a 4 ° C, e depois colocar em gelo húmido. </li><li> Após aproximadamente 5 minutos, determinar o estado de anestesia, utilizando a resposta pitada pé. Se nenhum movimento ocorre, filhotes sujeitos à injeção intraventricular. </li><li> É importante notar que a combinação de verde rápido, DNA, e solução salina podem resultar na rápida evaporação, cristalização, e o bloqueio de pipetas de vidro. Por isso, gerar uma solução estoque e ul alíquota 1-2 para parafilme imediatamente antes da injecção. </li><li> Aspirar todo o volume alíquota com a pipeta de vidro puxado. </li><li> Segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante. </li><li> Ligue uma lâmpadad segurar a cabeça do filhote de cachorro do lado de fora do feixe de luz. Se necessário, colocar sobre a cabeça de salina para reduzir a quantidade de luz reflectida por pup. Os ventrículos agora deve ser iluminado. </li><li> Com sua mão dominante, inserir a agulha no ventrículo lateral mais próxima de você (Figura 1A e 1B). O local de injecção deve ser de aproximadamente equidistante da sutura lambdóide e olho e 2 mm lateral da sutura sagital. Insira pipeta puxado para a marca de 2 mm para uma pup P0, que deve assegurar a penetração no interior do ventrículo lateral. Coincidentemente, você pode ver de volta o preenchimento do QCA na pipeta da liberação da pressão intracraniana. Para reduzir a pressão intracraniana, o que ajuda a injeção do plasmídeo, afrouxar seu aperto na cabeça do pup.Step 2.8. Injectar cerca de 0,5 ul de plasmídeo no ventrículo lateral, usando um injector de ar sob pressão (Picospritzer, Parker). </li></ol> 3. Seção 3. Eletroporação e Recuperação <ol><li> Set a tensão do gerador de electroporação para 5 impulsos quadrados, 50 ms / pulso de 100 volts, com intervalos de 950 mseg. A especificidade espacial de electroporação plasmídeo é ditada pela direccionalidade de transferência de carga. Uma atenção especial é dada à colocação dada a heterogeneidade da população de células-tronco ao longo da SVZ 8. Diferenças nas taxas de proliferação e destino da célula foram identificados para locais ventral-dorsal e rostral-caudal 9,10. </li><li> Uma vez que o plasmídeo é injectado, dip eléctrodos pinça em PBS. Este passo é o de maximizar a transferência de carga e para impedir queimaduras provocadas pela resistividade. </li><li> Coloque o eléctrodo positivo sobre a parede dorsal lateral do filhote perto da orelha ipsilateral para o local da injecção de plasmídeo (Figura 1C e 1D). Coloque o eletrodo negativo no hemisfério contralateral ventral lateral para o filhote do focinho. </li><li> Iniciar a transferência atual pressionando as foots pulsobruxa pedal e varrer os eletrodos dorsal para lateral usando ~ 25 ° de ângulo intervalos. </li><li> Lugar electroporado crias num bloco de aquecimento durante 5 min. Gire gentilmente filhotes a cada 30 seg com estimulação leve. </li></ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm a revelação a fazer.

Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sináptica. Além disso, pode-se evita...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tubulação Polido pesado borosilicato </td><td> Instrumento Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td></td></tr><tr><td> Dual-Stage Vidro Micropipeta Puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10H </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Fischer Scientific </td><td> 0521192205 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Praça da onda de pulso gerador </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0052 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrodes </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 45-0488 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra Óptica Fonte de Luz </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-562-36 </td><td></td></tr><tr><td> Halogênio de tungstêniolâmpada </td><td> USHIO America, Inc </td><td> 1002247 </td><td></td></tr><tr><td> Picospritzer II </td><td> Parker Instruments </td><td> 052-0312-900 </td><td></td></tr></tbody></table>

eletroporação zona neonatal subventricular

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais 1. Entender os caminhos moleculares responsáveis ​​pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro 2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados. Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento 3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal 5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.

Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo &quot;varrer&quot; do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial diferem daqueles re...

Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

O objetivo deste procedimento é marcar e manipular geneticamente os constituintes moleculares das células-tronco neurais da zona subventricular. Isso é feito inserindo primeiro uma pipeta de vidro carregada com DNA no ventrículo lateral de um P zero P. O segundo passo é expelir o DNA para o líquido cefalorraquidiano do ventrículo lateral. A próxima corrente é aplicada ao P. Isso permite a transferência de DNA para células-tronco neurais que revestem os ventrículos laterais.Em última análise, uma combinação de técnicas moleculares, incluindo imuno-histoquímica, biologia molecular, microscopia e eletrofisiologia, é usada para visualizar mudanças no destino, proliferação, migração e maturação de células-tronco neurológicas da zona subventricular. A eletroporação da zona subventricular neonatal pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese, como quais vias moleculares são responsáveis por regular a proliferação, diferenciação, migração e maturação de células-tronco neuronais e sua progênie. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como camundongos transgênicos, é que ela permite a marcação rápida e robusta de células-tronco de neurônios da SVZ

neonatal-subventricular-zone-electroporation

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Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de ratos E16

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica...

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Apresentado aqui é um protocolo para realizar manipulação genética no cérebro de furão embrionário usando na eletroporação uterónica. Este método permite o direcionamento de células progenitoras neurais no neocórtex in vivo.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Aprenda a técnica de eletroporação da zona subventricular neonatal para manipulação genética de células-tronco neurais em roedores. Este método permite o marcamento rápido e eficiente para estudos de neurogênese.

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

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